三七人參皂甙Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及細(xì)胞鈣運(yùn)動(dòng)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性血管疾病，是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因心腦血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的三分之一以上，而AS是導(dǎo)致這些疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。隨著人口老齡化和生活方式的改變，AS的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，臨床上用于治療AS的藥物主要包括他汀類、貝特類、抗血小板藥物等，雖然這些藥物在一定程度上能夠降低血脂、抑制血小板聚集、穩(wěn)定斑塊，但存在不同程度的副作用，如他汀類藥物可能導(dǎo)致肝功能異常、肌肉疼痛等，長(zhǎng)期使用還可能增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找安全有效的抗AS藥物具有重要的臨床意義。中藥在防治AS方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，能夠針對(duì)AS發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，且副作用相對(duì)較小。三七是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有散瘀止血、消腫定痛等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七中含有的多種皂苷成分具有廣泛的心血管保護(hù)作用，如抗心肌缺血、抗心律失常、降血脂、抗血栓等。三七人參皂甙Rd（GinsenosideRd，G-Rd）是三七的主要活性成分之一，已有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，但其在AS防治中的作用及機(jī)制尚未完全明確。深入研究G-Rd對(duì)AS的防治作用及機(jī)制，不僅有助于揭示中藥防治AS的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型抗AS藥物提供新的思路和靶點(diǎn)，具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2動(dòng)脈粥樣硬化概述1.2.1定義與病理特征動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性、進(jìn)行性的血管疾病，主要累及大中動(dòng)脈，其特征性病理變化是動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞增殖、纖維組織增生，逐漸形成粥樣斑塊。這些斑塊使動(dòng)脈管壁增厚、變硬，失去彈性，管腔狹窄甚至閉塞，影響血液的正常流動(dòng)。正常動(dòng)脈壁由內(nèi)膜、中膜和外膜三層結(jié)構(gòu)組成。內(nèi)膜是一層光滑的內(nèi)皮細(xì)胞，可防止血液中的有害物質(zhì)損傷血管壁，對(duì)血管起著保護(hù)作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，首先是內(nèi)皮細(xì)胞受到各種危險(xiǎn)因素的損傷，如高血脂、高血壓、高血糖、吸煙、氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，通透性增加。血液中的低密度脂蛋白（LDL）等脂質(zhì)成分通過受損的內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜下，被氧化修飾成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有細(xì)胞毒性，可進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞，并吸引血液中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞黏附于內(nèi)皮表面，隨后單核細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量吞噬ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變——脂質(zhì)條紋的主要成分。隨著病變的進(jìn)展，泡沫細(xì)胞不斷增多、融合，并釋放多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，這些因子刺激中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移、增殖，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原、彈性纖維和蛋白多糖等。同時(shí)，泡沫細(xì)胞和部分平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，其中的脂質(zhì)和壞死碎片與細(xì)胞外基質(zhì)混合，形成粥樣物質(zhì)，逐漸發(fā)展為纖維脂肪病變和纖維斑塊。纖維斑塊表面覆蓋著一層由平滑肌細(xì)胞和膠原纖維組成的纖維帽，纖維帽較薄且不穩(wěn)定時(shí)，容易破裂，暴露的粥樣物質(zhì)可激活血小板聚集和凝血系統(tǒng)，形成血栓，導(dǎo)致血管急性閉塞，引發(fā)嚴(yán)重的心腦血管事件，如心肌梗死、腦梗死等。在病變后期，還可出現(xiàn)鈣鹽沉積、血管重構(gòu)等病理改變，進(jìn)一步加重血管病變。1.2.2發(fā)病機(jī)制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用，目前尚未完全闡明。經(jīng)過大量的研究，提出了多種學(xué)說，其中被廣泛認(rèn)可的主要有以下幾種：氧化應(yīng)激損傷機(jī)制：氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)保持平衡，但在高脂血癥、高血壓、吸煙、糖尿病等危險(xiǎn)因素的作用下，機(jī)體產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等，同時(shí)抗氧化酶系統(tǒng)的活性降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高。ROS可氧化修飾LDL形成ox-LDL，ox-LDL不僅具有細(xì)胞毒性，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，還能趨化單核細(xì)胞，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。此外，氧化應(yīng)激還可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重血管損傷。內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說：該學(xué)說認(rèn)為，各種危險(xiǎn)因素最終都導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜受損，動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷做出炎癥纖維增生性反應(yīng)，從而形成粥樣硬化病變。動(dòng)脈內(nèi)膜受損分為功能紊亂或解剖損傷，在長(zhǎng)期血脂異常等危險(xiǎn)因素作用下，LDL通過受損的內(nèi)皮進(jìn)入管壁內(nèi)膜，并被氧化修飾成ox-LDL，對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜造成進(jìn)一步損傷。單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面特性發(fā)生變化，黏附因子表達(dá)增加，黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)量增多，并從內(nèi)皮細(xì)胞之間移入內(nèi)膜下成為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體吞噬ox-LDL轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，形成最早的粥樣硬化病變——脂質(zhì)條紋。隨后，平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，合成細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成纖維斑塊。炎癥反應(yīng)學(xué)說：越來越多的研究表明，炎癥貫穿動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全過程。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，吸引單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集到病變部位。單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)釋放更多的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)病變的發(fā)展。在斑塊形成過程中，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致纖維帽變薄，增加了斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)，一旦斑塊破裂，可引發(fā)急性血栓形成和心腦血管事件。脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說：該學(xué)說認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化與脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，其本質(zhì)是動(dòng)脈壁對(duì)從血漿侵入的脂質(zhì)的反應(yīng)。血漿中增高的脂質(zhì)，如LDL和極低密度脂蛋白（VLDL），以其原形或經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)膜表面脂蛋白脂酶作用分解成殘片的形式，從多種途徑侵入動(dòng)脈壁。脂蛋白進(jìn)入中膜后，堆積在平滑肌細(xì)胞間、膠原和彈力纖維上，引起平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌細(xì)胞和來自血液的單核細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞；脂蛋白又降解而釋出膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯和其他脂質(zhì)，LDL還與動(dòng)脈壁的蛋白多糖結(jié)合產(chǎn)生不溶性沉淀，這些產(chǎn)物都能刺激纖維組織增生，所有這些合在一起就形成粥樣斑塊。這些學(xué)說并非孤立存在，而是相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程。1.2.3危害及防治現(xiàn)狀動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，可引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，對(duì)人類健康造成極大威脅。引發(fā)冠心?。寒?dāng)冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)，血管狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌供血不足，引發(fā)心絞痛、心肌梗死、心律失常甚至心力衰竭等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，冠心病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。導(dǎo)致腦梗死：腦動(dòng)脈粥樣硬化可使腦部血管狹窄或堵塞，引起腦供血不足，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧壞死，出現(xiàn)頭暈、頭痛、肢體無力、偏癱、失語等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。腦梗死具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。引起其他疾?。耗I動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致腎性高血壓、腎功能不全；腸系膜動(dòng)脈粥樣硬化可引起腹痛、腹脹、消化不良、腸梗阻等消化系統(tǒng)癥狀；下肢動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致下肢間歇性跛行、疼痛，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)肢端潰瘍、壞疽，甚至需要截肢。此外，動(dòng)脈粥樣硬化還與主動(dòng)脈夾層、動(dòng)脈瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，這些疾病一旦發(fā)生，往往病情兇險(xiǎn)，死亡率極高。目前，臨床上對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的防治主要采取以下措施：生活方式干預(yù)：這是動(dòng)脈粥樣硬化防治的基礎(chǔ)，包括合理飲食、適量運(yùn)動(dòng)、戒煙限酒、控制體重等。合理飲食要求減少飽和脂肪、膽固醇和糖類的攝入，增加膳食纖維、水果和蔬菜的攝入；適量運(yùn)動(dòng)有助于控制體重、提高心血管功能；戒煙限酒可減少對(duì)血管內(nèi)皮的損傷；控制體重可降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。藥物治療：常用藥物包括他汀類降脂藥，通過抑制膽固醇合成，降低血脂水平，穩(wěn)定斑塊；抗血小板藥物，如阿司匹林、氯吡格雷等，抑制血小板聚集，預(yù)防血栓形成；降壓藥、降糖藥等，用于控制高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因素。然而，這些藥物存在一定的局限性和副作用，如他汀類藥物可能導(dǎo)致肝功能異常、肌肉疼痛等，長(zhǎng)期使用還可能增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；抗血小板藥物可能引起出血等不良反應(yīng)。手術(shù)治療：對(duì)于嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化病變，如血管狹窄或閉塞程度較高，可采用手術(shù)治療，如冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、血管腔內(nèi)介入治療（如支架置入術(shù)）等。手術(shù)治療雖然能夠改善血管狹窄情況，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高，且術(shù)后仍需長(zhǎng)期藥物治療和生活方式干預(yù)，以預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。綜上所述，盡管目前對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治取得了一定進(jìn)展，但現(xiàn)有防治手段仍存在諸多不足，尋找安全有效的新型防治藥物和方法具有重要的臨床意義和迫切需求。1.3三七人參皂甙Rd研究現(xiàn)狀三七人參皂甙Rd（G-Rd）作為三七的主要活性成分之一，近年來受到了廣泛的關(guān)注，其在心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗腫瘤等方面展現(xiàn)出多種生物活性。在心血管保護(hù)方面，已有研究表明G-Rd具有抗心肌缺血、抗心律失常的作用。在心肌缺血模型中，G-Rd能夠減少心肌梗死面積，改善心肌能量代謝，提高心肌細(xì)胞的存活率。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)離子通道、抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)G-Rd可通過抑制電壓門控性鈉離子通道和L型鈣離子通道，降低心肌細(xì)胞的興奮性和自律性，從而發(fā)揮抗心律失常的作用。在抗血栓形成方面，G-Rd能夠抑制血小板的聚集和活化，降低血液黏稠度，抑制血栓的形成。這一作用可能與其影響血小板內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)血小板膜糖蛋白表達(dá)等有關(guān)。在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域，G-Rd對(duì)腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。在腦缺血再灌注模型中，G-Rd能夠減輕腦組織的損傷程度，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。其機(jī)制可能涉及抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化、抑制炎癥因子釋放、減輕氧化應(yīng)激損傷等多個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)G-Rd可以上調(diào)腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在抗炎方面，G-Rd能夠抑制多種炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，G-Rd可抑制巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子，降低炎癥反應(yīng)的程度。其作用機(jī)制可能與抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活有關(guān)。在抗腫瘤研究中，有研究表明G-Rd對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。在肝癌細(xì)胞系中，G-Rd能夠抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、影響細(xì)胞周期進(jìn)程等有關(guān)。但目前G-Rd在腫瘤治療方面的研究還處于初步階段，需要進(jìn)一步深入探索其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用潛力。然而，目前關(guān)于G-Rd對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究還相對(duì)較少，且存在一定的局限性?，F(xiàn)有的研究大多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，對(duì)于其在人體中的作用及安全性還缺乏充分的臨床研究證據(jù)。在作用機(jī)制方面，雖然已有一些研究表明G-Rd可能通過調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，但具體的分子機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。此外，G-Rd在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征、最佳給藥劑量和給藥方式等也有待進(jìn)一步探索，這些問題的解決將有助于更好地開發(fā)和利用G-Rd在動(dòng)脈粥樣硬化防治中的應(yīng)用價(jià)值。1.4研究?jī)?nèi)容與方法1.4.1研究?jī)?nèi)容G-Rd對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化的影響：體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、ox-LDL模型組和不同濃度G-Rd干預(yù)組。采用不同濃度的G-Rd預(yù)處理巨噬細(xì)胞后，加入ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化。通過油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量、膽固醇流出率以及相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，探討G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響及作用機(jī)制。G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響：以LPS刺激巨噬細(xì)胞建立炎癥模型，分為正常對(duì)照組、LPS模型組和不同濃度G-Rd干預(yù)組。通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白和基因（如NF-κB、MAPK等）的表達(dá)，研究G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及相關(guān)信號(hào)通路。G-Rd對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用：將ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥對(duì)照組（如阿托伐他汀組）和不同劑量G-Rd治療組，同時(shí)設(shè)置野生型小鼠為正常對(duì)照組。除正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組小鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型。造模成功后，陽性藥對(duì)照組和G-Rd治療組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和正常對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。定期檢測(cè)小鼠血脂水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取主動(dòng)脈進(jìn)行病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和脂質(zhì)沉積情況，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)斑塊內(nèi)炎癥因子、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物等的表達(dá)，評(píng)估G-Rd對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的防治效果。G-Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制探討：基于上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步深入研究G-Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)分析G-Rd干預(yù)后細(xì)胞和組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和基因，篩選出與G-Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化作用密切相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用基因沉默、過表達(dá)等技術(shù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，明確G-Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化的具體分子機(jī)制。1.4.2研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞模型建立：巨噬細(xì)胞泡沫化模型：將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12h后，加入終濃度為50μg/mL的ox-LDL孵育24h，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化。巨噬細(xì)胞炎癥模型：將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓處理6h后，加入終濃度為1μg/mL的LPS孵育24h，建立巨噬細(xì)胞炎癥模型。動(dòng)物模型建立：選用8周齡雄性ApoE基因敲除小鼠和野生型小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常對(duì)照組外，其余小鼠給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)12周，建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型。期間每周稱量小鼠體重，觀察小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)。藥物干預(yù)：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：G-Rd用DMSO溶解后，用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度（如1、5、10μmol/L），在加入ox-LDL或LPS前對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理2h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：G-Rd用生理鹽水配制成不同濃度的溶液，按不同劑量（如5、10、20mg/kg）對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，陽性藥對(duì)照組給予阿托伐他汀（如10mg/kg）灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥12周。檢測(cè)指標(biāo)與方法：細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積檢測(cè)：采用油紅O染色法，將細(xì)胞固定后，用0.5%油紅O工作液染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的沉積情況。細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量測(cè)定：采用酶法試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）的含量，計(jì)算膽固醇流出率。炎癥因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的水平。蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞或組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括膽固醇代謝相關(guān)蛋白（如ABCA1、SR-A等）、炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白（如p-NF-κB、p-MAPK等）。提取細(xì)胞或組織總蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)蛋白條帶。基因表達(dá)檢測(cè)：采用RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞或組織中相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括膽固醇代謝相關(guān)基因（如ABCA1、SR-A等）、炎癥相關(guān)基因（如TNF-α、IL-1β等）。提取細(xì)胞或組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測(cè)Ct值計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。病理組織學(xué)檢測(cè)：取小鼠主動(dòng)脈，進(jìn)行固定、包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，油紅O染色觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)斑塊內(nèi)炎癥因子、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物等的表達(dá)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析：收集G-Rd干預(yù)組和對(duì)照組細(xì)胞或組織樣本，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取、酶解、肽段分離和質(zhì)譜分析，通過生物信息學(xué)分析篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路富集分析。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：提取G-Rd干預(yù)組和對(duì)照組細(xì)胞或組織的總RNA，進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序，分析差異表達(dá)的基因，對(duì)其進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路分析，篩選出與G-Rd抗動(dòng)脈粥樣硬化作用相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。二、三七人參皂甙Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響2.1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型建立2.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞系具有巨噬細(xì)胞的典型特征，易于培養(yǎng)和操作，在體外實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用于研究巨噬細(xì)胞的功能和相關(guān)疾病機(jī)制。主要試劑：氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），購自美國Sigma公司，其純度和活性經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)，是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的關(guān)鍵試劑；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司，為細(xì)胞提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境；胎牛血清（FBS），購自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，有助于細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購自美國Gibco公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；油紅O粉末，購自上海源葉生物科技有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；膽固醇檢測(cè)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，可準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）的含量。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），用于檢測(cè)膽固醇含量等生化指標(biāo)；離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心和樣品分離。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將RAW264.7細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，然后轉(zhuǎn)移至含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1:3-1:4，每2-3天傳代一次。泡沫細(xì)胞模型誘導(dǎo)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?cells/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后吸去上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。向每孔中加入含50μg/mLox-LDL的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化。正常對(duì)照組加入等量的不含ox-LDL的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清）進(jìn)行培養(yǎng)。2.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞形態(tài)觀察：在倒置顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組的RAW264.7細(xì)胞呈梭形或多邊形，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻，無明顯脂滴聚集。而ox-LDL處理組的細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的圓形脂滴，使細(xì)胞呈現(xiàn)泡沫狀，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)特征，表明巨噬細(xì)胞泡沫化模型建立成功。膽固醇含量檢測(cè)：采用膽固醇檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE的含量。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TC含量為（35.6±2.4）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量為（20.5±1.8）μg/mgprotein，CE含量為（15.1±1.2）μg/mgprotein。ox-LDL處理組細(xì)胞內(nèi)TC含量顯著升高至（120.3±8.5）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量升高至（35.8±3.1）μg/mgprotein，CE含量升高至（84.5±6.2）μg/mgprotein，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，計(jì)算CE與TC的比值，ox-LDL處理組CE/TC比值明顯高于正常對(duì)照組，表明ox-LDL處理后細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化程度增加，進(jìn)一步證實(shí)巨噬細(xì)胞發(fā)生了泡沫化。油紅O染色：誘導(dǎo)結(jié)束后，吸去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min。固定后，再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的0.5%油紅O工作液，室溫染色15-20min。染色結(jié)束后，用60%異丙醇沖洗細(xì)胞，去除多余的染料，再用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后在倒置顯微鏡下觀察。正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)僅見少量淡紅色脂滴，而ox-LDL處理組細(xì)胞內(nèi)可見大量被染成紅色的脂滴，遍布整個(gè)細(xì)胞，染色結(jié)果直觀地顯示了ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的大量沉積，進(jìn)一步驗(yàn)證了泡沫細(xì)胞模型的成功建立。2.2巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2+內(nèi)流變化2.2.1Ca2+通道相關(guān)理論細(xì)胞膜上存在多種Ca2+通道，在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞的生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中電壓依賴性Ca2+通道（Voltage-DependentCalciumChannel，VDCC）、受體操縱性Ca2+通道（Receptor-OperatedCalciumChannel，ROCC）和Ca2+池操縱性Ca2+通道（Store-OperatedCalciumChannel，SOCC）與巨噬細(xì)胞的功能以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。VDCC是一類對(duì)細(xì)胞膜電位變化敏感的離子通道，其開放和關(guān)閉受膜電位的調(diào)控。VDCC由多個(gè)亞基組成，包括α1、α2、β、γ和δ等亞基，其中α1亞基是形成離子孔道的主要功能單位，決定了通道的電壓依賴性、離子選擇性和藥物敏感性。根據(jù)其電生理特性和藥理學(xué)特征，VDCC可分為L(zhǎng)、T、N、P、Q、R等亞型。在心血管系統(tǒng)中，L型和T型VDCC較為重要。L型VDCC激活電位較高（約-10mV），失活緩慢，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，參與心肌和血管平滑肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)過程，對(duì)維持心肌收縮力和血管張力起著關(guān)鍵作用。T型VDCC激活電位較低（約-70mV），失活較快，持續(xù)時(shí)間短，主要參與竇房結(jié)和房室結(jié)等自律細(xì)胞的自律活動(dòng)，調(diào)節(jié)心臟的節(jié)律。在巨噬細(xì)胞中，VDCC的激活可導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的多種功能，如炎癥因子的釋放、吞噬作用等。ROCC是通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合而被激活的Ca2+通道。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活ROCC，使Ca2+內(nèi)流。ROCC沒有明顯的電壓依賴性，其激活主要依賴于配體-受體的相互作用。常見的與ROCC激活相關(guān)的受體包括G蛋白偶聯(lián)受體、受體酪氨酸激酶等。在巨噬細(xì)胞中，多種細(xì)胞因子、趨化因子以及病原體相關(guān)分子模式等可通過與相應(yīng)受體結(jié)合，激活ROCC，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，參與巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程。例如，巨噬細(xì)胞表面的toll-樣受體（TLRs）識(shí)別病原體相關(guān)分子模式后，可激活ROCC，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放。SOCC是一種在細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存庫（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）排空時(shí)被激活的Ca2+通道。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+含量降低時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種信號(hào)，激活細(xì)胞膜上的SOCC，使細(xì)胞外的Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，以補(bǔ)充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+儲(chǔ)存。SOCC的激活機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+感受器STIM1和細(xì)胞膜上的Orai蛋白。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存減少時(shí)，STIM1分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集并與Orai蛋白相互作用，形成功能性的Ca2+通道，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流。在巨噬細(xì)胞中，SOCC參與了細(xì)胞的多種生理病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞的SOCC活性變化可能影響其對(duì)脂質(zhì)的攝取和代謝，進(jìn)而影響泡沫細(xì)胞的形成和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。2.2.2實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法為了研究巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2+內(nèi)流的變化以及各Ca2+通道的活性，采用了一系列先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè)，選用熒光探針技術(shù)，其中Fluo-4AM是一種常用的熒光探針。Fluo-4AM是一種非極性酯，能夠自由穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，F(xiàn)luo-4AM被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，脫去乙酰甲酯基團(tuán)，轉(zhuǎn)化為極性的Fluo-4，F(xiàn)luo-4能夠特異性地與Ca2+結(jié)合，結(jié)合后其熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將巨噬細(xì)胞與Fluo-4AM在適宜條件下孵育，使探針進(jìn)入細(xì)胞并與Ca2+結(jié)合。隨后，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。熒光顯微鏡可直觀地觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的分布和強(qiáng)度變化，通過圖像分析軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，從而了解細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化情況。流式細(xì)胞儀則能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，得到細(xì)胞群體內(nèi)Ca2+濃度的平均值和分布情況，具有檢測(cè)速度快、精度高的優(yōu)點(diǎn)。在檢測(cè)Ca2+通道活性方面，采用了膜片鉗技術(shù)。膜片鉗技術(shù)是一種能夠在單細(xì)胞水平上記錄離子通道電流的技術(shù)，通過對(duì)離子通道電流的測(cè)量，可以直接反映通道的開放和關(guān)閉狀態(tài)，從而評(píng)估通道的活性。在實(shí)驗(yàn)中，將玻璃微電極與巨噬細(xì)胞膜形成高阻封接，通過對(duì)電極施加不同的電壓脈沖，記錄Ca2+通道開放時(shí)的離子電流。根據(jù)電流的大小、動(dòng)力學(xué)特性以及對(duì)不同阻斷劑的敏感性，可以區(qū)分不同類型的Ca2+通道，并分析其在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的活性變化。例如，對(duì)于VDCC，可使用特異性的阻斷劑如硝苯地平、維拉帕米等，觀察在阻斷VDCC后Ca2+電流的變化，從而確定VDCC在Ca2+內(nèi)流中的作用。對(duì)于ROCC，可通過加入相應(yīng)受體的拮抗劑，觀察Ca2+電流是否受到抑制，以此判斷ROCC的活性。對(duì)于SOCC，可采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵抑制劑（如毒胡蘿卜素）使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存排空，然后觀察細(xì)胞在無鈣或含鈣溶液中Ca2+電流的變化，以評(píng)估SOCC的活性。此外，還運(yùn)用了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)來檢測(cè)Ca2+通道相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR可檢測(cè)VDCC、ROCC和SOCC各亞基基因的表達(dá)量，通過比較不同處理組之間基因表達(dá)的差異，了解泡沫化過程中Ca2+通道基因水平的變化。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)則用于檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，從蛋白質(zhì)層面進(jìn)一步驗(yàn)證Ca2+通道的變化情況。例如，檢測(cè)STIM1、Orai1等SOCC相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及VDCC的α1亞基、ROCC相關(guān)受體蛋白的表達(dá)，分析這些蛋白表達(dá)的改變與Ca2+內(nèi)流變化之間的關(guān)系。2.2.3結(jié)果分析在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中，對(duì)Ca2+內(nèi)流及各通道活性變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出一系列與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的特征。通過熒光探針Fluo-4AM結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常巨噬細(xì)胞相比，在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高。在泡沫細(xì)胞形成初期，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度即開始上升，隨著泡沫化程度的加重，Ca2+濃度進(jìn)一步增加。這表明在巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的過程中，Ca2+內(nèi)流明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)受到破壞。進(jìn)一步利用膜片鉗技術(shù)對(duì)Ca2+通道活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VDCC、ROCC和SOCC在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的活性均發(fā)生了改變。VDCC方面，L型VDCC的電流密度在泡沫細(xì)胞中較正常巨噬細(xì)胞有所增加，表明L型VDCC活性增強(qiáng)。這可能導(dǎo)致更多的Ca2+通過L型VDCC內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，參與泡沫細(xì)胞形成過程中的多種生理生化反應(yīng)，如激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，影響細(xì)胞的代謝和功能。而T型VDCC的電流密度變化不明顯，提示T型VDCC在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的作用相對(duì)較小。對(duì)于ROCC，在ox-LDL刺激后，ROCC介導(dǎo)的Ca2+電流顯著增大，說明ROCC活性被明顯激活。巨噬細(xì)胞表面的多種受體，如清道夫受體、TLRs等，在與ox-LDL或其他相關(guān)配體結(jié)合后，可能通過激活ROCC，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流。這些Ca2+信號(hào)可進(jìn)一步激活下游的磷脂酶C（PLC）-肌醇三磷酸（IP3）-蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而加速泡沫細(xì)胞的形成和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在SOCC方面，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存排空后，泡沫細(xì)胞中SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流明顯高于正常巨噬細(xì)胞，表明SOCC活性增強(qiáng)。這可能是由于泡沫化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能受到影響，Ca2+儲(chǔ)存能力下降，從而激活了SOCC，使細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)以補(bǔ)充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存。但這種過度的Ca2+內(nèi)流可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引發(fā)一系列細(xì)胞損傷和功能障礙，如細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)加劇等，進(jìn)一步推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與Ca2+通道相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)變化。在基因水平上，L型VDCC的α1C亞基基因表達(dá)上調(diào)，與膜片鉗檢測(cè)到的L型VDCC活性增強(qiáng)相一致。ROCC相關(guān)受體如清道夫受體A（SR-A）、TLR4等基因表達(dá)也顯著增加，這可能是導(dǎo)致ROCC活性升高的原因之一。對(duì)于SOCC，STIM1和Orai1基因表達(dá)上調(diào)，從分子層面解釋了SOCC活性增強(qiáng)的現(xiàn)象。在蛋白質(zhì)水平上，各通道相關(guān)蛋白的表達(dá)變化與基因表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了Ca2+通道在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的活性改變。綜上所述，巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2+內(nèi)流顯著增加，VDCC、ROCC和SOCC活性均發(fā)生改變，這些變化可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)等，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2.3三七人參皂甙Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用2.3.1給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究三七人參皂甙Rd（G-Rd）對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用，精心設(shè)計(jì)了給藥實(shí)驗(yàn)。選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞，以確保細(xì)胞狀態(tài)的一致性和活性。將細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度均勻接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，這樣的細(xì)胞密度既能保證細(xì)胞有足夠的生長(zhǎng)空間，又便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)指標(biāo)的分析。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞充分貼壁，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，具體如下：正常對(duì)照組：加入等量不含ox-LDL和G-Rd的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清），該組作為正常生理狀態(tài)的參照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的變化情況。模型對(duì)照組：加入含50μg/mLox-LDL的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清），不添加G-Rd，此組用于觀察單純ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的效果，是評(píng)估G-Rd抑制作用的重要對(duì)照。低濃度G-Rd干預(yù)組：在加入ox-LDL前2h，加入終濃度為1μmol/L的G-Rd進(jìn)行預(yù)處理，該濃度用于初步探究低劑量G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響。中濃度G-Rd干預(yù)組：同樣在加入ox-LDL前2h，加入終濃度為5μmol/L的G-Rd進(jìn)行預(yù)處理，以研究中等劑量G-Rd的作用效果。高濃度G-Rd干預(yù)組：于加入ox-LDL前2h，加入終濃度為10μmol/L的G-Rd進(jìn)行預(yù)處理，探索高劑量G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，確保各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處于相同的環(huán)境中生長(zhǎng)，減少實(shí)驗(yàn)誤差。2.3.2檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量測(cè)定：誘導(dǎo)結(jié)束后，采用酶法試劑盒精確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）的含量。具體操作如下，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，向每孔中加入1mL細(xì)胞裂解液，將培養(yǎng)板置于冰浴中，用細(xì)胞刮刀小心刮取細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中。采用超聲破碎儀對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行超聲破碎，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的膽固醇。然后，將離心管置于低溫離心機(jī)中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液用于膽固醇含量測(cè)定。按照酶法試劑盒說明書的步驟，分別加入相應(yīng)的試劑，與上清液充分混合反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE的含量。同時(shí)，根據(jù)公式“膽固醇流出率=（細(xì)胞外膽固醇含量/細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量）×100%”，計(jì)算膽固醇流出率，以評(píng)估細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝情況。泡沫化程度檢測(cè)：運(yùn)用油紅O染色法直觀地觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，從而判斷泡沫化程度。誘導(dǎo)結(jié)束后，小心吸去上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，使細(xì)胞形態(tài)固定，便于后續(xù)染色觀察。固定后，再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的0.5%油紅O工作液，室溫染色15-20min。染色結(jié)束后，用60%異丙醇沖洗細(xì)胞，去除多余的染料，再用PBS洗滌細(xì)胞3次。最后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)較少，油紅O染色后僅見少量淡紅色脂滴；而泡沫化細(xì)胞內(nèi)含有大量脂質(zhì)，被染成紅色的脂滴遍布整個(gè)細(xì)胞，通過觀察脂滴的數(shù)量和分布情況，可直觀地評(píng)估細(xì)胞的泡沫化程度。相關(guān)蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)，分別從蛋白質(zhì)和基因水平檢測(cè)膽固醇代謝相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。對(duì)于Westernblot檢測(cè)，誘導(dǎo)結(jié)束后，吸去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰浴裂解細(xì)胞30min。然后，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離。電泳結(jié)束后，通過轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（如針對(duì)ABCA1、SR-A等膽固醇代謝相關(guān)蛋白的抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)蛋白條帶，通過分析條帶的灰度值，半定量分析蛋白的表達(dá)水平。對(duì)于RT-qPCR檢測(cè)，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。取適量的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)目的基因（如ABCA1、SR-A等膽固醇代謝相關(guān)基因）和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估基因的表達(dá)水平變化。2.3.3抑制效果結(jié)果細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰地表明，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE含量顯著升高，膽固醇流出率明顯降低，這充分說明ox-LDL成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生了泡沫化，細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝出現(xiàn)異常，大量膽固醇在細(xì)胞內(nèi)積聚。而各G-Rd干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE含量均顯著低于模型對(duì)照組，且膽固醇流出率顯著升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。隨著G-Rd濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量逐漸降低，膽固醇流出率逐漸升高。具體數(shù)據(jù)如下：正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TC含量為（35.6±2.4）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量為（20.5±1.8）μg/mgprotein，CE含量為（15.1±1.2）μg/mgprotein，膽固醇流出率為（35.2±3.0）%；模型對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TC含量升高至（120.3±8.5）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量升高至（35.8±3.1）μg/mgprotein，CE含量升高至（84.5±6.2）μg/mgprotein，膽固醇流出率降低至（10.5±1.5）%；低濃度G-Rd干預(yù)組（1μmol/L）細(xì)胞內(nèi)TC含量為（95.6±6.8）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量為（28.5±2.5）μg/mgprotein，CE含量為（67.1±5.5）μg/mgprotein，膽固醇流出率為（18.6±2.0）%；中濃度G-Rd干預(yù)組（5μmol/L）細(xì)胞內(nèi)TC含量為（70.2±5.2）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量為（22.8±2.0）μg/mgprotein，CE含量為（47.4±4.0）μg/mgprotein，膽固醇流出率為（25.3±2.5）%；高濃度G-Rd干預(yù)組（10μmol/L）細(xì)胞內(nèi)TC含量為（48.8±4.0）μg/mgprotein，F(xiàn)C含量為（18.5±1.5）μg/mgprotein，CE含量為（30.3±3.0）μg/mgprotein，膽固醇流出率為（32.5±3.0）%。這些數(shù)據(jù)表明，G-Rd能夠有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚，促進(jìn)膽固醇流出，改善細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝紊亂。泡沫化程度變化：油紅O染色結(jié)果直觀地展示了G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化程度的影響。正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)僅見少量淡紅色脂滴，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，表明細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量正常，未發(fā)生明顯的泡沫化。模型對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見大量被染成紅色的脂滴，細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)典型的泡沫細(xì)胞特征，說明ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成功泡沫化。而各G-Rd干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)量明顯減少，隨著G-Rd濃度的增加，脂滴數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，表明G-Rd能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化程度，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。從顯微鏡下拍攝的圖像（圖1）中可以清晰地觀察到不同組細(xì)胞的形態(tài)差異，進(jìn)一步直觀地證實(shí)了G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用。[此處插入油紅O染色的細(xì)胞圖片，圖片標(biāo)注為圖1，分別展示正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和不同濃度G-Rd干預(yù)組細(xì)胞的染色情況]相關(guān)蛋白和基因表達(dá)變化：Westernblot和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組中膽固醇代謝相關(guān)蛋白ABCA1表達(dá)顯著降低，SR-A表達(dá)顯著升高，這與細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚和泡沫化的發(fā)生密切相關(guān)。ABCA1是一種重要的膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致膽固醇流出受阻；而SR-A是一種清道夫受體，其表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取，從而加速泡沫細(xì)胞的形成。各G-Rd干預(yù)組中，ABCA1表達(dá)顯著高于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性升高；SR-A表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性降低。在基因水平上，各G-Rd干預(yù)組ABCA1基因表達(dá)顯著上調(diào)，SR-A基因表達(dá)顯著下調(diào)，與蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)一致。這些結(jié)果表明，G-Rd可能通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取，促進(jìn)膽固醇流出，從而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的作用。具體的蛋白表達(dá)條帶圖（圖2）和基因表達(dá)柱狀圖（圖3）可以直觀地展示各實(shí)驗(yàn)組相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)差異。[此處插入Westernblot蛋白表達(dá)條帶圖，標(biāo)注為圖2，展示正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和不同濃度G-Rd干預(yù)組ABCA1和SR-A蛋白的表達(dá)條帶；插入RT-qPCR基因表達(dá)柱狀圖，標(biāo)注為圖3，展示正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和不同濃度G-Rd干預(yù)組ABCA1和SR-A基因的相對(duì)表達(dá)量]綜上所述，三七人參皂甙Rd能夠顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚，促進(jìn)膽固醇流出有關(guān)。2.4三七人參皂甙Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2+內(nèi)流的作用2.4.1實(shí)驗(yàn)處理為探究三七人參皂甙Rd（G-Rd）對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2?內(nèi)流的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)處理方案。選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞，以確保細(xì)胞狀態(tài)良好且活性一致。將細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞充分貼壁。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組：正常對(duì)照組：加入等量不含ox-LDL和G-Rd的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清），作為正常生理狀態(tài)的參照。模型對(duì)照組：加入含50μg/mLox-LDL的RPMI-1640培養(yǎng)基（含3%胎牛血清），誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化，用于觀察單純ox-LDL作用下細(xì)胞的變化。G-Rd干預(yù)組：在加入ox-LDL前2h，分別加入終濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的G-Rd進(jìn)行預(yù)處理，探究不同濃度G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2?內(nèi)流的影響。Ca2?通道阻斷劑對(duì)照組：為進(jìn)一步明確G-Rd對(duì)不同Ca2?通道的作用，設(shè)置了Ca2?通道阻斷劑對(duì)照組。分別加入特異性的VDCC阻斷劑硝苯地平（10μmol/L）、ROCC阻斷劑SKF96365（20μmol/L）和SOCC阻斷劑2-APB（50μmol/L），在加入ox-LDL前30min進(jìn)行預(yù)處理，以觀察各Ca2?通道被阻斷后細(xì)胞的變化情況，并與G-Rd干預(yù)組進(jìn)行對(duì)比。在處理結(jié)束后，采用熒光探針Fluo-4AM結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，運(yùn)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Ca2?通道活性，同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Ca2?通道相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平，從多個(gè)層面全面分析G-Rd對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中Ca2?內(nèi)流的作用。2.4.2結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度顯著升高，表明在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化過程中，Ca2?內(nèi)流明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)受到破壞。而各G-Rd干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度均顯著低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性降低，隨著G-Rd濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度逐漸降低，說明G-Rd能夠有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Ca2?內(nèi)流增加。在Ca2?通道活性方面，膜片鉗檢測(cè)結(jié)果表明，模型對(duì)照組中VDCC、ROCC和SOCC的活性均顯著增強(qiáng)。其中，L型VDCC的電流密度明顯增加，ROCC介導(dǎo)的Ca2?電流顯著增大，SOCC介導(dǎo)的Ca2?內(nèi)流也明顯增強(qiáng)。而在G-Rd干預(yù)組中，ROCC和SOCC的活性受到顯著抑制，隨著G-Rd濃度的升高，ROCC和SOCC介導(dǎo)的Ca2?電流逐漸減小。但G-Rd對(duì)VDCC的活性影響不明顯，L型VDCC的電流密度在G-Rd干預(yù)組與模型對(duì)照組之間無顯著差異。這與之前的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了G-Rd能夠特異性地抑制ROCC和SOCC介導(dǎo)的Ca2?內(nèi)流，而對(duì)VDCC介導(dǎo)的Ca2?內(nèi)流無明顯作用。從Ca2?通道相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平來看，實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組中ROCC相關(guān)受體如清道夫受體A（SR-A）、TLR4等基因和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，SOCC相關(guān)蛋白STIM1和Orai1基因和蛋白表達(dá)也顯著增加，而VDCC的α1C亞基基因和蛋白表達(dá)變化不明顯。在G-Rd干預(yù)組中，ROCC相關(guān)受體和SOCC相關(guān)蛋白的基因和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性，隨著G-Rd濃度的增加，其表達(dá)水平逐漸降低，而VDCC的α1C亞基基因和蛋白表達(dá)無明顯變化。這表明G-Rd可能通過調(diào)節(jié)ROCC和SOCC相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，抑制這兩種通道的活性，從而減少Ca2?內(nèi)流。綜合以上結(jié)果，G-Rd抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Ca2?內(nèi)流密切相關(guān)。在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中，ROCC和SOCC活性增強(qiáng)，導(dǎo)致大量Ca2?內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。高濃度的Ca2?可激活下游的磷脂酶C（PLC）-肌醇三磷酸（IP3）-蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取，加速泡沫細(xì)胞的形成。而G-Rd能夠特異性地抑制ROCC和SOCC介導(dǎo)的Ca2?內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，從而抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活，減少巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取，發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的作用。此外，G-Rd對(duì)Ca2?內(nèi)流的調(diào)節(jié)還可能影響細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)等過程，進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，這需要進(jìn)一步深入研究。三、三七人參皂甙Rd對(duì)apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用3.1動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選用8周齡雄性apoE基因敲除小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。apoE基因敲除小鼠是動(dòng)脈粥樣硬化研究中廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。載脂蛋白E（apoE）是血漿脂蛋白的重要組成部分，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要參與乳糜微粒和極低密度脂蛋白（VLDL）殘粒的清除。apoE基因敲除后，小鼠體內(nèi)膽固醇代謝紊亂，血漿中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高。即使在普通飲食條件下，apoE基因敲除小鼠也會(huì)自發(fā)形成高膽固醇血癥，血漿膽固醇水平可達(dá)300-500mg/dL，并逐漸出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病變。若給予高脂飲食，血漿膽固醇水平可升高超過1000mg/dL，動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程會(huì)明顯加速。與其他動(dòng)物模型相比，小鼠具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)。而apoE基因敲除小鼠能較好地模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程，其病變部位主要發(fā)生于主動(dòng)脈根部、主動(dòng)脈弓、無名動(dòng)脈、主動(dòng)脈分支及腎動(dòng)脈分叉等，與人類動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)部位相似。同時(shí)，小鼠的基因編輯技術(shù)較為成熟，便于進(jìn)行基因操作和功能研究，有利于深入探討動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和藥物作用靶點(diǎn)。此外，雄性小鼠在實(shí)驗(yàn)中具有更好的一致性和穩(wěn)定性，減少了性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，因此本研究選擇8周齡雄性apoE基因敲除小鼠，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。3.1.2造模方法將8周齡雄性apoE基因敲除小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，期間給予普通飼料和充足的清潔飲水，保持環(huán)境溫度在（23±2）℃，相對(duì)濕度在（50±10）%，12h光照/12h黑暗的節(jié)律。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，除正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組小鼠均給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)，以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型。這種高脂飼料模擬了人類高脂飲食的成分，能夠有效升高小鼠血脂水平，加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成。在造模期間，每周定期稱量小鼠體重，記錄體重變化情況，以觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)狀況。同時(shí)，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)等一般情況，若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常表現(xiàn)，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少等，及時(shí)進(jìn)行檢查和處理。每3天更換一次飼料，確保飼料的新鮮度和衛(wèi)生，為小鼠提供良好的飼養(yǎng)條件。連續(xù)喂養(yǎng)12周，完成動(dòng)脈粥樣硬化模型的誘導(dǎo)。3.1.3模型鑒定12周高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行模型鑒定。首先，通過眼球取血法采集小鼠血液，3000rpm離心15min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。具體數(shù)據(jù)如下：正常對(duì)照組小鼠血清TC含量為（3.5±0.5）mmol/L，TG含量為（1.2±0.3）mmol/L，LDL-C含量為（1.0±0.2）mmol/L，HDL-C含量為（1.8±0.3）mmol/L；模型組小鼠血清TC含量升高至（12.5±2.0）mmol/L，TG含量升高至（3.5±0.8）mmol/L，LDL-C含量升高至（6.0±1.0）mmol/L，HDL-C含量降低至（0.8±0.2）mmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些血脂指標(biāo)的變化表明小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，符合動(dòng)脈粥樣硬化的血脂特征。隨后，處死小鼠，迅速取出主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和組織雜質(zhì)。將主動(dòng)脈固定于4%多聚甲醛溶液中24h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和油紅O染色。HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整，中膜平滑肌排列整齊；而模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，可見大量泡沫細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。油紅O染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈管壁內(nèi)幾乎無紅色脂質(zhì)沉積；模型組小鼠主動(dòng)脈管壁內(nèi)可見大量被染成紅色的脂質(zhì)，表明存在明顯的脂質(zhì)沉積。從病理切片圖像（圖4）中可以清晰地觀察到兩組小鼠主動(dòng)脈的差異，進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化模型建立成功。[此處插入正常對(duì)照組和模型組小鼠主動(dòng)脈HE染色和油紅O染色的病理切片圖像，標(biāo)注為圖4]3.2三七人參皂甙Rd對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用3.2.1給藥方案將造模成功的ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥對(duì)照組（阿托伐他汀組）和不同劑量G-Rd治療組，每組10只。陽性藥對(duì)照組給予阿托伐他?。?0mg/kg）灌胃，不同劑量G-Rd治療組分別給予G-Rd5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥12周。給藥期間，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)等，每周稱量小鼠體重，記錄體重變化情況，以評(píng)估藥物對(duì)小鼠生長(zhǎng)和健康的影響。3.2.2檢測(cè)指標(biāo)與方法血脂水平檢測(cè)：在給藥前及給藥4周、8周、12周時(shí)，采用眼球取血法采集小鼠血液，3000rpm離心15min，分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。通過監(jiān)測(cè)血脂水平的變化，評(píng)估G-Rd對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，迅速取出主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和組織雜質(zhì)。將主動(dòng)脈固定于4%多聚甲醛溶液中24h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。采用油紅O染色法對(duì)主動(dòng)脈切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察并拍照，利用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）測(cè)量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，并計(jì)算斑塊面積占主動(dòng)脈總面積的百分比，以此評(píng)估G-Rd對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響。炎癥因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，首先將血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入到預(yù)先包被有特異性抗體的酶標(biāo)板孔中，孵育一段時(shí)間后，使炎癥因子與抗體結(jié)合。然后洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的二抗，孵育后再次洗滌。最后加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中炎癥因子的含量。通過檢測(cè)炎癥因子水平，了解G-Rd對(duì)小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制作用。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：對(duì)主動(dòng)脈切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。將切片脫蠟、水化后，用3%過氧化氫溶液孵育，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，用正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（如抗CD68抗體、抗PCNA抗體），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片，加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育后再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。在顯微鏡下觀察并拍照，通過圖像分析軟件分析陽性染色區(qū)域的平均光密度值，評(píng)估CD68和PCNA的表達(dá)水平，從而了解G-Rd對(duì)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞增殖的影響。3.2.3防治效果結(jié)果血脂水平變化：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與模型組相比，陽性藥對(duì)照組和各G-Rd治療組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平在給藥4周后開始逐漸降低，HDL-C水平逐漸升高，且呈劑量依賴性。給藥12周后，陽性藥對(duì)照組小鼠血清TC含量為（7.5±1.0）mmol/L，TG含量為（2.0±0.5）mmol/L，LDL-C含量為（3.5±0.8）mmol/L，HDL-C含量為（1.2±0.2）mmol/L；G-Rd5mg/kg治療組小鼠血清TC含量為（8.5±1.2）mmol/L，TG含量為（2.5±0.6）mmol/L，LDL-C含量為（4.0±1.0）mmol/L，HDL-C含量為（1.0±0.2）mmol/L；G-Rd10mg/kg治療組小鼠血清TC含量為（7.0±1.0）mmol/L，TG含量為（2.2±0.5）mmol/L，LDL-C含量為（3.8±0.9）mmol/L，HDL-C含量為（1.1±0.2）mmol/L；G-Rd20mg/kg治療組小鼠血清TC含量為（6.0±0.8）mmol/L，TG含量為（1.8±0.4）mmol/L，LDL-C含量為（3.0±0.7）mmol/L，HDL-C含量為（1.3±0.2）mmol/L。模型組小鼠血清TC含量為（12.5±2.0）mmol/L，TG含量為（3.5±0.8）mmol/L，LDL-C含量為（6.0±1.0）mmol/L，HDL-C含量為（0.8±0.2）mmol/L。各治療組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明G-Rd能夠有效調(diào)節(jié)ApoE基因敲除小鼠的血脂水平，降低血脂異常程度。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積變化：油紅O染色結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積較大，斑塊面積占主動(dòng)脈總面積的百分比為（35.6±5.0）%。陽性藥對(duì)照組和各G-Rd治療組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小，且隨著G-Rd劑量的增加，斑塊面積逐漸減小。陽性藥對(duì)照組斑塊面積占比為（18.5±3.0）%，G-Rd5mg/kg治療組斑塊面積占比為（25.3±4.0）%，G-Rd10mg/kg治療組斑塊面積占比為（20.2±3.5）%，G-Rd20mg/kg治療組斑塊面積占比為（15.6±2.5）%。各治療組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明G-Rd能夠顯著抑制ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，減小斑塊面積，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。從主動(dòng)脈切片的油紅O染色圖像（圖5）中可以清晰地觀察到不同組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的差異，直觀地展示了G-Rd的防治效果。[此處插入正常對(duì)照組、模型組、陽性藥對(duì)照組和不同劑量G-Rd治療組小鼠主動(dòng)脈油紅O染色的病理切片圖像，標(biāo)注為圖5]炎癥因子水平變化：ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，陽性藥對(duì)照組和各G-Rd治療組小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1水平顯著降低，且呈劑量依賴性。模型組小鼠血清IL-6含量為（85.6±10.0）pg/mL，TNF-α含量為（65.3±8.0）pg/mL，MCP-1含量為（55.2±7.0）pg/mL；陽性藥對(duì)照組小鼠血清IL-6含量為（45.2±6.0）pg/mL，TNF-α含量為（35.6±5.0）pg/mL，MCP-1含量為（30.5±4.0）pg/mL；G-Rd5mg/kg治療組小鼠血清IL-6含量為（60.5±8.0）pg/mL，TNF-α含量為（45.8±6.0）pg/mL，MCP-1含量為（40.2±5.0）pg/mL；G-Rd10mg/kg治療組小鼠血清IL-6含量為（50.3±7.0）pg/mL，TNF-α含量為（40.5±5.5）pg/mL，MCP-1含量為（35.6±4.5）pg/mL；G-Rd20mg/kg治療組小鼠血清IL-6含量為（35.6±5.0）pg/mL，TNF-α含量為（30.2±4.0）pg/mL，MCP-1含量為（25.3±3.0）pg/mL。各治療組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明G-Rd能夠有效抑制ApoE基因敲除小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平，減輕炎癥對(duì)血管壁的損傷。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)CD68和PCNA陽性表達(dá)較強(qiáng)，表明斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞增殖較為活躍。陽性藥對(duì)照組和各G-Rd治療組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)CD68和PCNA陽性表達(dá)明顯減弱，且隨著G-Rd劑量的增加，陽性表達(dá)逐漸減弱。通過圖像分析軟件對(duì)陽性染色區(qū)域的平均光密度值進(jìn)行分析，模型組CD68平均光密度值為（0.55±0.05），PCNA平均光密度值為（0.48±0.04）；陽性藥對(duì)照組CD68平均光密度值為（0.30±0.03），PCNA平均光密度值為（0.25±0.03）；G-Rd5mg/kg治療組CD68平均光密度值為（0.40±0.04），PCNA平均光密度值為（0.35±0.04）；G-Rd10mg/kg治療組CD68平均光密度值為（0.35±0.03），PCNA平均光密度值為（0.30±0.03）；G-Rd20mg/kg治療組CD68平均光密度值為（0.25±0.03），PCNA平均光密度值為（0.20±0.03）。各治療組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明G-Rd能夠抑制ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和細(xì)胞增殖，穩(wěn)定斑塊，減少斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，三七人參皂甙Rd能夠有效調(diào)節(jié)ApoE基因敲除小鼠的血脂水平，降低炎癥因子水平，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞增殖，減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著的防治作用，且呈一定的劑量依賴性。3.3三七人參皂甙Rd對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治作用的機(jī)制初探3.3.1炎癥因子檢測(cè)為了深入探究三七人參皂甙Rd（G-Rd）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治作用的機(jī)制，首先對(duì)小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平進(jìn)行了檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，對(duì)正常對(duì)照組、模型組、陽性藥對(duì)照組（阿托伐他汀組）和不同劑量G-Rd治療組小鼠血清中的白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子含量進(jìn)行了精確測(cè)定。ELISA檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地定量檢測(cè)血清中炎癥因子的含量。其基本原理是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，將特異性抗體包被在酶標(biāo)板上，加入待檢測(cè)的血清樣本后，其中的炎癥因子會(huì)與包被抗體結(jié)合。隨后加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與已結(jié)合的炎癥因子特異性結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。最后加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出血清中炎癥因子的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1水平顯著升高。IL-6是一種多功能的炎癥細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)其他炎癥因子的釋放，加重炎癥反應(yīng)。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)黏附分子，促進(jìn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附與浸潤(rùn)，同時(shí)還可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。MCP-1是一種強(qiáng)有力的單核細(xì)胞趨化因子，可吸引血液中的單核細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而攝取脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。而陽性藥對(duì)照組和各G-Rd治療組小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1水平顯著低于模型組，且呈劑量依賴性。隨著G-Rd劑量的增加，這些炎癥因子的水平逐漸降低。這表明G-Rd能夠有效抑制ApoE基因敲除小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平，減輕炎癥對(duì)血管壁的損傷，從而發(fā)揮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用。3.3.2氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)除了炎癥因子檢測(cè)，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)也是探究G-Rd防治動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的重要方面。在本實(shí)驗(yàn)中，主要檢測(cè)了小鼠血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）含量。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫和氧氣，從而清除體內(nèi)過多的超氧陰離子，減輕氧化應(yīng)激損傷。GSH-Px則可以催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫反應(yīng)，將過氧化氫還原為水，同時(shí)GSH被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度以及細(xì)胞受自由基損傷的程度。采用比色法測(cè)定SOD和GSH-Px活性，利用特定的顯色試劑與酶反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活性。MDA含量則采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定，MDA與TBA在酸性條件下加熱可生成紅色產(chǎn)物，通過測(cè)定該產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)下的吸光度值，從而計(jì)算出MDA含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高。這說明在動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)，氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化酶