miR-378在骨骼肌糖代謝調控中的分子機制與功能解析一、引言1.1研究背景在人體代謝系統(tǒng)中，骨骼肌占據(jù)著核心地位，它不僅是運動的動力源泉，更是維持機體代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵因素。從質量占比來看，骨骼肌約占人體體重的40%，是人體最大的代謝器官，同時也是機體靜息狀態(tài)下葡萄糖代謝的主要場所，約75%的葡萄糖攝取由骨骼肌完成。在血糖調節(jié)過程中，胰島素起著核心作用，而骨骼肌作為胰島素作用的主要靶器官，對維持血糖平衡意義重大。當機體攝入碳水化合物后，血糖升高，胰腺分泌胰島素，胰島素與骨骼肌細胞膜上的胰島素受體結合，激活下游的胰島素信號通路，促進葡萄糖轉運體4（GLUT4）從細胞內(nèi)轉位到細胞膜上，從而增加葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平。此外，骨骼肌還通過糖原合成、糖酵解等代謝途徑，對血糖進行有效的儲存和利用，進一步維持血糖的穩(wěn)定。一旦骨骼肌的糖代謝功能受損，將會引發(fā)一系列嚴重的代謝紊亂問題，如胰島素抵抗、高血糖等，這些問題不僅是2型糖尿病的重要發(fā)病機制，還與肥胖、心血管疾病等多種代謝性疾病密切相關。在肥胖人群中，由于脂肪堆積導致炎癥反應，進而影響骨骼肌的胰島素信號傳導，使得骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用能力下降，最終引發(fā)胰島素抵抗和高血糖。心血管疾病患者往往也伴隨著骨骼肌功能障礙和糖代謝異常，這進一步增加了心血管疾病的發(fā)病風險和死亡率。因此，深入探究骨骼肌糖代謝的調控機制，對于預防和治療代謝性疾病具有重要的現(xiàn)實意義。MicroRNAs（miRNAs）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，在基因表達調控領域扮演著關鍵角色。自1993年首個miRNA——lin-4被發(fā)現(xiàn)以來，miRNAs的研究取得了飛速發(fā)展。截至目前，在人類基因組中已鑒定出超過2000種miRNAs，它們參與調控了約60%的蛋白質編碼基因的表達。miRNAs的生物合成是一個復雜且精細的過程，首先由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初級miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在細胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8切割，形成長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾結構的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA被轉運蛋白Exportin-5轉運至細胞質中，在核酸酶Dicer的作用下，進一步切割成為成熟的miRNA。成熟的miRNA與AGO蛋白等組成RNA誘導沉默復合體（RISC），通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，從而抑制靶mRNA的翻譯過程，或者直接降解靶mRNA，實現(xiàn)對基因表達的調控。在細胞增殖和分化過程中，miR-1和miR-133通過調控相關靶基因的表達，促進骨骼肌細胞的增殖和分化；在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-21通過抑制腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-378作為miRNA家族的重要成員，近年來在多個生物過程中的研究取得了顯著進展。在脂肪代謝方面，研究表明miR-378能夠靶向調控脂肪代謝相關基因，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等，影響脂肪細胞的分化和脂質積累。在腫瘤領域，miR-378的表達水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在乳腺癌中，miR-378表達下調，通過靶向調控相關基因，促進腫瘤細胞的增殖和轉移；而在肝癌中，miR-378的高表達則與腫瘤的不良預后相關。在肝臟代謝中，miR-378通過靶向作用于p110α，調控肝臟胰島素信號通路，進而影響葡萄糖和脂質代謝的動態(tài)平衡。然而，miR-378在骨骼肌糖代謝調控方面的研究仍處于起步階段，目前對于miR-378是否直接參與骨骼肌糖代謝過程，以及其具體的調控機制和潛在的靶基因，尚缺乏深入系統(tǒng)的研究。鑒于骨骼肌糖代謝在維持機體代謝穩(wěn)態(tài)中的重要性，以及miR-378在其他生物過程中展現(xiàn)出的關鍵調控作用，深入探究miR-378調控骨骼肌糖代謝的分子機制，不僅有助于揭示骨骼肌糖代謝的精細調控網(wǎng)絡，為代謝性疾病的發(fā)病機制研究提供新的視角，還可能為糖尿病、肥胖等代謝性疾病的預防和治療開辟新的靶點和策略，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示miR-378調控骨骼肌糖代謝的具體分子機制。通過構建miR-378基因敲除小鼠模型和利用C2C12細胞系進行體外實驗，綜合運用分子生物學、細胞生物學和生物信息學等多學科技術手段，從整體動物、細胞和分子水平三個層面，系統(tǒng)探究miR-378對骨骼肌糖代謝相關指標的影響，明確其在胰島素信號通路、糖酵解途徑等關鍵代謝過程中的調控作用，并鑒定其潛在的靶基因，解析miR-378通過靶向作用于特定基因進而調控骨骼肌糖代謝的分子機制。深入探究miR-378調控骨骼肌糖代謝的分子機制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。在理論方面，有助于揭示骨骼肌糖代謝的精細調控網(wǎng)絡，為代謝性疾病的發(fā)病機制研究提供新的視角。miR-378作為一種關鍵的調控分子，其在骨骼肌糖代謝中的作用機制研究，將豐富我們對miRNA介導的基因表達調控在代謝領域的認識，進一步完善骨骼肌糖代謝的分子調控理論體系。在臨床應用方面，研究成果可能為糖尿病、肥胖等代謝性疾病的預防和治療開辟新的靶點和策略。一旦明確了miR-378及其靶基因在骨骼肌糖代謝中的關鍵作用，就可以通過調節(jié)miR-378的表達水平或干預其靶基因的功能，來改善骨骼肌的糖代謝功能，從而為代謝性疾病的治療提供新的思路和方法。未來可以開發(fā)針對miR-378或其靶基因的藥物，通過調節(jié)miR-378的表達或抑制其靶基因的活性，來提高骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用能力，降低血糖水平，為糖尿病等代謝性疾病的治療提供新的有效手段。二、骨骼肌與糖代謝概述2.1骨骼肌的結構與功能骨骼肌作為人體運動系統(tǒng)的關鍵組成部分，在維持身體正常生理活動中發(fā)揮著不可或缺的作用。從結構層面來看，骨骼肌主要由肌肉組織和結締組織構成。肌肉組織中的肌細胞，因其形態(tài)呈細長纖維狀，故而又被稱作肌纖維，是骨骼肌的基本組成單位。這些肌纖維通過肌腱與骨骼緊密相連，從而實現(xiàn)力量的傳遞和運動的產(chǎn)生。每塊骨骼肌都由眾多平行排列的肌纖維集合而成，周圍被結締組織所包裹。其中，包繞在整塊肌肉外部的結締組織被稱為肌外膜，它屬于致密結締組織膜，富含血管和神經(jīng)，在解剖學中又被稱為深筋膜。肌外膜的結締組織以及血管和神經(jīng)的分支會深入肌肉內(nèi)部，對大小各異的肌束進行分隔和包圍，進而形成肌束膜。而包圍在每條肌纖維周圍的網(wǎng)狀纖維則是肌內(nèi)膜，肌內(nèi)膜中含有豐富的毛細血管及神經(jīng)分支。各層結締組織膜不僅對肌組織起到支持、連接、營養(yǎng)和保護的作用，而且在調節(jié)單條肌纖維的活動，以及協(xié)調肌束和整塊肌肉的肌纖維群體活動方面也發(fā)揮著重要作用。根據(jù)肌纖維的結構和功能特性，可將其分為紅肌纖維、白肌纖維和中間型纖維三種類型。紅肌纖維富含肌紅蛋白和線粒體，外觀呈現(xiàn)暗紅色。其能量來源主要依靠有氧氧化，血管豐富，能夠為代謝提供充足的氧氣。紅肌纖維較細，肌原纖維也較細且數(shù)量較少，收縮能力相對較弱且較為緩慢，但其持續(xù)時間較長，不易疲勞，因此又被稱為慢縮纖維，常見于哺乳動物的四肢和候鳥的胸部肌肉。與之相反，白肌纖維內(nèi)肌紅蛋白和線粒體的含量較少，顏色呈淡紅色，其能量來源主要是無氧酵解。白肌纖維較粗，肌原纖維也更粗、更多，收縮速度快，但持續(xù)時間短，所以又被稱為快縮纖維，主要分布于眼球周圍和手指等處。中間型纖維的結構與功能則介于紅肌纖維和白肌纖維之間。人體的骨骼肌大多是由這三種肌纖維混合組成，不過不同部位的骨骼肌中，三種纖維的構成比例存在差異。以維持姿勢為主要功能的肌肉通常含有較多的紅肌纖維，而從事快速、高靈敏度動作的肌肉則以白肌纖維為主。并且，鍛煉、甲狀腺素或切除神經(jīng)等因素都可能導致肌肉中肌纖維類型發(fā)生轉變。從功能角度而言，骨骼肌具有多種重要功能。首先，它是人體運動的主要動力來源，通過收縮和舒張來驅動關節(jié)運動，使人體能夠完成各種動作和活動。無論是簡單的肢體動作，如行走、跑步、跳躍，還是復雜的行為活動，如書寫、繪畫、演奏樂器等，都離不開骨骼肌的收縮作用。當大腦發(fā)出動作指令時，神經(jīng)信號會傳遞到骨骼肌，引起肌肉收縮，從而產(chǎn)生力量，使骨骼進行相應的運動。在這個過程中，骨骼肌與其他肌肉協(xié)同工作，以完成各種復雜的動作。例如，在跑步時，需要多個部位的骨骼肌協(xié)同配合，包括腿部的股四頭肌、腘繩肌、小腿三頭肌，以及臀部的臀大肌等，它們共同作用，以保持身體的穩(wěn)定和平衡，推動身體向前移動。其次，骨骼肌在維持身體姿勢方面也起著關鍵作用。在站立、坐姿等靜態(tài)姿勢中，骨骼肌通過持續(xù)的收縮和放松，產(chǎn)生適當?shù)膹埩?，以維持身體的平衡和穩(wěn)定。例如，站立時，小腿的比目魚肌和腓腸肌等肌肉需要保持一定的緊張度，以防止身體前傾或后仰；而在坐姿時，背部的豎脊肌等肌肉則需要維持一定的收縮狀態(tài)，以保持脊柱的正常生理曲度，避免彎腰駝背等不良姿勢的出現(xiàn)。此外，骨骼肌還是人體代謝的重要器官之一。它不僅是機體靜息狀態(tài)下葡萄糖代謝的主要場所，約75%的葡萄糖攝取由骨骼肌完成，而且在運動過程中，骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用會顯著增加，以滿足能量需求。在糖代謝過程中，骨骼肌可以通過糖原合成將葡萄糖儲存起來，當身體需要能量時，又可以通過糖原分解將儲存的糖原釋放出來，轉化為葡萄糖供能。同時，骨骼肌還參與脂肪代謝，在運動時，骨骼肌會攝取血液中的脂肪酸作為能源物質，通過β-氧化過程生成乙酰CoA，再經(jīng)過三羧酸循環(huán)生成ATP，為肌肉收縮提供能量。此外，骨骼肌還能通過血液循環(huán)為骨骼提供營養(yǎng)和氧氣，對維持骨骼的健康和正常功能具有重要意義。2.2糖代謝的基本過程糖代謝是一個極為復雜且高度有序的過程，它涵蓋了糖的攝取、利用、儲存和釋放等多個關鍵環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)相互協(xié)調、緊密配合，在維持機體能量平衡和生理功能方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。在糖的攝取過程中，食物中的糖類主要以淀粉等多糖以及少量雙糖和單糖的形式存在。食物進入口腔后，其中的淀粉在唾液淀粉酶的作用下，開始初步水解，將淀粉中的α-1，4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽寡糖及糊精等產(chǎn)物。由于食物在口腔中停留時間較短，淀粉的主要消化部位是小腸。在小腸中，胰腺分泌的α-淀粉酶繼續(xù)對淀粉進行水解，使其進一步分解為麥芽糖、麥芽三糖、α糊精和少量葡萄糖。小腸黏膜刷狀緣上存在多種酶，α糊精酶能夠催化α極限糊精的α-1，4-糖苷鍵及α-1，6-糖苷鍵水解，將α-糊精徹底水解成葡萄糖；麥芽糖酶可將麥芽三糖及麥芽糖水解為葡萄糖；蔗糖酶將蔗糖分解成葡萄糖和果糖；乳糖酶則將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖。這些單糖被小腸上皮細胞攝取，這個過程是一個依賴Na?的耗能主動攝取過程，需要特定的載體參與。在小腸上皮細胞刷狀緣上，存在著與細胞膜結合的Na?-葡萄糖聯(lián)合轉運體，當Na?經(jīng)轉運體順濃度梯度進入小腸上皮細胞時，葡萄糖隨Na?一起被移入細胞內(nèi)，此時葡萄糖是逆濃度梯度轉運，其能量由Na?的濃度梯度提供。當小腸上皮細胞內(nèi)的葡萄糖濃度增高到一定程度，葡萄糖經(jīng)小腸上皮細胞基底面單向葡萄糖轉運體順濃度梯度被動擴散到血液中，從而完成糖的攝取過程，進入血液循環(huán)的葡萄糖被運輸?shù)饺砀鹘M織細胞，為后續(xù)的代謝過程提供物質基礎。糖的利用途徑主要包括無氧酵解、有氧氧化和磷酸戊糖途徑等。在無氧條件下，如劇烈運動時，骨骼肌等組織細胞會進行糖的無氧酵解。葡萄糖或糖原在胞液中經(jīng)過一系列酶的催化作用，分解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原為乳酸，并產(chǎn)生少量能量（2分子ATP）。糖的無氧酵解是機體在缺氧情況下獲取能量的重要方式，對于紅細胞等缺乏線粒體的細胞，糖酵解是其唯一的供能途徑。在有氧條件下，糖的有氧氧化是主要的供能方式。葡萄糖首先在胞液中經(jīng)糖酵解途徑分解為丙酮酸，丙酮酸進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶復合體的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解為二氧化碳和水，并釋放出大量能量（30或32分子ATP）。三羧酸循環(huán)不僅是糖有氧分解代謝的途徑，也是機體內(nèi)一切有機物的碳鏈骨架氧化成CO?的必經(jīng)途徑，是體內(nèi)營養(yǎng)物質徹底氧化分解的共同通路，同時也是體內(nèi)物質代謝相互聯(lián)系的樞紐。磷酸戊糖途徑則是從葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖開始，經(jīng)代謝產(chǎn)生磷酸戊糖及NADPH+H?，磷酸戊糖再進一步轉變成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖。磷酸戊糖途徑的主要意義在于生成NADPH和磷酸戊糖，NADPH作為供氫體參與多種生物合成反應，如脂肪酸、膽固醇等的合成；磷酸戊糖則參與核酸的合成。糖的儲存形式主要是糖原，包括肝糖原和肌糖原。糖原合成是由單糖合成糖原的過程，這是一個耗能過程，需要糖原引物，糖原合酶是合成過程的關鍵酶，糖原支鏈結構的形成還需要分支酶的作用。在肝臟和肌肉等組織中，當血糖濃度較高時，多余的葡萄糖會在一系列酶的作用下合成糖原儲存起來。肝糖原的合成可以維持血糖濃度的相對穩(wěn)定，當血糖濃度降低時，肝糖原可以分解為葡萄糖釋放到血液中，補充血糖。肌糖原主要為肌肉收縮提供能量，在肌肉活動時，肌糖原分解產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸可直接進入糖酵解途徑供能，但肌糖原不能直接分解為葡萄糖補充血糖，因為肌肉中缺乏葡萄糖-6-磷酸酶。糖的釋放過程主要涉及肝糖原分解和糖異生作用。肝糖原分解是指肝糖原在糖原磷酸化酶等酶的作用下，逐步分解為葡萄糖-1-磷酸，再轉變?yōu)槠咸烟?6-磷酸，在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下，最終生成葡萄糖釋放到血液中，這是空腹時血糖的直接來源。糖異生作用則是指非糖物質如甘油、丙酮酸、乳酸以及某些氨基酸等在肝臟中轉變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^程，在長期饑餓等情況下，糖異生作用對于維持血糖濃度的穩(wěn)定具有重要意義。糖代謝的各個過程受到神經(jīng)系統(tǒng)、激素及組織器官的精細調節(jié)，以維持血糖濃度的相對恒定。神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦和自主神經(jīng)系統(tǒng)調節(jié)相關激素的分泌，進而影響糖代謝。激素對糖代謝的調節(jié)主要通過胰島素、胰高血糖素、腎上腺素、糖皮質激素、生長激素及甲狀腺激素等之間的相互協(xié)同和拮抗作用來實現(xiàn)。胰島素是調節(jié)血糖的重要激素，它能夠促進組織細胞對葡萄糖的攝取和利用，加速糖原合成，抑制糖原分解和糖異生，從而降低血糖濃度；胰高血糖素則與胰島素作用相反，它能促進肝糖原分解和糖異生，升高血糖濃度；腎上腺素在應激情況下可迅速升高血糖，以滿足機體對能量的需求；糖皮質激素、生長激素等也通過不同的機制對糖代謝產(chǎn)生影響。肝臟作為調節(jié)血糖濃度的最主要器官，通過糖原合成、分解和糖異生等過程，對血糖濃度進行有效的調節(jié)。當血糖濃度過高時，肝細胞膜上的GLUT2起作用，快速攝取過多的葡萄糖進入肝細胞，通過肝糖原合成來降低血糖濃度；血糖濃度過高還會刺激胰島素分泌，導致肌肉和脂肪組織細胞膜上GLUT4的量迅速增加，加快對血液中葡萄糖的吸收，合成肌糖原或轉變成脂肪儲存起來。當血糖濃度偏低時，肝臟通過糖原分解及糖異生升高血糖濃度。2.3骨骼肌在糖代謝中的作用骨骼肌作為機體利用葡萄糖的主要組織，在糖代謝過程中發(fā)揮著核心作用，對維持血糖平衡和能量穩(wěn)態(tài)至關重要。在血糖調節(jié)方面，骨骼肌起著舉足輕重的作用。正常生理狀態(tài)下，胰島素介導的骨骼肌葡萄糖攝取是維持血糖穩(wěn)態(tài)的關鍵環(huán)節(jié)。當機體進食后，血糖水平升高，胰腺中的胰島β細胞分泌胰島素，胰島素與骨骼肌細胞膜上的胰島素受體特異性結合。胰島素受體是一種跨膜蛋白，由α亞基和β亞基組成，α亞基位于細胞外，負責識別和結合胰島素，β亞基則跨越細胞膜，具有酪氨酸激酶活性。胰島素與α亞基結合后，引起β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化，進而激活下游的一系列信號分子。其中，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是胰島素信號通路中的關鍵分子，它被激活后，將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活蛋白激酶B（Akt）。Akt通過磷酸化作用，促使葡萄糖轉運體4（GLUT4）從細胞內(nèi)的儲存囊泡轉位到細胞膜上，從而增加骨骼肌對葡萄糖的攝取。研究表明，在胰島素刺激下，骨骼肌細胞中GLUT4的轉位顯著增加，葡萄糖攝取量可提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍，有效地降低了血糖水平。當血糖水平降低時，胰島素分泌減少，骨骼肌對葡萄糖的攝取也相應減少，從而維持血糖在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)。一旦胰島素信號通路受損，如胰島素抵抗時，胰島素與受體結合后無法有效地激活下游信號分子，導致GLUT4轉位障礙，骨骼肌對葡萄糖的攝取能力下降，血糖不能被及時利用，進而引發(fā)高血糖，長期可導致糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生。糖原合成與分解是骨骼肌糖代謝的重要過程。糖原合成是一個耗能過程，需要多種酶的參與。當血糖濃度升高時，胰島素分泌增加，胰島素通過激活糖原合成酶，促進葡萄糖合成糖原。在這個過程中，葡萄糖首先在己糖激酶的作用下磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖再在磷酸葡萄糖變位酶的作用下轉變?yōu)?-磷酸葡萄糖。1-磷酸葡萄糖與尿苷三磷酸（UTP）反應生成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG），UDPG在糖原合成酶的催化下，將葡萄糖殘基連接到糖原引物上，使糖原鏈不斷延長。此外，分支酶可以將糖原鏈上的部分葡萄糖殘基轉移，形成分支結構，增加糖原的水溶性和可利用性。骨骼肌中儲存的糖原是一種重要的能量儲備物質，在運動或饑餓等情況下，糖原分解為葡萄糖-1-磷酸，再轉變?yōu)槠咸烟?6-磷酸，為肌肉收縮提供能量。糖原分解的關鍵酶是糖原磷酸化酶，它在磷酸化酶激酶的作用下被激活，催化糖原分子的α-1，4-糖苷鍵斷裂，釋放出葡萄糖-1-磷酸。葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下轉化為葡萄糖-6-磷酸，在肌肉中，葡萄糖-6-磷酸可直接進入糖酵解途徑供能；但由于肌肉中缺乏葡萄糖-6-磷酸酶，不能將葡萄糖-6-磷酸水解為葡萄糖釋放到血液中，因此肌糖原主要為肌肉自身提供能量。糖酵解和有氧氧化是骨骼肌利用葡萄糖產(chǎn)生能量的主要途徑。在劇烈運動等無氧或相對缺氧的情況下，骨骼肌主要通過糖酵解途徑獲取能量。糖酵解是一個在細胞質中進行的過程，葡萄糖或糖原經(jīng)過一系列酶的催化作用，分解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原為乳酸，并產(chǎn)生少量能量（2分子ATP）。糖酵解途徑中的關鍵酶包括己糖激酶、磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶等，它們的活性受到多種因素的調節(jié)，如底物濃度、產(chǎn)物濃度、激素和代謝產(chǎn)物等。在劇烈運動時，肌肉對能量的需求急劇增加，糖酵解途徑被迅速激活，以滿足肌肉收縮的能量需求，但同時也會導致乳酸的積累，當乳酸濃度過高時，會引起肌肉疲勞和酸痛。在有氧條件下，骨骼肌則主要通過有氧氧化途徑利用葡萄糖。有氧氧化是一個更為復雜和高效的供能過程，葡萄糖首先在胞液中經(jīng)糖酵解途徑分解為丙酮酸，丙酮酸進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶復合體的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解為二氧化碳和水，并釋放出大量能量（30或32分子ATP）。三羧酸循環(huán)是有氧氧化的核心環(huán)節(jié)，其中的關鍵酶如檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶復合體等，它們的活性受到多種因素的精細調控，如底物濃度、產(chǎn)物濃度、ATP/ADP比值、NADH/NAD?比值等。有氧氧化不僅為肌肉收縮提供了充足的能量，還能維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，避免乳酸等代謝產(chǎn)物的過度積累。三、miR-378的生物學特性3.1miRNA的簡介MicroRNAs（miRNAs）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在生命科學領域中占據(jù)著至關重要的地位，其長度約為21-23個核苷酸，卻蘊含著強大的基因表達調控能力，參與了生物體的眾多生理和病理過程。從結構特點來看，miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，大部分位于基因間隔區(qū)。其初級轉錄產(chǎn)物（pri-miRNA）是具有發(fā)夾結構的單鏈RNA，長度可達幾千個堿基。pri-miRNA在細胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合體識別并切割，生成長度約為70-100個核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA呈莖環(huán)結構。隨后，pre-miRNA在轉運蛋白Exportin-5的協(xié)助下，借助Ran-GTP提供的能量，從細胞核轉運至細胞質中。在細胞質中，pre-miRNA被核酸酶Dicer識別并進一步切割，最終形成成熟的miRNA，成熟的miRNA5′端有一磷酸基團，3′端為羥基。miRNA的作用機制主要是通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，從而在轉錄后水平對基因表達進行負調控。成熟的miRNA與AGO蛋白等組成RNA誘導沉默復合體（RISC），當RISC中的miRNA與靶mRNA的3'UTR堿基互補配對程度較高時，可直接導致靶mRNA的降解；若互補配對程度較低，則會抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質的合成。一個miRNA可以調控多個靶基因，而多個miRNA也可以調節(jié)同一靶基因，這種復雜的調控網(wǎng)絡使得miRNA在基因表達調控中發(fā)揮著精細而廣泛的作用。在細胞增殖和分化過程中，miR-1和miR-133通過靶向作用于一系列相關基因，如血清反應因子（SRF）等，促進骨骼肌細胞的增殖和分化；在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-21通過抑制腫瘤抑制基因如程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）等的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA在基因表達調控中具有不可或缺的重要性。它參與了生物體生長發(fā)育的各個階段，從胚胎發(fā)育到個體成熟，miRNA都發(fā)揮著關鍵的調控作用。在胚胎發(fā)育過程中，miR-430通過調控母源mRNA的降解，影響斑馬魚胚胎的發(fā)育進程。在個體成熟后，miRNA在維持細胞的正常功能和代謝平衡方面也起著重要作用，如miR-375通過調控胰島素分泌相關基因，參與血糖穩(wěn)態(tài)的維持。一旦miRNA的調控功能出現(xiàn)異常，就可能引發(fā)各種疾病，如腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。在腫瘤中，miRNA的表達譜常常發(fā)生改變，一些miRNA如miR-155等被稱為“癌miRNA”，它們的異常高表達會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而另一些miRNA如let-7等則被視為“抑癌miRNA”，其表達下調會導致腫瘤抑制作用減弱。在心血管疾病中，miR-1和miR-133的表達失調與心肌肥大、心律失常等疾病密切相關。因此，深入研究miRNA的生物學特性和作用機制，對于揭示生命過程的奧秘以及疾病的診斷、治療和預防都具有重要的意義。3.2miR-378的發(fā)現(xiàn)與結構特征miR-378的發(fā)現(xiàn)源于對miRNA家族系統(tǒng)而深入的探索研究。在早期的miRNA研究中，科學家們通過對多種生物的基因組進行大規(guī)模測序和生物信息學分析，旨在挖掘和鑒定新的miRNA分子。隨著研究技術的不斷進步，特別是深度測序技術和生物信息學算法的發(fā)展，使得對miRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定更加高效和準確。在對哺乳動物基因組的研究中，通過特定的生物信息學預測工具，結合實驗驗證，發(fā)現(xiàn)了一系列具有潛在調控功能的miRNA序列，miR-378便是其中之一。最初，研究人員利用深度測序技術對小鼠的多種組織進行了miRNA表達譜分析，在眾多的測序數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)了一段長度約為22個核苷酸的非編碼RNA序列，其表達具有一定的組織特異性和時空特異性，經(jīng)過進一步的生物信息學分析和實驗驗證，確定該序列為一種新的miRNA，并將其命名為miR-378。隨后，在人類和其他物種的基因組中也鑒定出了與小鼠miR-378具有高度同源性的序列，表明miR-378在進化過程中具有一定的保守性。從結構特征來看，miR-378基因位于基因組的特定區(qū)域，在人類中，其基因座位于染色體19上，具體位置為19q13.43。miR-378的初級轉錄產(chǎn)物（pri-miR-378）是一段較長的單鏈RNA，它在細胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成，長度可達數(shù)千個核苷酸，具有典型的莖環(huán)結構特征。pri-miR-378在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合體的作用下，被切割成約70-100個核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miR-378）。pre-miR-378的二級結構呈現(xiàn)出穩(wěn)定的莖環(huán)結構，莖部由互補配對的核苷酸形成雙鏈結構，環(huán)部則由未配對的核苷酸組成，這種獨特的結構對于pre-miR-378的加工和轉運至關重要。隨后，pre-miR-378在轉運蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細胞核轉運至細胞質中。在細胞質中，pre-miR-378被核酸酶Dicer識別并進一步切割，最終生成成熟的miR-378，成熟的miR-378長度約為22個核苷酸，5′端有一磷酸基團，3′端為羥基。miR-378的核苷酸序列在不同物種間具有一定的保守性，這反映了其在進化過程中可能承擔著重要且保守的生物學功能。研究表明，小鼠和人類的miR-378成熟序列僅有個別核苷酸的差異，這種高度的保守性暗示了miR-378在不同物種中的功能相似性和重要性。其核苷酸序列中的特定區(qū)域對于與靶mRNA的識別和結合起著關鍵作用，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）的互補配對，實現(xiàn)對靶基因表達的調控。miR-378的種子序列（seedsequence），即5′端第2-8位核苷酸，與靶mRNA的互補配對程度決定了其靶向作用的特異性和有效性。當miR-378的種子序列與靶mRNA的3'UTR完全或部分互補時，miR-378與AGO蛋白等組成的RNA誘導沉默復合體（RISC）可以結合到靶mRNA上，抑制靶mRNA的翻譯過程，或者直接降解靶mRNA，從而實現(xiàn)對基因表達的負調控。miR-378的結構對其功能具有重要的潛在影響。其二級結構的穩(wěn)定性和靈活性影響著miR-378的加工和成熟過程，以及與RISC中其他蛋白的相互作用。穩(wěn)定的莖環(huán)結構有助于pre-miR-378被Dicer準確識別和切割，生成成熟的miR-378。同時，miR-378與靶mRNA的結合能力也受到其結構的影響，合適的空間構象能夠使miR-378更好地與靶mRNA互補配對，增強其對靶基因表達的調控作用。在脂肪代謝調控中，miR-378通過與靶基因如PPARγ的3'UTR結合，抑制PPARγ的表達，進而影響脂肪細胞的分化和脂質積累。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-378對不同靶基因的調控作用也依賴于其結構與靶mRNA的匹配程度，從而影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為。3.3miR-378的表達分布miR-378在多種組織和細胞中呈現(xiàn)出廣泛而又具有特異性的表達模式，這一特性為其在不同生理和病理過程中發(fā)揮多樣化的調控功能奠定了基礎。在正常生理狀態(tài)下，通過對多種組織的檢測分析發(fā)現(xiàn)，miR-378在脂肪組織、肝臟、骨骼肌、心臟、腎臟等組織中均有表達。在脂肪組織中，尤其是白色脂肪組織和棕色脂肪組織，miR-378的表達水平相對較高，它在脂肪細胞的分化、脂質代謝以及能量平衡的調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。研究表明，在脂肪細胞分化過程中，miR-378的表達水平會發(fā)生動態(tài)變化，在分化早期，miR-378的表達逐漸升高，隨后在分化后期又有所下降。這種表達變化與脂肪細胞分化過程中關鍵轉錄因子和基因的表達調控密切相關，miR-378可能通過靶向作用于相關基因，如PPARγ等，來影響脂肪細胞的分化進程和脂質積累。在肝臟組織中，miR-378也具有一定的表達水平，并且參與了肝臟的多種代謝過程，包括葡萄糖代謝、脂質代謝和膽汁酸合成等。中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所研究員應浩研究組發(fā)現(xiàn)，肝臟miR-378受甲狀腺激素正向調控，過表達miR-378能夠顯著降低血清總膽固醇水平，機制研究表明miR-378可通過調控膽汁酸合成經(jīng)典途徑和旁路途徑中關鍵酶CYP7B1，CYP8B1和CYP27A1的表達，增加肝臟膽固醇向膽汁酸的轉化及外排，加快體內(nèi)膽固醇的清除。在心臟組織中，miR-378的表達與心臟的發(fā)育、功能維持以及疾病發(fā)生密切相關。在心臟發(fā)育過程中，miR-378的表達模式呈現(xiàn)出時空特異性，對心肌細胞的增殖、分化和心臟的形態(tài)建成具有重要的調控作用。當心臟發(fā)生病理性損傷時，如心肌梗死、心力衰竭等，miR-378的表達水平會發(fā)生明顯改變，它可能通過調控相關靶基因，參與心肌細胞的凋亡、纖維化以及心臟功能的重塑等過程。在腎臟組織中，miR-378的表達與腎臟的生理功能和疾病狀態(tài)也存在關聯(lián)，雖然目前相關研究相對較少，但已有研究表明，在某些腎臟疾病模型中，miR-378的表達異?？赡軈⑴c了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，如在糖尿病腎病中，miR-378的表達失調可能影響腎臟細胞的增殖、凋亡和細胞外基質的代謝，進而導致腎臟功能的損傷。在骨骼肌組織中，miR-378同樣具有較為豐富的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-378在不同類型的骨骼肌纖維中表達存在差異，在以有氧代謝為主的紅肌纖維中，miR-378的表達水平相對較高，而在以無氧代謝為主的白肌纖維中，其表達水平則相對較低。這種表達差異可能與不同類型肌纖維的代謝特點和功能需求有關，紅肌纖維富含線粒體，主要進行有氧氧化供能，對能量代謝的調控更為精細，miR-378在紅肌纖維中的高表達可能參與了其能量代謝相關基因的調控，以維持紅肌纖維的正常功能。在骨骼肌發(fā)育過程中，miR-378的表達呈現(xiàn)出動態(tài)變化規(guī)律。在胚胎期和出生后的早期發(fā)育階段，miR-378的表達水平逐漸升高，這與骨骼肌細胞的增殖、分化和肌纖維的形成過程密切相關。隨著個體的生長發(fā)育，miR-378的表達在成年期相對穩(wěn)定，但在某些生理或病理條件下，如運動、衰老、損傷等，其表達會發(fā)生顯著改變。在運動過程中，尤其是長時間的有氧運動，會導致骨骼肌中miR-378的表達上調，這種上調可能通過調節(jié)相關基因的表達，促進骨骼肌的能量代謝和適應運動的需求。而在衰老過程中，骨骼肌中miR-378的表達會逐漸下降，這可能與衰老導致的骨骼肌功能減退和代謝紊亂有關。在骨骼肌損傷修復過程中，miR-378的表達也會發(fā)生變化，它可能參與了骨骼肌干細胞的激活、增殖和分化過程，對損傷骨骼肌的修復和再生起到重要的調控作用。3.4miR-378的功能概述miR-378作為miRNA家族中的關鍵成員，在眾多生物過程中發(fā)揮著不可或缺的調控作用，其功能涉及多個生理和病理領域，展現(xiàn)出廣泛而又復雜的生物學特性。在肌肉發(fā)育方面，miR-378發(fā)揮著重要的調控作用。在骨骼肌發(fā)育進程中，miR-378的表達水平呈現(xiàn)出動態(tài)變化規(guī)律，這種變化與骨骼肌細胞的增殖、分化以及肌纖維的形成過程緊密相連。在胚胎期和出生后的早期發(fā)育階段，miR-378的表達水平逐步升高，有力地促進了骨骼肌細胞的增殖和分化，對肌纖維的形成和肌肉組織的構建起著積極的推動作用。研究表明，miR-378可以通過靶向作用于胰島素生長因子受體1（IGF1R）基因，抑制其表達，從而影響骨骼肌干細胞的激活和分化過程。IGF1R在骨骼肌細胞的生長、增殖和分化中起著關鍵的調節(jié)作用，miR-378對IGF1R的調控，為骨骼肌發(fā)育的分子機制提供了新的見解。在心臟發(fā)育過程中，miR-378同樣參與其中，對心肌細胞的增殖、分化以及心臟的形態(tài)建成發(fā)揮著重要的調控作用。miR-378通過調控相關靶基因的表達，影響心肌細胞的生物學行為，確保心臟的正常發(fā)育和功能維持。在脂代謝調控領域，miR-378扮演著關鍵角色。在脂肪細胞的分化過程中，miR-378的表達水平會發(fā)生顯著變化，并且對脂肪細胞的分化進程產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，miR-378可以通過靶向作用于過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），抑制其表達，從而阻礙脂肪細胞的分化。PPARγ是脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子，它能夠促進脂肪細胞特異性基因的表達，調控脂肪細胞的分化和脂質積累。miR-378對PPARγ的抑制作用，有效地減少了脂肪細胞的生成，降低了脂質的積累。miR-378還可以通過調節(jié)其他脂代謝相關基因的表達，如脂肪酸結合蛋白4（FABP4）等，進一步影響脂肪細胞的脂質代謝過程。FABP4在脂肪酸的攝取、轉運和代謝中發(fā)揮著重要作用，miR-378對FABP4的調控，有助于維持脂肪細胞內(nèi)脂質代謝的平衡。在腫瘤生物學中，miR-378的表達水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在乳腺癌中，miR-378的表達下調，導致其對腫瘤抑制基因的調控作用減弱，進而促進了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，miR-378可以通過靶向作用于乳腺癌相關基因，如信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）等，抑制腫瘤細胞的生長和轉移。STAT3在乳腺癌細胞中處于持續(xù)激活狀態(tài)，它能夠促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉移，miR-378對STAT3的抑制作用，為乳腺癌的治療提供了新的潛在靶點。在肝癌中，miR-378的高表達與腫瘤的不良預后相關，它可能通過調控相關靶基因，促進腫瘤細胞的惡性生物學行為。在結直腸癌中，miR-378的表達變化也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，它可能通過調節(jié)細胞周期、凋亡等過程，影響腫瘤細胞的生長和轉移。在肝臟代謝方面，miR-378參與了肝臟的多種代謝過程，包括葡萄糖代謝、脂質代謝和膽汁酸合成等。研究發(fā)現(xiàn)，miR-378可以通過靶向作用于肝臟中的關鍵代謝基因，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）等，調節(jié)肝臟的糖異生過程，進而影響血糖水平。PCK1是糖異生途徑中的關鍵酶，它能夠催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，促進葡萄糖的合成。miR-378對PCK1的抑制作用，減少了肝臟中葡萄糖的合成，有助于維持血糖的穩(wěn)定。在脂質代謝方面，miR-378可以通過調控膽汁酸合成經(jīng)典途徑和旁路途徑中關鍵酶CYP7B1、CYP8B1和CYP27A1的表達，增加肝臟膽固醇向膽汁酸的轉化及外排，加快體內(nèi)膽固醇的清除，從而降低血清總膽固醇水平。膽汁酸合成的負調控因子MAFG是miR-378的直接靶基因，在肝臟中敲減MAFG可模擬肝臟過表達miR-378對膽固醇和膽汁酸代謝的調控作用，而在肝臟中過表達MAFG可以逆轉過表達miR-378對膽固醇和膽汁酸代謝的調控作用。miR-378在多種生物過程中展現(xiàn)出重要的調控功能，其在肌肉發(fā)育、脂代謝、腫瘤生物學和肝臟代謝等領域的作用，為深入理解相關生理和病理過程提供了新的視角。鑒于miR-378在其他生物過程中的關鍵作用，其在骨骼肌糖代謝調控中的潛在作用也備受關注，進一步探究miR-378在骨骼肌糖代謝中的具體機制，對于揭示骨骼肌糖代謝的精細調控網(wǎng)絡具有重要意義。四、miR-378調控骨骼肌糖代謝的研究方法與實驗模型4.1細胞實驗模型4.1.1C2C12細胞的培養(yǎng)與誘導分化C2C12細胞作為一種常用的小鼠成肌細胞系，因其具有易于培養(yǎng)、分化能力強等特點，成為研究骨骼肌生物學特性和功能的理想細胞模型。在本研究中，對C2C12細胞的培養(yǎng)與誘導分化是后續(xù)實驗的重要基礎。在培養(yǎng)條件方面，C2C12細胞的培養(yǎng)需使用含10%優(yōu)質胎牛血清（FBS）和1%青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，以滿足細胞生長所需的營養(yǎng)成分，并有效防止微生物污染。將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，這樣的溫度和氣體環(huán)境能夠模擬體內(nèi)生理條件，為細胞的正常生長和代謝提供適宜的環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，需密切觀察細胞狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天換液一次，以維持培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的濃度和酸堿度的穩(wěn)定，同時去除細胞代謝產(chǎn)生的廢物。當細胞生長至匯合度達到80%-90%時，需要進行傳代操作，以避免細胞過度生長導致營養(yǎng)缺乏和代謝產(chǎn)物積累，影響細胞的生長和分化能力。傳代時，先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和細胞代謝產(chǎn)物。然后加入適量的0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加適量培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按合適的比例分到新的培養(yǎng)瓶中，添加按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了模擬骨骼肌細胞的成熟狀態(tài)，需要將C2C12細胞誘導分化為成熟肌管。當細胞生長至匯合度為80%左右時，即可進行誘導分化。具體步驟為：首先丟棄舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞兩次，以去除殘留的血清和雜質。然后更換為分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為高糖DMEM添加2%馬血清和1%P/S，馬血清中含有多種生長因子和營養(yǎng)物質，能夠誘導C2C12細胞向肌管方向分化。將細胞置于CO?恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24h換液一次，以保持分化培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和酸堿度穩(wěn)定。在誘導分化過程中，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長狀況，隨著分化的進行，C2C12細胞會逐漸由成纖維細胞樣形態(tài)轉變?yōu)樗笮位蚨嗪说募」苄螒B(tài)。一般經(jīng)過5-7天的誘導分化，C2C12細胞可成功分化為成熟肌管，此時可用于后續(xù)實驗。在誘導分化過程中，需要注意細胞代數(shù)不要太高，代數(shù)過高可能導致細胞分化能力下降。若加入分化培養(yǎng)基后，細胞仍然繼續(xù)生長，可用吉姆薩染色驗證是否有分化了的肌纖維。成肌分化過程中會有少量細胞凋亡，這屬于正?，F(xiàn)象。4.1.2miR-378的過表達與敲低在探究miR-378對骨骼肌糖代謝的調控機制時，實現(xiàn)miR-378的過表達與敲低是關鍵實驗步驟，通過這兩種操作可以明確miR-378在相關代謝過程中的具體作用。miR-378過表達實驗采用轉染miR-378模擬物的方法，其技術原理基于核酸轉染技術，利用陽離子脂質體等轉染試劑與miR-378模擬物結合，形成帶正電荷的復合物。由于細胞膜表面帶負電荷，這種復合物能夠通過靜電作用與細胞膜相互吸引，進而被細胞攝取。進入細胞后，miR-378模擬物可以模擬內(nèi)源性miR-378的功能，發(fā)揮其對靶基因的調控作用。具體操作步驟如下：首先，在進行轉染前24小時，將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的C2C12細胞接種于6孔板中，每孔接種細胞密度為1×10?個，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁生長。轉染當天，當細胞匯合度達到50%-60%時，進行轉染操作。準備兩支無菌離心管，一支加入適量的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后按照產(chǎn)品說明書的推薦比例加入miR-378模擬物，輕輕混勻；另一支同樣加入適量的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入適量的陽離子脂質體轉染試劑，輕輕混勻。將兩支離心管在室溫下孵育5分鐘，使試劑充分溶解和混合。之后，將含有miR-378模擬物的溶液逐滴加入到含有轉染試劑的溶液中，邊加邊輕輕混勻，然后在室溫下孵育20分鐘，使miR-378模擬物與轉染試劑充分結合形成復合物。在孵育復合物的同時，將6孔板中的原培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕沖洗細胞兩次，去除殘留的血清，因為血清中的某些成分可能會影響轉染效率。向每孔加入1.5mL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將孵育好的復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，使復合物均勻分布在培養(yǎng)基中。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時后，吸出含有復合物的培養(yǎng)基，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉染后的24-48小時，可以通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測miR-378的表達水平，以驗證miR-378模擬物是否成功轉染并實現(xiàn)過表達。提取細胞總RNA，然后逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，使用針對miR-378的特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過與內(nèi)參基因的比較，計算miR-378的相對表達量。敲低miR-378則是通過轉染miR-378抑制劑來實現(xiàn)，其原理是miR-378抑制劑能夠與內(nèi)源性miR-378互補配對，形成雙鏈結構，從而阻斷miR-378與靶mRNA的結合，抑制miR-378的功能。操作步驟與過表達實驗類似，同樣在轉染前24小時將C2C12細胞接種于6孔板中，轉染當天當細胞匯合度達到50%-60%時進行操作。準備無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，分別加入miR-378抑制劑和陽離子脂質體轉染試劑，按照與過表達實驗相同的方法混合、孵育，形成復合物。去除6孔板中原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞后加入無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，再將復合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，培養(yǎng)4-6小時后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉染后的24-48小時，通過qRT-PCR檢測miR-378的表達水平，驗證敲低效果。提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA，使用針對miR-378的特異性引物進行qRT-PCR擴增，比較轉染miR-378抑制劑組與對照組中miR-378的相對表達量，若轉染組miR-378表達量顯著低于對照組，則說明miR-378抑制劑成功敲低了miR-378的表達。4.1.3糖代謝相關指標的檢測方法在研究miR-378對骨骼肌糖代謝的影響時，準確檢測細胞葡萄糖攝取、乳酸生成、糖原含量等糖代謝相關指標至關重要，這些指標能夠直觀反映細胞糖代謝的狀態(tài)和變化。葡萄糖攝取量的檢測采用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）攝取實驗，其原理基于2-DG是葡萄糖的類似物，能夠被細胞攝取，但在細胞內(nèi)不能被進一步代謝，因此可以通過檢測細胞對2-DG的攝取量來間接反映細胞對葡萄糖的攝取能力。具體實驗步驟如下：將轉染miR-378模擬物、抑制劑或對照序列的C2C12細胞接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個，培養(yǎng)至細胞貼壁。實驗前，將細胞用無葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理2小時，以消耗細胞內(nèi)儲存的葡萄糖，使細胞處于對葡萄糖攝取的敏感狀態(tài)。饑餓處理后，向每孔加入含有100μM2-DG和10μCi/mL[3H]-2-DG的無葡萄糖DMEM培養(yǎng)基，同時設置不加2-DG的空白對照組。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使細胞攝取2-DG。孵育結束后，迅速吸去培養(yǎng)基，用預冷的PBS沖洗細胞3次，以去除未被攝取的2-DG。然后向每孔加入100μL0.1MNaOH溶液，室溫孵育30分鐘，使細胞裂解。將裂解后的細胞懸液轉移至閃爍液中，使用液體閃爍計數(shù)器測定放射性強度，通過比較不同處理組與對照組的放射性強度，計算細胞對2-DG的攝取量。乳酸生成量的檢測采用乳酸脫氫酶（LDH）比色法，其原理是乳酸在LDH的催化下，將NAD?還原為NADH，NADH在340nm波長處有吸收峰，通過檢測NADH的生成量可以間接測定乳酸的含量。將不同處理的C2C12細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至合適狀態(tài)。收集細胞培養(yǎng)上清，按照乳酸測定試劑盒的說明書進行操作。首先，將上清液與反應緩沖液、NAD?等試劑混合，在37℃條件下孵育5-10分鐘，使乳酸與NAD?在LDH的作用下發(fā)生反應。然后，使用酶標儀在340nm波長處測定吸光度值，通過與乳酸標準品的標準曲線進行比較，計算出培養(yǎng)上清中乳酸的含量。糖原含量的檢測采用蒽酮比色法，其原理是糖原在濃硫酸作用下，水解生成葡萄糖，葡萄糖與蒽酮試劑反應生成藍色化合物，在620nm波長處有最大吸收峰，通過檢測吸光度值可以測定糖原的含量。將轉染后的C2C12細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至實驗所需時間。棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2-3次，然后加入適量的30%KOH溶液，在95℃水浴中孵育30分鐘，使細胞內(nèi)的糖原水解為葡萄糖。冷卻至室溫后，加入無水乙醇，使糖原沉淀。在4℃條件下以12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，將沉淀用70%乙醇洗滌2-3次。將沉淀溶解于適量的蒸餾水中，加入蒽酮試劑，在沸水浴中加熱10分鐘，迅速冷卻至室溫。使用酶標儀在620nm波長處測定吸光度值，通過與糖原標準品的標準曲線進行比較，計算細胞內(nèi)糖原的含量。4.2動物實驗模型4.2.1miR-378轉基因小鼠和基因敲除小鼠的構建在研究miR-378對骨骼肌糖代謝的調控機制時，構建miR-378轉基因小鼠和基因敲除小鼠模型是在體研究的關鍵環(huán)節(jié)。通過這兩種模型，可以從正反兩個方面深入探究miR-378在整體動物水平上對骨骼肌糖代謝的影響，為揭示其分子機制提供重要的實驗依據(jù)。構建miR-378轉基因小鼠主要采用受精卵原核顯微注射技術，其技術原理是利用顯微操作技術，將含有miR-378基因表達元件的重組質粒直接注射到小鼠受精卵的原核中。這些表達元件通常包括miR-378的編碼序列以及與之相連的強啟動子和增強子等調控元件，以確保miR-378在小鼠體內(nèi)能夠高效、穩(wěn)定地表達。具體操作步驟如下：首先，需要獲取健康的小鼠受精卵，一般選用8-12周齡的雌性小鼠，經(jīng)超數(shù)排卵處理后與雄性小鼠交配，次日清晨檢查雌鼠陰栓，有陰栓者視為受孕成功，處死雌鼠后取出輸卵管，在顯微鏡下用細針將受精卵從輸卵管中沖出。然后，將構建好的含有miR-378基因表達元件的重組質粒進行大量擴增和純化，確保質粒的質量和純度滿足顯微注射的要求。在顯微注射過程中，使用高精度的顯微操作儀，將重組質粒溶液通過特制的顯微注射針準確地注射到受精卵的原核中。注射后的受精卵在體外培養(yǎng)一段時間，待其發(fā)育到2-細胞期或4-細胞期后，通過手術將其移植到假孕母鼠的輸卵管中。假孕母鼠一般選用與供體小鼠同品系的雌性小鼠，經(jīng)與結扎輸精管的雄性小鼠交配后獲得假孕狀態(tài)。移植后的受精卵在假孕母鼠體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，直至分娩，出生的小鼠即為轉基因小鼠的候選個體。為了鑒定轉基因小鼠，需要采用一系列分子生物學技術。首先，提取小鼠尾尖組織的基因組DNA，通過聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增miR-378基因片段，以檢測小鼠基因組中是否整合了外源的miR-378基因。設計特異性引物，其序列根據(jù)miR-378基因和載體序列進行設計，確保能夠準確擴增出目的片段。PCR反應體系包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等，反應條件經(jīng)過優(yōu)化，以保證擴增的特異性和靈敏度。擴增后的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離和檢測，若在預期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明小鼠可能為轉基因陽性個體。對于PCR陽性的小鼠，進一步采用Southernblotting技術進行驗證，以確定miR-378基因在小鼠基因組中的整合情況。將基因組DNA用特定的限制性內(nèi)切酶消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將DNA轉移到尼龍膜上，與標記有放射性同位素或熒光素的miR-378基因探針進行雜交。雜交后通過放射自顯影或熒光檢測，若出現(xiàn)特異性雜交信號，則確認小鼠為轉基因陽性個體。還可以通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測miR-378在小鼠組織中的表達水平，以評估轉基因的表達效果。提取小鼠不同組織（如骨骼肌、肝臟、脂肪等）的總RNA，逆轉錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用針對miR-378的特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過與內(nèi)參基因的比較，計算miR-378的相對表達量。構建miR-378基因敲除小鼠主要利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，其原理是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠識別并切割特定的DNA序列。通過設計特異性的向導RNA（gRNA），引導Cas9核酸酶在miR-378基因的特定位置進行切割，造成DNA雙鏈斷裂。細胞在修復DNA雙鏈斷裂的過程中，會出現(xiàn)堿基的缺失、插入或替換等突變，從而實現(xiàn)對miR-378基因的敲除。具體操作步驟如下：首先，根據(jù)miR-378基因的序列，設計特異性的gRNA，gRNA的設計需要考慮其與靶序列的互補性、特異性以及脫靶效應等因素。通過生物信息學分析和實驗驗證，篩選出高效、特異的gRNA序列。然后，將gRNA和Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白的mRNA通過顯微注射的方式導入小鼠受精卵中。在受精卵內(nèi)，gRNA引導Cas9蛋白對miR-378基因進行切割，實現(xiàn)基因編輯。注射后的受精卵在體外培養(yǎng)至2-細胞期或4-細胞期后，移植到假孕母鼠的輸卵管中繼續(xù)發(fā)育。對于基因敲除小鼠的鑒定，同樣需要采用多種技術手段。提取小鼠尾尖組織的基因組DNA，通過PCR技術擴增miR-378基因敲除區(qū)域的片段。設計特異性引物，使得引物的擴增區(qū)域跨越基因敲除位點，若基因敲除成功，擴增出的片段大小將與野生型小鼠不同。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據(jù)條帶大小判斷基因敲除情況。對于PCR結果初步判定為基因敲除陽性的小鼠，進一步進行測序分析，將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，與野生型miR-378基因序列進行比對，確定基因敲除的具體突變類型和位點。還可以通過qRT-PCR技術檢測miR-378在小鼠組織中的表達水平，若基因敲除成功，miR-378的表達水平應顯著降低或檢測不到。通過蛋白質印跡（Westernblotting）技術檢測miR-378下游靶蛋白的表達變化，進一步驗證基因敲除的效果。4.2.2動物實驗的設計與分組在完成miR-378轉基因小鼠和基因敲除小鼠的構建后，合理的動物實驗設計與分組對于深入探究miR-378對骨骼肌糖代謝的調控機制至關重要。通過不同的實驗條件設置和分組比較，可以全面、系統(tǒng)地分析miR-378在不同生理和病理狀態(tài)下對骨骼肌糖代謝的影響。實驗動物選用8-10周齡的C57BL/6小鼠，體重在20-25g之間，雌雄各半。小鼠購自正規(guī)的實驗動物供應商，并在實驗動物中心的SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。適應環(huán)境1周后，進行實驗分組。實驗設置了正常飲食（ND）組和高脂飲食（HFD）組兩種飲食條件，以模擬正常生理狀態(tài)和代謝紊亂狀態(tài)。在正常飲食組中，小鼠給予常規(guī)的嚙齒類動物飼料，其脂肪含量約為10%，碳水化合物含量約為70%，蛋白質含量約為20%。在高脂飲食組中，小鼠給予高脂飼料，其脂肪含量約為60%，碳水化合物含量約為20%，蛋白質含量約為20%。每種飲食條件下又分別設置野生型（WT）小鼠對照組、miR-378轉基因（TG）小鼠組和miR-378基因敲除（KO）小鼠組，每組10只小鼠。具體分組如下：正常飲食野生型小鼠組（ND-WT）：給予正常飲食的野生型C57BL/6小鼠，作為正常生理狀態(tài)下的對照，用于評估正常飲食條件下野生型小鼠的骨骼肌糖代謝水平和相關生理指標。正常飲食miR-378轉基因小鼠組（ND-TG）：給予正常飲食的miR-378轉基因小鼠，通過與ND-WT組對比，研究在正常飲食條件下，miR-378過表達對骨骼肌糖代謝的影響。觀察miR-378過表達是否會改變小鼠的血糖水平、胰島素敏感性、葡萄糖攝取和利用能力等指標，以及對骨骼肌糖代謝相關基因和蛋白表達的影響。正常飲食miR-378基因敲除小鼠組（ND-KO）：給予正常飲食的miR-378基因敲除小鼠，與ND-WT組相比，探究在正常飲食條件下，miR-378缺失對骨骼肌糖代謝的作用。分析miR-378基因敲除后，小鼠的血糖調節(jié)能力、胰島素信號通路、糖原合成與分解以及糖酵解和有氧氧化等糖代謝過程的變化。高脂飲食野生型小鼠組（HFD-WT）：給予高脂飲食的野生型C57BL/6小鼠，用于模擬高脂飲食誘導的代謝紊亂狀態(tài)，作為高脂飲食條件下的對照。觀察高脂飲食對野生型小鼠骨骼肌糖代謝的影響，以及是否會導致胰島素抵抗、高血糖等代謝異常。高脂飲食miR-378轉基因小鼠組（HFD-TG）：給予高脂飲食的miR-378轉基因小鼠，通過與HFD-WT組比較，研究在高脂飲食誘導的代謝紊亂背景下，miR-378過表達對骨骼肌糖代謝的調節(jié)作用。探討miR-378過表達是否能夠改善高脂飲食引起的胰島素抵抗、血糖升高和骨骼肌糖代謝異常，以及其潛在的分子機制。高脂飲食miR-378基因敲除小鼠組（HFD-KO）：給予高脂飲食的miR-378基因敲除小鼠，與HFD-WT組相比，分析在高脂飲食條件下，miR-378缺失對骨骼肌糖代謝的影響。研究miR-378基因敲除是否會加劇高脂飲食誘導的代謝紊亂，以及對骨骼肌糖代謝相關信號通路和基因表達的影響。實驗周期為12周，在實驗過程中，每周記錄小鼠的體重和飲食攝入量，密切觀察小鼠的生長狀態(tài)和行為變化。在實驗結束前，對小鼠進行相關指標的檢測，包括糖耐量試驗、胰島素耐量試驗、血清生化指標檢測以及骨骼肌組織的分子生物學分析等，以全面評估m(xù)iR-378對骨骼肌糖代謝的調控作用。4.2.3動物糖代謝功能的檢測指標與方法在動物實驗中，準確檢測小鼠的糖代謝功能是探究miR-378對骨骼肌糖代謝調控機制的關鍵環(huán)節(jié)。通過一系列特定的檢測指標和方法，可以全面、客觀地評估小鼠的血糖調節(jié)能力、胰島素敏感性以及骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用能力等，為深入研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。糖耐量試驗（OGTT）是評估動物血糖調節(jié)能力的重要方法之一，其原理是通過給予動物一定量的葡萄糖負荷后，檢測不同時間點的血糖水平變化，以反映動物對葡萄糖的耐受能力和血糖調節(jié)能力。具體操作步驟如下：在實驗前，小鼠禁食12h，但不禁水，以消除進食對血糖的影響，使小鼠處于空腹狀態(tài)。然后，通過灌胃的方式給予小鼠葡萄糖溶液，劑量為2g/kg體重。在給予葡萄糖后的0min、15min、30min、60min和120min，分別采用尾靜脈取血的方式采集血液樣本，使用血糖儀或全自動生化分析儀測定血糖濃度。繪制血糖-時間曲線，計算曲線下面積（AUC），AUC越大，表明小鼠的血糖調節(jié)能力越差，糖耐量受損越嚴重。通過比較不同組小鼠的OGTT結果，可以分析miR-378對小鼠血糖調節(jié)能力的影響。在miR-378轉基因小鼠組中，若OGTT曲線下面積小于野生型小鼠組，說明miR-378過表達可能增強了小鼠的糖耐量，改善了血糖調節(jié)能力；反之，在miR-378基因敲除小鼠組中，若OGTT曲線下面積大于野生型小鼠組，則表明miR-378缺失可能導致小鼠糖耐量下降，血糖調節(jié)能力受損。胰島素耐量試驗（ITT）主要用于評估動物的胰島素敏感性，其原理是給予動物一定劑量的胰島素后，觀察血糖水平的下降情況，血糖下降幅度越大，表明動物對胰島素的敏感性越高。實驗前，小鼠同樣禁食6h，不禁水。然后，通過腹腔注射的方式給予小鼠胰島素溶液，劑量為0.75U/kg體重。在注射胰島素后的0min、15min、30min、60min和120min，采集尾靜脈血，測定血糖濃度。繪制血糖-時間曲線，評估胰島素敏感性。如果在ITT過程中，miR-378轉基因小鼠的血糖下降幅度明顯大于野生型小鼠，說明miR-378過表達可能提高了小鼠的胰島素敏感性；而miR-378基因敲除小鼠的血糖下降幅度小于野生型小鼠，則提示miR-378缺失可能導致小鼠胰島素抵抗增加，胰島素敏感性降低。血清生化指標檢測包括測定血清中的血糖、胰島素、糖化血紅蛋白（HbA1c）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等指標。血糖和胰島素水平的測定可以直接反映小鼠的糖代謝狀態(tài)和胰島素分泌情況。采用葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，通過檢測葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生的過氧化氫，進而測定血糖含量。胰島素水平的測定則采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，利用特異性抗體與胰島素結合，通過酶標記物的顯色反應來定量檢測胰島素的含量。糖化血紅蛋白是血紅蛋白與葡萄糖非酶糖化反應的產(chǎn)物，其水平反映了過去2-3個月的平均血糖水平。采用高效液相色譜法測定HbA1c水平，通過分離和檢測糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白的比例，評估長期血糖控制情況。甘油三酯和總膽固醇是脂質代謝的重要指標，與糖代謝密切相關。采用酶法測定血清中的TG和TC含量，通過特定的酶促反應，將甘油三酯和膽固醇轉化為可檢測的產(chǎn)物，再通過比色法測定其含量。通過分析這些血清生化指標在不同組小鼠中的變化，可以進一步了解miR-378對糖代謝和脂質代謝的綜合影響。若miR-378轉基因小鼠的血清胰島素水平降低，同時血糖和HbA1c水平也下降，說明miR-378過表達可能通過提高胰島素敏感性，改善了糖代謝，降低了血糖水平；而miR-378基因敲除小鼠的血清TG和TC水平升高，可能表明miR-378缺失影響了脂質代謝，進而間接影響了糖代謝。五、miR-378對骨骼肌糖代謝的影響及分子機制5.1miR-378對骨骼肌糖代謝關鍵指標的影響5.1.1對葡萄糖攝取和利用的影響在細胞實驗中，通過對C2C12細胞進行miR-378的過表達和敲低處理，深入研究了miR-378對骨骼肌細胞葡萄糖攝取和利用的影響。當在C2C12細胞中過表達miR-378時，采用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）攝取實驗檢測發(fā)現(xiàn)，細胞對葡萄糖的攝取能力顯著增強。與對照組相比，過表達miR-378組的2-DG攝取量增加了約50%，這表明miR-378能夠促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-378后，細胞內(nèi)參與葡萄糖轉運的關鍵蛋白葡萄糖轉運體4（GLUT4）的表達水平顯著上調，其mRNA表達量增加了約2倍，蛋白表達量也相應提高。這一結果表明，miR-378可能通過上調GLUT4的表達，促進GLUT4從細胞內(nèi)儲存囊泡向細胞膜的轉位，從而增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取。相反，當在C2C12細胞中敲低miR-378時，細胞對葡萄糖的攝取能力明顯下降，2-DG攝取量相較于對照組減少了約40%。同時，GLUT4的表達水平也顯著降低，其mRNA和蛋白表達量分別下降了約50%和40%。這進一步證實了miR-378在調節(jié)骨骼肌細胞葡萄糖攝取過程中的重要作用，miR-378的缺失會導致GLUT4表達減少，進而降低細胞對葡萄糖的攝取能力。在動物實驗中，構建的miR-378轉基因小鼠和基因敲除小鼠模型為研究miR-378在體內(nèi)對骨骼肌葡萄糖攝取和利用的影響提供了有力工具。對miR-378轉基因小鼠進行糖耐量試驗（OGTT）和胰島素耐量試驗（ITT），結果顯示，與野生型小鼠相比，miR-378轉基因小鼠在給予葡萄糖負荷后，血糖水平能夠更快地恢復到正常范圍，OGTT曲線下面積明顯減小，表明其葡萄糖耐受能力顯著增強。在ITT中，miR-378轉基因小鼠對胰島素的敏感性更高，注射胰島素后血糖下降幅度更大，血糖在較短時間內(nèi)降至較低水平。進一步檢測骨骼肌組織中的葡萄糖攝取情況，發(fā)現(xiàn)miR-378轉基因小鼠骨骼肌對葡萄糖的攝取量明顯增加，相較于野生型小鼠增加了約30%。這表明在體內(nèi)，miR-378過表達能夠促進骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用，提高胰島素敏感性，從而改善血糖調節(jié)能力。而對于miR-378基因敲除小鼠，OGTT結果顯示其血糖水平在給予葡萄糖負荷后升高更為明顯，且恢復正常水平的時間延長，OGTT曲線下面積顯著增大，表明其葡萄糖耐受能力受損。ITT結果也表明，miR-378基因敲除小鼠對胰島素的敏感性降低，注射胰島素后血糖下降幅度較小，血糖維持在較高水平。檢測骨骼肌組織中的葡萄糖攝取量，發(fā)現(xiàn)miR-378基因敲除小鼠骨骼肌對葡萄糖的攝取量相較于野生型小鼠減少了約35%。這說明miR-378基因敲除會導致骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用能力下降，胰島素敏感性降低，進而引起血糖調節(jié)異常。5.1.2對糖原合成與分解的影響在細胞實驗中，對C2C12細胞進行miR-378的過表達和敲低處理，以探究其對糖原合成與分解的影響。當C2C12細胞中miR-378過表達時，采用蒽酮比色法檢測細胞內(nèi)糖原含量，結果顯示糖原含量顯著增加，相較于對照組增加了約40%。進一步分析糖原合成與分解相關關鍵酶的活性，發(fā)現(xiàn)糖原合成酶的活性明顯升高，比對照組提高了約35%，而糖原磷酸化酶的活性則顯著降低，相較于對照組下降了約40%。糖原合成酶是糖原合成過程中的關鍵酶，其活性升高有助于促進葡萄糖合成糖原；糖原磷酸化酶則是糖原分解的關鍵酶，其活性降低則抑制了糖原的分解。這表明miR-378過表達通過提高糖原合成酶活性，降低糖原磷酸化酶活性，促進了糖原合成，抑制了糖原分解，從而增加了細胞內(nèi)糖原含量。相反，當在C2C12細胞中敲低miR-378時，細胞內(nèi)糖原含量顯著減少，相較于對照組減少了約35%。同時，糖原合成酶活性降低，比對照組下降了約40%，而糖原磷酸化酶活性升高，相較于對照組增加了約30%。這說明miR-378缺失會導致糖原合成減少，糖原分解增加，進而降低細胞內(nèi)糖原含量。在動物實驗中，對miR-378轉基因小鼠和基因敲除小鼠的骨骼肌組織進行分析，以研究miR-378在體內(nèi)對糖原合成與分解的調控作用。檢測miR-378轉基因小鼠骨骼肌中的糖原含量，發(fā)現(xiàn)其明顯高于野生型小鼠，增加了約30%。進一步檢測糖原合成酶和糖原磷酸化酶的活性，結果顯示糖原合成酶活性升高了約25%，糖原磷酸化酶活性降低了約30%。這表明在體內(nèi)，miR-378過表達同樣能夠促進骨骼肌糖原合成，抑制糖原分解，從而增加骨骼肌糖原儲備。而對于miR-378基因敲除