細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實驗篇四第一頁，共28頁。一、VSVTCID50滴定第二頁，共28頁。實驗?zāi)康恼莆詹《綯CID50滴定的基本原理和計算方法熟悉病毒TCID50的應(yīng)用第三頁，共28頁。實驗原理多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，常引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞團縮、裂解、細(xì)胞腫大或脫落等，這種改變稱為病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)。TCID50

（50%tissuecultureinfectiousdose)是病毒毒力的傳統(tǒng)表示法，即能在50%組織細(xì)胞培養(yǎng)孔或試管內(nèi)引起細(xì)胞病變所需的病毒最高稀釋度。第四頁，共28頁。TCID50滴定法是50%（50%endpoint)終點法測定病毒滴度的方法之一，是將病毒懸浮液經(jīng)一系列稀釋后，接種至培養(yǎng)成的單層細(xì)胞，將每個稀釋度造成的細(xì)胞病變做成曲線，找出造成50%細(xì)胞病變的終點稀釋度。第五頁，共28頁。實驗材料細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞株病毒：水泡性口炎病毒（VSV)試劑：DMEM培養(yǎng)液(或RPMI1640)，小牛血清，PBS，VTP材料：細(xì)胞板，微量移液器，tip頭第六頁，共28頁。實驗步驟細(xì)胞的制備與培養(yǎng)(已完成）病毒的稀釋與接種結(jié)果觀察與計算:結(jié)果的記錄時間為感染細(xì)胞的病變不再進展為止，不同的病毒不一樣，本實驗所用的水泡性口炎病毒（VSV)增殖較快，一般48小時左右即可觀察染色。計算方法常用的有Reed-Muench法。第七頁，共28頁。制備細(xì)胞(已經(jīng)完成）：按傳代細(xì)胞培養(yǎng)的方法制備Hep-2細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度約為1×106/ml。用微量移液器將細(xì)胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，形成良好的單層。病毒稀釋：用含3%小牛血清的DMEM(或RPMI1640）維持液將待測病毒VSV作連續(xù)10倍稀釋，依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。第八頁，共28頁。12345671.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml10-110-210-310-410-510-610-7稀釋病毒液待測VSVDMEM維持液管號稀釋度第九頁，共28頁。病毒接種：將長好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液全部傾棄，用微量加樣器將各稀釋度VSV病毒液加入相應(yīng)孔中，每孔100μl，每個稀釋度加2孔。同時設(shè)細(xì)胞對照孔，不加病毒液，只加維持液。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl10-110-210-310-410-510-610-712345678

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CDMEM維持液復(fù)孔試驗孔第十頁，共28頁。結(jié)果觀察：于培養(yǎng)后的不同時間，18h、24h、48h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病變不再發(fā)展時記錄結(jié)果，細(xì)胞病變程度表示法如下：-：表示無細(xì)胞病變+：表示1%～25%的細(xì)胞有病變++：表示26%～50%的細(xì)胞有病變+++：表示51%～75%的細(xì)胞有病變++++：表示76%～100%的細(xì)胞有病變第十一頁，共28頁。Reed-Muench法計算TCID50，舉例如下：病毒稀釋度病變數(shù)/接種數(shù)累積數(shù)（孔）累計病變細(xì)胞孔有病變無病變比例百分比（%）10-38/818018/1810010-46/810210/128310-54/8464/104010-60/80140/140由上表可知病毒的TCID50介于10-4與10-5兩個稀釋度之間，兩稀釋度之間的距離比計算如下：病毒稀釋度10-110-210-310-410-510-610-710-810-9C細(xì)胞病變++++++++++++++++++-----細(xì)胞病變++++++++++++++++-----第十二頁，共28頁。

高于50%病變的百分?jǐn)?shù)-50%距離比例=-×lg稀釋倍數(shù)

高于50%病變的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變的百分?jǐn)?shù)

83-50=-×lg10=-0.76783-40lgTCID50=高于50%病變的稀釋度的對數(shù)+距離比例=(-4)+(-0.767)=-4.767則該病毒的TCID50=10-4.767/0.1ml，即此病毒的10-4.767的濃度（1∶63000）0.1ml接種一組細(xì)胞孔后，可使50%的細(xì)胞感染病變。如何計算200TCID50？200TCID50=63000/200=315，將病毒作315倍稀釋時即得200TCID50的病毒液。第十三頁，共28頁。注意事項不同的病毒應(yīng)選用各自敏感的細(xì)胞。接種病毒前細(xì)胞單層必須良好。接種病毒時應(yīng)從低濃度向高濃度方向加樣，防止跳管現(xiàn)象。第十四頁，共28頁。二、干擾素效價測定（一）（8組做此實驗）第十五頁，共28頁。實驗?zāi)康恼莆瘴⒘考?xì)胞病變抑制法測定干擾素效價的基本步驟以及結(jié)果分析。熟悉常用生物制品生物學(xué)活性測定的實際意義。了解影響結(jié)果的常見因素。

第十六頁，共28頁。實驗原理何謂干擾素？

病毒或其他干擾素誘生劑作用于人或動物的白細(xì)胞、T細(xì)胞或成纖維細(xì)胞后，刺激細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽，統(tǒng)稱為干擾素。具有間接的廣譜抗病毒作用。實驗原理第十七頁，共28頁。為了進一步確定人工方法制備的干擾素的生物學(xué)活性，需進行體外抗病毒試驗測定，即干擾素效價的測定。干擾素效價一般定義為：若1ml干擾素標(biāo)本的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細(xì)胞（50％）免受“攻擊病毒”損害，則該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價，表示為單位/毫升。實驗原理第十八頁，共28頁。測定干擾素效價的方法有多種，最常用的是“細(xì)胞病變抑制法”（MethodofCytopathiceffectinhibitionassay）。此法的主要優(yōu)點是操作簡便，易于掌握，結(jié)果可靠，故已成為目前各實驗室的常規(guī)。亦可用“放射化學(xué)測定法”、“染料攝入測定法”。

全量細(xì)胞病變抑制測定法、常規(guī)微量細(xì)胞病變抑制測定法、微量快速檢測法（一步快速法)

第十九頁，共28頁。實驗材料待測標(biāo)本：本室制備的動物干擾素測定細(xì)胞：人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2）攻擊病毒：100TCID50VSV其它材料：DMEM液、VTP、小牛血清、雙抗、40孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量移液器、tip頭、10ml吸管等。第二十頁，共28頁。實驗步驟稀釋待檢干擾素：待測干擾素先作稀釋后，然后在40孔板中作倍比稀釋。微量單層細(xì)胞培養(yǎng)：按傳代細(xì)胞的方法制備4×105/ml的Hep-2細(xì)胞懸液，由低稀釋度向高稀釋度的順序向上述各孔加100μl細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，形成良好的單層。第二十一頁，共28頁?？滋?2345678cv營養(yǎng)液（μl）100100100100100100100100100100干擾素（μl）100100100100100100100100--干擾素稀釋度1∶21∶41∶81∶161∶321∶641∶1281∶256棄去100細(xì)胞懸液（μl）10010010010010010010010010010037℃，5%CO2，24h——

傾棄培養(yǎng)液100TCID50VSV（μl）100100100100100100100100100維持液10037℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞病變不再發(fā)展第二十二頁，共28頁。三、中和試驗（一）（7組做此實驗）—稀釋血清固定病毒法第二十三頁，共28頁。實驗?zāi)康臏y定血清中的VSV中和抗體效價第二十四頁，共28頁。實驗原理特異的抗病毒免疫血清（中和抗體）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價的中和抗體。根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量（100TCID50）與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗，以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對數(shù)稀釋的病毒進行中和試驗。結(jié)果以中和指數(shù)表示。第二十五頁，共28頁。實驗材料VSV免疫動物血清：S1、S2100TCID50VSV病毒懸液稀釋液、40孔平底細(xì)胞板、H