Protein

蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)或一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而來(lái)

——第一重要，首要的物質(zhì)蛋白質(zhì)存在于所有生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程。一、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類(lèi)１、元素組成２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%

蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)

6.25凱氏定氮法３、蛋白質(zhì)的分類(lèi)（1）、依據(jù)外形分類(lèi)球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein

膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

（2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類(lèi)簡(jiǎn)單蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成結(jié)合蛋白

conjugatedprotein由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成簡(jiǎn)

單

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin

廣泛存在于動(dòng)物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細(xì)胞核硬蛋白

結(jié)

合

蛋

白色蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+色素物質(zhì)糖蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+糖類(lèi)物質(zhì)脂蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+脂類(lèi)結(jié)合核蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+核酸（二）、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運(yùn)功能-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、谷蛋白5.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能最為顯著的是結(jié)構(gòu)上的差別。（三）、蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子。有些蛋白質(zhì)僅由一條多肽鏈構(gòu)建，如溶菌酶和肌紅蛋白，這些蛋白質(zhì)稱(chēng)為單體蛋白質(zhì)。有些蛋白質(zhì)是由兩條或多條多肽鏈構(gòu)成，如血紅蛋白，這些蛋白質(zhì)稱(chēng)為寡聚或多聚蛋白質(zhì)，其中每條多肽鏈稱(chēng)為亞基。蛋白質(zhì)與多肽無(wú)嚴(yán)格的界線

——通常將6000Dr以上的多肽稱(chēng)為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500對(duì)于不含輔基的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，用110除它的Mr即可約估計(jì)其氨基酸殘基的數(shù)目。蛋白質(zhì)中20種氨基酸的平均Mr約為138，但大多數(shù)蛋白質(zhì)中較小的氨基酸占優(yōu)勢(shì)，因此平均Mr接近128。又因每形成一個(gè)肽鍵將除去一分子水，所以氨基酸殘基的平均Mr約為110。（四）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸序列，也包括多肽鏈中連接氨基酸殘基的共價(jià)鍵，主要是肽鍵和二硫鍵。胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵排列成有規(guī)則的α螺旋和β折疊等元件。三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借非共價(jià)力折疊成特定走向的球狀實(shí)體，即一條多肽鏈的完整三維結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)：具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基借助非共價(jià)力彼此締合成寡聚或多聚蛋白質(zhì)。二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱(chēng)肽鍵，所形成的化合物稱(chēng)肽。二硫鍵

在蛋白質(zhì)和多肽分子中連接氨基酸殘基的共價(jià)鍵除肽鍵外，還有一個(gè)較常見(jiàn)的是在兩個(gè)半胱氨酸殘基側(cè)鏈之間形成的二硫鍵（disulfidebond），也稱(chēng)為二硫橋（disulfidebridge）由兩個(gè)AA組成的肽稱(chēng)為二肽。由多個(gè)AA組成的肽則稱(chēng)為多肽。組成多肽的AA單元稱(chēng)為氨基酸殘基。多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離

-氨基的一端：氨基端或N-端含游離

-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開(kāi)始以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)

——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長(zhǎng)及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式結(jié)構(gòu)存在共價(jià)主鏈

（二）、肽的物理化學(xué)性質(zhì)肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點(diǎn)（兩性）。酸堿性質(zhì)取決于：

—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團(tuán)的解離

具有雙縮脲反應(yīng)——Pr特有的反應(yīng)。雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。利用分光光度儀的540nm處進(jìn)行比色測(cè)定可對(duì)蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行定量。

旋光性蛋白質(zhì)水解后所得的肽段，只要水解過(guò)程中手性碳原子不發(fā)生消旋，都具有旋光性。一般來(lái)說(shuō)，短肽的旋光度約等于組成該肽的各氨基酸旋光度的總和。但是較長(zhǎng)的肽或蛋白質(zhì)的旋光度則不等于其組成氨基酸旋光度的簡(jiǎn)單加和。（三）、天然存在的重要多肽生物體內(nèi)存在很多活性肽，它們具有各種特殊的生物學(xué)功能。如很多激素屬于肽類(lèi)，催產(chǎn)素、血管升壓素和舒緩激肽等（見(jiàn)后續(xù)的激素章節(jié)）。如有些抗生素也屬于肽類(lèi)或肽的衍生物，放線菌素D。環(huán)狀8肽，是真核生物的RNA聚合酶II和III的抑制劑，但不影響原核生物RNA的合成。谷胱甘肽存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)（故常簡(jiǎn)寫(xiě)為G-SH），易與某些藥物（如撲熱息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子氣，鉛、汞、砷等重金屬）等結(jié)合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有廣譜解毒作用，不僅可用于藥物，更可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定什么是Pr的一級(jí)結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質(zhì)的分子量3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成4.測(cè)定蛋白質(zhì)的AA組成并根據(jù)分子量計(jì)算每種AA的個(gè)數(shù)5.測(cè)定水解液中的氨量計(jì)算酰胺的含量前提（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(1)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(3)

斷開(kāi)二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(4)測(cè)定每條多肽鏈的AA組成，并計(jì)算出AA成分的分子比

（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽

斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定兩類(lèi)多肽鏈末端氨基酸殘基：

N-端氨基酸

C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測(cè)定Sanger法1、末端分析

二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色二甲氨基萘磺酰-AA有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高

丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)

苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無(wú)水HF苯異硫氰酸酯PITC肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個(gè)向里水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的AA種類(lèi)和數(shù)量，

按反應(yīng)時(shí)間和AA殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線

蛋白質(zhì)N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶

—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N肼化物可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)①

肼解法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C多肽與無(wú)水肼加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成酰肼化物。酰肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。上清液中的游離C-末端氨基酸借助FDNB法或DNS法以及層析技術(shù)進(jìn)行鑒定。（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C

C末端AAα氨基醇②

還原法硼氫化鋰肽鏈C-末端氨基酸也可用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的α-氨基醇。肽鏈完全水解后，代表原來(lái)C-末端氨基酸的α-氨基醇，可用層析法加以鑒定。肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個(gè)水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的AA種類(lèi)和數(shù)量

蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；

A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基

∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵

③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C（三）、二硫鍵的斷裂由于二硫鍵干擾多肽鏈的酶促裂解和化學(xué)斷裂以及Edman法的肽鏈測(cè)序，因此需要斷裂二硫鍵。鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力。應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。1、酸水解（四）、氨基酸組成的分析2、堿水解1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解

（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化R1=Lys（K）和Arg（R）專(zhuān)一性較強(qiáng)，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶trypsinR1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān):酸性：-/堿性：+R2=Phe（F）、

Trp（W）、

Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快肽鏈水解位點(diǎn)R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、

Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快

R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶Pepsin肽鏈水解位點(diǎn)羧肽酶和氨肽酶2、化學(xué)裂解法

①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解②NH2OH斷裂：較專(zhuān)一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵

Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分?jǐn)嗔?/p>

3、肽段的分離純化：

凝膠過(guò)濾、凝膠電泳和HPLC法N-端分析法

特點(diǎn)：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測(cè)定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。PITCPTC-肽2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質(zhì)譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測(cè)定速度快基本原理：使待測(cè)樣品在質(zhì)譜儀的離子源中通過(guò)一定方式發(fā)生電離，形成帶電的分子或分子碎片，再借助電場(chǎng)或磁場(chǎng)的作用使這些離子依質(zhì)荷比(m/z)的不同獲得分離，并按質(zhì)荷比大小為序沖擊檢測(cè)器，在記錄儀圖紙橫坐標(biāo)上的相應(yīng)m/z處以峰或線的形式出現(xiàn)，峰高反應(yīng)給定m/z的離子數(shù)目，以縱坐標(biāo)上的相對(duì)強(qiáng)度表示。電噴射電離儀質(zhì)荷比核糖體蛋白質(zhì)鏈4.根據(jù)核苷酸序列的推定法（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（overlapingpeptide）胃蛋白酶處理沒(méi)有