第二章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應器演示文稿第一頁，共七十七頁。生物反應器生物反應器的一些概念生物反應器的基本類型第二頁，共七十七頁。第二章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應器學時：2節(jié)課主要內(nèi)容：常用培養(yǎng)方法動物細胞培養(yǎng)的操作方式細胞培養(yǎng)過程的放大動物細胞培養(yǎng)生物放大器第三頁，共七十七頁。動物細胞培養(yǎng)開始于上世紀初1962年,其規(guī)模逐漸擴大,發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法(生產(chǎn)酶、生長因子、疫苗和單抗等)。相關知識介紹利用動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術產(chǎn)品市場份額的50%。

第四頁，共七十七頁。發(fā)展：在過去幾十年來，從使用轉瓶(rollerbottle)、CellCube等貼壁細胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應器（Bioreactor）進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易導致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性三是難以對同批生產(chǎn)進行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。

第一代細胞培養(yǎng)技術核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！第五頁，共七十七頁。隨著生物技術的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細胞表達產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足所需細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。自70年代以來，較常見的細胞培養(yǎng)生物反應器有空氣提升反應器，中空纖維管反應器，無泡攪拌反應器及籃式生物反應器等。80年代以來，人們逐漸開始以生物反應器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。

第六頁，共七十七頁。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術：（large-scaleculturetechnology）定義：指在人工條件下（設定pH、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術。通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術培養(yǎng)哺乳類動物細胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法第七頁，共七十七頁。雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞人二倍體細胞cho（中華倉鼠卵巢）細胞BHK-21(倉鼠腎細胞)Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等?？纱笠?guī)模培養(yǎng)的動物細胞第八頁，共七十七頁。第九頁，共七十七頁。個性化培養(yǎng)基是胞細培養(yǎng)基的發(fā)展方向第十頁，共七十七頁。圖8.1細胞培養(yǎng)瓶圖8.3細胞工廠Spinner培養(yǎng)系統(tǒng)第十一頁，共七十七頁?？谔阋咭呙纭⒖袢∫呙?、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品：第十二頁，共七十七頁。6.原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡

第一節(jié)常用的培養(yǎng)方法動物細胞生長特性：1.細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差3.需氧少，不耐受強力通風與攪拌4.群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高第十三頁，共七十七頁?！穹琴N壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。

依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，動物細胞可分為兩類：●貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。第十四頁，共七十七頁?！百N壁單核”細胞培養(yǎng)貼壁的單核細胞貼壁細胞細胞培養(yǎng)的人參愈傷組織第十五頁，共七十七頁。知識回顧一般步驟：無菌取出目的細胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細胞。低速離心洗滌細胞后，將目的細胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)步驟第十六頁，共七十七頁。植物細胞（組織）培養(yǎng)流程懸浮細胞培養(yǎng)提取純化產(chǎn)物脫分化：離體植物器官、組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織（細胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細胞）。收集細胞藥物制劑通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長春堿、洋地黃、紫草素、人參皂甙等第十七頁，共七十七頁。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)工藝流程圖細胞培養(yǎng)反應器提取細胞誘生劑細胞產(chǎn)品（腫瘤抗原）純化產(chǎn)品（干擾素）純化提取產(chǎn)品（單克隆抗體）濃縮純化79865432110第十八頁，共七十七頁。大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的方法：貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)固定化培養(yǎng)

第十九頁，共七十七頁。一、貼壁培養(yǎng)（attachmentculture）細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。

1、生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。

貼壁培養(yǎng)細胞轉瓶機第二十頁，共七十七頁。第二十一頁，共七十七頁。2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液：細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當細胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。

●同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。

●適用于所有類型細胞。第二十二頁，共七十七頁。灌注培養(yǎng)第二十三頁，共七十七頁。

3、貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比，

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細胞的生長；

第二十四頁，共七十七頁。

4、細胞貼壁的表面：

要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

第二十五頁，共七十七頁。

5、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：

主要有轉瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

貼壁培養(yǎng)細胞轉瓶機細胞轉瓶培養(yǎng)器第二十六頁，共七十七頁。

轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：

為最初采用系統(tǒng)，一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養(yǎng)器——轉瓶中，培養(yǎng)過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。

轉瓶機第二十七頁，共七十七頁。轉瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制。

優(yōu)點：結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需簡單的增加轉瓶數(shù)量等。缺點：第二十八頁，共七十七頁。

二、懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）

指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等，是在微生物發(fā)酵的基礎上發(fā)展起來的。

小規(guī)模懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)瓶第二十九頁，共七十七頁。用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。無血清懸浮培養(yǎng)第三十頁，共七十七頁。三、固定化培養(yǎng)（immobilizationculture）：

將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養(yǎng)。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細胞易與產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。

第三十一頁，共七十七頁。

1、吸附法:

用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的方法。缺點：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。第三十二頁，共七十七頁。

2、共價貼附法:

利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法（attachmentbycovalentbonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致擴散限制小，細胞得不到保護。第三十三頁，共七十七頁。3、離子/共價交聯(lián)法:

雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯(lián)法（cross-linkingbycovalentbonding）。交聯(lián)試劑會使一些細胞死亡，也會產(chǎn)生擴散限制。

第三十四頁，共七十七頁。4、包埋法:

將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點：擴散限制，并非所有細胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

第三十五頁，共七十七頁。石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋法甲基丙烯酸甲酯包埋標本微囊型包埋法第三十六頁，共七十七頁。5、微囊法（microencapsulation）:

用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。第三十七頁，共七十七頁。第三十八頁，共七十七頁。第二節(jié)大規(guī)模培養(yǎng)技術的操作方式

深層培養(yǎng)可分為:分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式連續(xù)式灌注式第三十九頁，共七十七頁。一、分批式培養(yǎng)（batchculture）較早期的方式，采用機械攪拌式生物反應器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉入生物反應器內(nèi)進行培養(yǎng)

一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。

特點:操作簡單，培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小直觀反映細胞生長代謝的過程?？芍苯臃糯蟆５谒氖?，共七十七頁。細胞的生長分：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期五個階段。分批培養(yǎng)的周期多在3-5天，細胞生長動力學表現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（48-72h）細胞密度達到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進行。

第四十一頁，共七十七頁。二、流加式培養(yǎng)（feedingculture）

細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。

第四十二頁，共七十七頁。1、流加培養(yǎng)物的方式流加的時間通常在指數(shù)生長后期，細胞進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。可以添加一次，也可添加多次，凡是促細胞生長的物質(zhì)均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分既不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導致細胞生長抑制或死亡。

第四十三頁，共七十七頁。2、流加工藝中的營養(yǎng)成分（三大類）：

●葡萄糖：供能物質(zhì)、碳源物質(zhì)，濃度較高則產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。●谷氨酰胺：供能物質(zhì)、氮源物質(zhì)，需要控制濃度。大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因?！癜被?、維生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。第四十四頁，共七十七頁。三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuousculture）

1、又稱重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應器內(nèi)的總體積不變。

第四十五頁，共七十七頁。

2、半連續(xù)式特點：

●培養(yǎng)物的體積逐步增加；

●可進行多次收獲；

●細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。

優(yōu)點：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應用。第四十六頁，共七十七頁。四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuousculture）

1、常見的懸浮培養(yǎng)模式：采用機械攪拌式生物反應器系統(tǒng)。在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基（防止衰退期出現(xiàn)）；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。第四十七頁，共七十七頁。

2、連續(xù)式培養(yǎng)的特點：

●細胞維持持續(xù)指數(shù)增長；

●產(chǎn)物體積不斷增長；

●可控制衰退期與下降期。

連續(xù)式培養(yǎng)第四十八頁，共七十七頁。3、優(yōu)點：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件可維持不變（如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率）。細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。

第四十九頁，共七十七頁。

4、不足：

●由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染；

●在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；

●對設備、儀器的控制技術要求較高。第五十頁，共七十七頁。五、灌流式培養(yǎng)（perfusionculture）

1、把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。

第五十一頁，共七十七頁。一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)細胞，這種反應器必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。

如：中空纖維生物反應器灌流式培養(yǎng)用生物反應器主要有兩種形式：第五十二頁，共七十七頁。中空纖維半透膜可透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應器內(nèi)；近年中空纖維生物反應器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。中空纖維反應器示意圖細胞培養(yǎng)基出口空氣與CO2出口空氣與CO2入口培養(yǎng)基入口第五十三頁，共七十七頁。固定床是在反應器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。

另一種形式是固定床或流化床生物反應器第五十四頁，共七十七頁。軸向絕熱式

徑向絕熱式

列管式固定床反應器：氣體流經(jīng)固定不動的催化劑床層進行催化反應的裝置流化床反應器：固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左右劇烈運動和翻動，好象是液體沸騰一樣，故流化床反應器又稱沸騰床反應器。1—旋風分離器2—筒體擴大段3—催化劑入口4—筒體5—冷卻介質(zhì)出口6—換熱器7—冷卻介質(zhì)進口8—氣體分布板9—催化劑出口10—反應氣入口

第五十五頁，共七十七頁。

2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：

●細胞截流系統(tǒng)可使細胞或酶保留在反應器內(nèi)，維持較高的細胞密度，一般可達107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；

●連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；

●反應速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高；

●產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。第五十六頁，共七十七頁。

六、細胞工廠培養(yǎng)聚苯乙烯材料，無菌，長度335mm，寬度205mm第五十七頁，共七十七頁。這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚苯乙烯制成，使用后可隨意處理。其最大缺點是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細胞完全洗出。

第五十八頁，共七十七頁。第四節(jié)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應器簡介

動物細胞培養(yǎng)技術能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關鍵在于能否設計出合適的生物反應器。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細胞生長及細胞進行產(chǎn)物的合成。細胞培養(yǎng)罐第五十九頁，共七十七頁。一、生物反應器分類

1.懸浮培養(yǎng)用反應器：如攪拌反應器、中空纖維反應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器、氣升式反應器；2.貼壁培養(yǎng)用反應器：如攪拌反應器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應器、中空纖維反應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器；3.包埋培養(yǎng)用反應器：如流化床反應器、固化床反應器。按其培養(yǎng)細胞的方式不同，可分三類：第六十頁，共七十七頁。二、攪拌罐生長反應器

最經(jīng)典、最早被采用。針對動物細胞培養(yǎng)的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞。第六十一頁，共七十七頁。三、氣升式生物反應器

1979年首次成功應用氣升式生物反應器進行了動物細胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應器的優(yōu)點：

●罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細胞損傷較??；

●可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；

●液體循環(huán)量大，細胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；

●結構簡單，利于密封并降低了造價。第六十二頁，共七十七頁。四、鼓泡式生物反應器

與氣升式反應器相類似，是利用氣體鼓泡來進行供氧及混合，其設計原理與氣升式生物反應器也相同。

第六十三頁，共七十七頁。五、中空纖維生物反應器用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。第六十四頁，共七十七頁。

優(yōu)點：

●占地空間少；

●細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級；

●生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細胞。板框式中空纖維反應器

液營養(yǎng)

中空纖維板第六十五頁，共七十七頁。注意幾個問題：(一)細胞培養(yǎng)環(huán)境(1)氨離子：細胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：高乳酸濃度必將抑制細胞生長(3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平。(4)甲基乙二醛(Mc)：對細胞有潛在的損傷作用(5)滲透壓：恒定、適宜(6)載體：可考慮采用多孔徑載體替代容易使細胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。第六十六頁，共七十七頁。(二)細胞死亡與凋亡大規(guī)模細胞培養(yǎng)的后期，維持細胞高的活力是個富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認識到至少是一些細胞系在生物反應器中死亡主要原因是細胞凋亡。

用基因工程方法將bcl—2基因這種細胞凋亡抑制基因?qū)爰毎?，bcl—2基因的過量表達能抑制細胞凋亡，提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)條件下，可通過“細胞靜止”過程來降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。

第六十七頁，共七十七頁。(三)培養(yǎng)基與細胞系動物細胞培養(yǎng)基是細胞賴以生長、增殖的重要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基開發(fā)成為當今細胞領域的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對細胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應用領域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。第六十八頁，共七十七頁。(四)過程監(jiān)控測量在線氧吸收速率確定從細胞生長期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細胞死亡后終止感染的轉換時間；用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度；測定氧消耗估計營養(yǎng)供應率的代謝負荷；測定氧吸收速率估測ATP的形成；測量在線氧化還原能力作為活細胞濃度的指標等均得以應用。第六十九頁，共七十七頁。測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計算呼吸商。一般來說，呼吸商應接近1.0，這就要求細胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進行在線蛋白質(zhì)含量測定。另外，用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。第七十頁，共七十七頁。計數(shù)法(細胞運輸)當前培養(yǎng)細胞既在國內(nèi)進行寄贈、交換和購買，也在國際交流，為此需要裝運細胞的方法。一種是用液氮或干冰貯存運輸，需要特殊容器，較麻煩，且不適于長時間運行。另一方法為充液法，方便當行，是當前多采用的方法。

具體方法：選生長狀態(tài)良好的細胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運輸時大氣泡來回流動對細胞有干擾作用。

一般經(jīng)4～5天運輸對細胞活力無大影響。時間過長,細胞活力下降。到達后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細胞生長所需的液體量。置37攝氏度培養(yǎng)，次日傳代。第七十一頁，共七十七頁。十一動物細胞體外培養(yǎng)舉例

腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程體外培養(yǎng)腫瘤細胞的歷史一定程度上代表了動物細胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。