卡介菌多糖核酸對急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達影響的機制探究一、引言1.1研究背景支氣管哮喘（bronchialasthma）簡稱哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病。近年來，支氣管哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，全球約有3億哮喘患者，預(yù)計到2025年，這一數(shù)字將增加到4億。我國哮喘患病率也不容樂觀，國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，哮喘發(fā)生率在0.31%-3.38%之間。哮喘的發(fā)作不僅會導(dǎo)致患者出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀，嚴重影響其生活質(zhì)量，還可能引發(fā)呼吸驟停、呼吸衰竭、氣胸、縱隔氣腫等嚴重并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致猝死，給患者的生命健康帶來巨大威脅。因此，深入研究哮喘的發(fā)病機制并尋找有效的治療方法具有重要的臨床意義。以往研究認為，輔助性T細胞1（Th1）/Th2比例失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機制。然而，近年來隨著研究的不斷深入，一種以產(chǎn)生白細胞介素17（IL-17）為主要細胞因子的Th17細胞在哮喘發(fā)病機制中的作用逐漸受到關(guān)注。Th17細胞是CD4+T細胞的一個亞群，其分泌的IL-17具有強大的促炎作用。在哮喘患者中，Th17細胞數(shù)量增多，IL-17表達水平升高，可誘導(dǎo)氣道中性粒細胞性炎癥、杯狀細胞增生、黏液高分泌、肌纖維母細胞分化和氣道平滑肌增生肥大，從而導(dǎo)致氣道炎癥和氣道重塑，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?？ń榫嗵呛怂幔˙CG-PSN）是從卡介菌中提取的一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，主要成分包括多糖和核酸。臨床研究表明，BCG-PSN對預(yù)防和治療慢性支氣管炎、哮喘、感冒等呼吸系統(tǒng)疾病具有較好療效。其作用機制主要包括調(diào)節(jié)機體的細胞免疫和體液免疫，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活單核巨噬細胞功能，增強自然殺傷細胞功能，從而增強機體的抗病能力；穩(wěn)定肥大細胞，封閉IgE功能，減少脫顆粒細胞釋放活性物質(zhì)，以及具有抗乙酰膽堿所致的支氣管痙攣作用，達到抗過敏和平喘的效果。然而，目前關(guān)于BCG-PSN對哮喘治療作用的研究主要集中在整體水平和常規(guī)免疫指標的觀察上，對于其在細胞和分子水平上的作用機制，尤其是對哮喘中關(guān)鍵細胞因子IL-17表達的影響，尚未完全明確。因此，本研究旨在探討卡介菌多糖核酸對急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達的影響，為進一步揭示其治療哮喘的作用機制提供實驗依據(jù)，也為哮喘的臨床治療提供新的思路和方法。1.2研究目的本研究旨在通過建立急性哮喘小鼠模型，觀察卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）對急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達的影響，并與地塞米松進行對比，探討B(tài)CG-PSN治療哮喘的作用機制，為臨床治療哮喘提供新的理論依據(jù)和治療思路。具體而言，一方面，明確BCG-PSN是否能夠調(diào)節(jié)急性哮喘小鼠體內(nèi)異常升高的CD4+T細胞IL-17表達水平，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)；另一方面，通過與臨床上廣泛應(yīng)用的糖皮質(zhì)激素地塞米松進行對照研究，分析BCG-PSN在降低IL-17表達方面的效果及特點，評估其在哮喘治療中的潛在優(yōu)勢和應(yīng)用價值。此外，深入探究BCG-PSN影響IL-17表達的具體細胞和分子機制，進一步揭示其治療哮喘的作用途徑，為開發(fā)更有效的哮喘治療藥物提供實驗基礎(chǔ)和理論支持。二、理論基礎(chǔ)2.1支氣管哮喘概述支氣管哮喘，簡稱哮喘，是一種由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的發(fā)生和發(fā)展，臨床上主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀，常在夜間或清晨發(fā)作或加劇，同時伴有可變的氣流受限。哮喘是一種具有多基因遺傳傾向的疾病，患者自身的過敏體質(zhì)與外界環(huán)境的相互影響是發(fā)病的重要因素。常見的誘發(fā)因素包括吸入性變應(yīng)原（如花粉、塵螨、動物毛發(fā)皮屑、霉菌等）、食入性變應(yīng)原（如魚蝦、牛奶、蛋類等）、呼吸道感染（如病毒、細菌、支原體感染等）、藥物（如阿司匹林等）、氣候變化、運動、精神因素等。哮喘的病理特征主要包括以下幾個方面：炎性細胞浸潤：在哮喘發(fā)作時，氣道內(nèi)會出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，其中嗜酸性粒細胞在過敏性哮喘中起著關(guān)鍵作用，它可以釋放多種毒性蛋白和炎性介質(zhì)，如嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、主要堿性蛋白等，損傷氣道上皮細胞，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。肥大細胞也是重要的炎性細胞，當(dāng)受到過敏原刺激時，肥大細胞會脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理變化。此外，T淋巴細胞、中性粒細胞等也參與了哮喘的炎癥過程，T淋巴細胞可以分泌多種細胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，中性粒細胞則在非過敏性哮喘或重癥哮喘中發(fā)揮重要作用。氣道高反應(yīng)性：氣道高反應(yīng)性是哮喘的重要特征之一，指氣道對各種刺激因子如過敏原、理化因素、運動、藥物等呈現(xiàn)出高度敏感狀態(tài)，表現(xiàn)為氣道平滑肌收縮增強、氣道狹窄，從而導(dǎo)致喘息、氣急等癥狀。氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機制較為復(fù)雜，主要與氣道炎癥、神經(jīng)調(diào)節(jié)失衡、氣道平滑肌功能異常等因素有關(guān)。炎癥介質(zhì)的釋放可以刺激氣道神經(jīng)末梢，使氣道神經(jīng)敏感性增高，同時，氣道平滑肌細胞對收縮物質(zhì)的反應(yīng)性增強，也會導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的出現(xiàn)。氣道重塑：長期的哮喘炎癥會導(dǎo)致氣道重塑，這是一個涉及氣道結(jié)構(gòu)改變的慢性過程。主要表現(xiàn)為氣道上皮細胞損傷、基底膜增厚、平滑肌增生肥大、細胞外基質(zhì)沉積、血管生成增加等。氣道重塑會使氣道壁增厚、僵硬，管腔狹窄，導(dǎo)致不可逆的氣流受限，嚴重影響肺功能，增加哮喘治療的難度。在哮喘的發(fā)病機制中，免疫失衡起著關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)觀點認為，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機制。Th1細胞主要分泌干擾素γ（IFN-γ）等細胞因子，參與細胞免疫，對細胞內(nèi)病原體感染具有重要防御作用；Th2細胞主要分泌白細胞介素4（IL-4）、IL-5、IL-13等細胞因子，介導(dǎo)體液免疫和過敏反應(yīng)。在哮喘患者中，Th2細胞功能亢進，Th1細胞功能相對不足，導(dǎo)致Th1/Th2比例失衡。Th2細胞分泌的IL-4可以促進B細胞產(chǎn)生IgE，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的受體結(jié)合，使這些細胞致敏。當(dāng)再次接觸過敏原時，過敏原與致敏細胞表面的IgE結(jié)合，導(dǎo)致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，引發(fā)哮喘的一系列癥狀。IL-5則可以促進嗜酸性粒細胞的生長、分化和活化，使其在氣道內(nèi)聚集和浸潤，加重氣道炎癥。近年來，越來越多的研究表明，Th17/IL-17在哮喘的發(fā)病機制中也發(fā)揮著重要作用。Th17細胞是CD4+T細胞的一個亞群，其分化和增殖主要受到IL-6、IL-23和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等細胞因子的調(diào)控。維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt（RORγt）是Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Th17細胞主要分泌IL-17，包括IL-17A、IL-17F等，此外還分泌IL-21、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子。IL-17具有強大的促炎作用，它可以誘導(dǎo)氣道上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等分泌多種細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）等，招募和活化中性粒細胞，導(dǎo)致氣道中性粒細胞性炎癥。IL-17還可以促進杯狀細胞增生，導(dǎo)致黏液高分泌，引起氣道堵塞；刺激肌纖維母細胞分化和氣道平滑肌增生肥大，參與氣道重塑過程。在哮喘患者中，尤其是非Th2優(yōu)勢型哮喘患者，Th17細胞數(shù)量增多，IL-17表達水平升高，與哮喘的病情嚴重程度密切相關(guān)。Th17/IL-17軸的異常激活打破了機體的免疫平衡，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。2.2CD4+T細胞與IL-17CD4+T細胞作為免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵細胞，在機體免疫反應(yīng)中扮演著至關(guān)重要的角色。其表面表達CD4分子，這一標志性分子使其能夠與抗原呈遞細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞等）表面的主要組織相容性復(fù)合體II類分子（MHC-II）相結(jié)合，從而識別抗原肽-MHC-II復(fù)合物，啟動免疫應(yīng)答。CD4+T細胞具有多種功能，它不僅能夠輔助B細胞產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，還能激活巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞，增強細胞免疫功能。在免疫應(yīng)答過程中，CD4+T細胞可根據(jù)其分泌的細胞因子和功能的不同，分化為多個亞群，如Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）等。這些不同的亞群在免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著各自獨特的作用。Th17細胞作為CD4+T細胞的一個重要亞群，其分泌的IL-17在炎癥反應(yīng)中具有強大的促炎作用。IL-17家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（也稱為IL-25）和IL-17F等多個成員，其中IL-17A和IL-17F是研究最為廣泛且與炎癥關(guān)系最為密切的細胞因子。在哮喘等炎癥性疾病中，IL-17主要由Th17細胞分泌，此外，γδT細胞、固有淋巴細胞等也可產(chǎn)生少量IL-17。IL-17的促炎機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面：誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生：IL-17可以作用于氣道上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞類型，誘導(dǎo)它們分泌一系列細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、G-CSF、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等。IL-6是一種多功能的細胞因子，它可以促進T細胞和B細胞的活化、增殖，增強免疫反應(yīng)，同時還能誘導(dǎo)急性期蛋白的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)。IL-8是一種重要的趨化因子，對中性粒細胞具有強烈的趨化作用，能夠吸引中性粒細胞向炎癥部位聚集，引發(fā)氣道中性粒細胞性炎癥。G-CSF可以促進粒細胞的增殖、分化和成熟，增加中性粒細胞的數(shù)量，進一步加劇炎癥反應(yīng)。MCP-1則主要趨化單核細胞，使其在炎癥部位浸潤，釋放多種炎性介質(zhì)，參與炎癥過程。促進中性粒細胞的募集和活化：IL-17通過誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，招募中性粒細胞到炎癥部位。中性粒細胞在炎癥部位聚集后，IL-17可以增強其活性，使其釋放大量的活性氧物質(zhì)（ROS）、蛋白酶等，這些物質(zhì)可以直接損傷氣道組織，破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致氣道炎癥的加重。此外，中性粒細胞還可以釋放炎性介質(zhì)，如白三烯B4（LTB4）等，進一步吸引更多的炎性細胞浸潤，形成炎癥的惡性循環(huán)。參與氣道重塑：在哮喘的發(fā)展過程中，IL-17可以刺激肌纖維母細胞分化和氣道平滑肌增生肥大，促進細胞外基質(zhì)的合成和沉積，導(dǎo)致氣道壁增厚、僵硬，管腔狹窄，從而參與氣道重塑過程。氣道重塑是哮喘病情加重和難以控制的重要原因之一，IL-17在其中發(fā)揮的作用不容忽視。IL-17還可以促進杯狀細胞增生，導(dǎo)致黏液高分泌，過多的黏液在氣道內(nèi)積聚，容易堵塞氣道，進一步影響肺通氣功能。2.3卡介菌多糖核酸作用機制卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，其作用機制較為復(fù)雜，涉及多個方面，對機體的免疫功能和生理病理過程產(chǎn)生重要影響。在免疫調(diào)節(jié)方面，BCG-PSN能夠?qū)C體的細胞免疫和體液免疫進行雙向調(diào)節(jié)。從細胞免疫角度來看，它可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，增強巨噬細胞的吞噬能力和抗原呈遞功能。巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中的重要細胞，能夠吞噬和清除病原體、衰老細胞等，同時將抗原信息呈遞給T細胞，啟動細胞免疫應(yīng)答。BCG-PSN通過激活巨噬細胞，使其釋放更多的細胞因子，如白細胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，這些細胞因子可以進一步激活T淋巴細胞，促進T細胞的增殖和分化，增強T細胞的免疫活性。對于自然殺傷細胞（NK細胞），BCG-PSN能夠增強其細胞毒活性，使其更好地發(fā)揮殺傷腫瘤細胞、病毒感染細胞等作用。NK細胞是機體固有免疫的重要組成部分，無需預(yù)先接觸抗原即可直接殺傷靶細胞，在抗病毒、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用。在體液免疫方面，BCG-PSN可以調(diào)節(jié)B淋巴細胞的功能，促進其產(chǎn)生抗體。它通過影響T細胞對B細胞的輔助作用，調(diào)節(jié)B細胞的活化、增殖和分化，從而使機體產(chǎn)生適量的抗體，增強體液免疫應(yīng)答，提高機體對病原體的抵抗力。穩(wěn)定肥大細胞是BCG-PSN的重要作用之一。肥大細胞廣泛分布于皮膚、呼吸道、胃腸道等黏膜組織中，其表面表達大量的IgE受體。當(dāng)機體接觸過敏原時，過敏原與IgE結(jié)合，導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，引發(fā)過敏反應(yīng)。BCG-PSN可以穩(wěn)定肥大細胞的細胞膜，降低其對過敏原的敏感性，減少脫顆?，F(xiàn)象的發(fā)生。具體來說，BCG-PSN可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，影響肥大細胞的活化過程，從而抑制炎性介質(zhì)的釋放。BCG-PSN還能夠封閉IgE的功能，減少IgE與肥大細胞表面受體的結(jié)合，進一步減輕過敏反應(yīng)的程度。BCG-PSN具有抗過敏作用，這與其調(diào)節(jié)免疫功能和穩(wěn)定肥大細胞密切相關(guān)。通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，抑制Th2細胞過度活化，減少IL-4、IL-5等細胞因子的分泌，從而降低IgE的產(chǎn)生，減輕過敏反應(yīng)。它還可以抑制嗜酸性粒細胞的活化和聚集，減少嗜酸性粒細胞釋放的毒性蛋白和炎性介質(zhì)，減輕對組織的損傷。在哮喘等過敏性疾病中，嗜酸性粒細胞的浸潤是重要的病理特征之一，BCG-PSN對嗜酸性粒細胞的抑制作用有助于緩解氣道炎癥?？挂阴Ｄ憠A所致的支氣管痙攣是BCG-PSN平喘的重要作用機制之一。乙酰膽堿是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在氣道中，乙酰膽堿與氣道平滑肌上的M受體結(jié)合，可引起氣道平滑肌收縮，導(dǎo)致支氣管痙攣。BCG-PSN能夠阻斷乙酰膽堿與M受體的結(jié)合，或者抑制乙酰膽堿引起的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減輕氣道平滑肌的收縮，緩解支氣管痙攣，達到平喘的效果。BCG-PSN還可以通過調(diào)節(jié)氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，降低氣道神經(jīng)的敏感性，減少因神經(jīng)因素導(dǎo)致的支氣管痙攣發(fā)作。三、實驗設(shè)計3.1實驗動物與分組本研究選用SPF級雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，體重18-22g。選擇BALB/c小鼠作為實驗動物，主要是因為其在免疫學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對多種抗原具有良好的免疫反應(yīng)性，能夠較好地模擬人類哮喘的免疫病理過程。雌性小鼠在激素水平等因素影響下，對哮喘相關(guān)炎癥反應(yīng)更為敏感，炎癥表現(xiàn)更為顯著，有利于實驗結(jié)果的觀察和分析。將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，具體分組如下：正常對照組：給予生理鹽水腹腔注射及霧化吸入，作為正常生理狀態(tài)的對照，用于對比其他實驗組小鼠在哮喘造模及干預(yù)后的生理變化。哮喘未干預(yù)組：采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法建立急性哮喘模型，但不給予任何藥物干預(yù)，用于觀察哮喘自然發(fā)展過程中CD4+T細胞IL-17的表達變化。哮喘BCG-PSN干預(yù)組：在建立急性哮喘模型的基礎(chǔ)上，給予卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）進行干預(yù)，觀察BCG-PSN對哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達的影響。哮喘地塞米松干預(yù)組：建立急性哮喘模型后，給予地塞米松進行干預(yù)。地塞米松是臨床上常用的糖皮質(zhì)激素類藥物，具有強大的抗炎、抗過敏作用，作為陽性對照，用于對比BCG-PSN的治療效果，分析兩者在降低IL-17表達方面的差異。3.2主要試劑與儀器主要試劑：卵清蛋白（OVA，GradeV，Sigma公司），用于致敏和激發(fā)小鼠建立哮喘模型；氫氧化鋁凝膠（Sigma公司），作為佐劑，增強OVA的免疫原性，促進小鼠對OVA的免疫反應(yīng)；卡介菌多糖核酸（BCG-PSN，成都金星健康藥業(yè)有限公司），純度≥90%，是本研究的主要干預(yù)藥物，用于探究其對哮喘小鼠的治療作用；地塞米松（天津天藥藥業(yè)股份有限公司），作為陽性對照藥物，用于對比BCG-PSN的治療效果；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，HyClone公司），用于稀釋試劑、清洗細胞等實驗操作；RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司），添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Gibco公司），用于細胞培養(yǎng)，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境；刀豆蛋白A（ConA，Sigma公司），用于刺激T細胞增殖和活化，作為實驗中的陽性刺激物；佛波酯（PMA，Sigma公司）和離子霉素（Ionomycin，Sigma公司），聯(lián)合使用可刺激T細胞分泌細胞因子，用于后續(xù)檢測IL-17表達的實驗；小鼠IL-17酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（eBioscience公司），用于定量檢測小鼠血清或細胞培養(yǎng)上清中IL-17的含量；熒光標記的抗小鼠CD4抗體、抗小鼠IL-17抗體（BDBiosciences公司），用于流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞中IL-17的表達；Trizol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進行PCR檢測；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司），用于實時熒光定量PCR，檢測IL-17mRNA的表達水平。主要儀器：流式細胞儀（BDFACSCalibur，美國BD公司），用于檢測細胞表面標志物和細胞內(nèi)細胞因子的表達，分析CD4+T細胞中IL-17的陽性表達率；酶標儀（Bio-Rad680，美國Bio-Rad公司），用于ELISA實驗中讀取吸光度值，定量檢測IL-17的含量；實時熒光定量PCR儀（ABI7500，美國AppliedBiosystems公司），用于檢測IL-17mRNA的表達水平，通過擴增特定基因片段，實時監(jiān)測熒光信號的變化，從而定量分析基因表達量；CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientific，美國Thermo公司），提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO2濃度，用于細胞培養(yǎng)；高速冷凍離心機（Eppendorf5424，德國Eppendorf公司），用于離心分離細胞、血清等生物樣品；超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），將OVA溶液霧化成微小顆粒，用于小鼠哮喘模型的激發(fā)；電子天平（SartoriusBS224S，德國Sartorius公司），精確稱量試劑、藥品等實驗材料。3.3急性哮喘小鼠模型建立參照經(jīng)典的OVA誘導(dǎo)哮喘模型建立方法并加以優(yōu)化，具體操作如下：在實驗的第0天和第7天，對哮喘未干預(yù)組、哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組小鼠進行致敏操作。將OVA與氫氧化鋁凝膠按照一定比例混合，用生理鹽水配制成混懸液，其中OVA的終濃度為100μg/mL，氫氧化鋁凝膠的終濃度為10mg/mL。每只小鼠腹腔注射0.2mL該混懸液，使小鼠致敏。在第14天開始進行激發(fā)操作，將小鼠置于自制的密閉霧化箱內(nèi)，采用超聲霧化器將1%OVA溶液霧化，使小鼠持續(xù)吸入OVA霧化氣體30分鐘，每日1次，連續(xù)激發(fā)7天。通過這種方式，模擬哮喘患者在接觸過敏原后引發(fā)的氣道炎癥和高反應(yīng)性，成功建立急性哮喘小鼠模型。正常對照組小鼠在相應(yīng)時間點給予等體積的生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，不進行OVA致敏和激發(fā)，作為正常生理狀態(tài)的對照。在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等，記錄小鼠出現(xiàn)的哮喘相關(guān)癥狀，如呼吸急促、喘息、咳嗽、煩躁不安、毛發(fā)豎起、口唇紫紺等。通過這些觀察指標，初步判斷哮喘模型是否成功建立。3.4樣本采集與處理在末次激發(fā)24小時后，對小鼠進行處理。首先，將小鼠用1%戊巴比妥鈉溶液按0.1mL/10g體重的劑量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，進行氣管插管。用預(yù)冷的PBS（pH7.4）通過氣管插管緩慢注入小鼠氣管內(nèi)，每次0.5mL，反復(fù)沖洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），將收集到的BALF置于1.5mL離心管中，4℃、1500r/min離心10分鐘，收集上清液，用于后續(xù)檢測IL-17濃度。將離心后的細胞沉淀用0.5mLPBS重懸，取20μL細胞懸液，加入適量臺盼藍染色液，混勻后滴加到血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下進行細胞計數(shù)，計算細胞總數(shù)。隨后，取適量細胞懸液進行涂片，自然晾干后，用瑞氏-姬姆薩染色液染色10-15分鐘，在顯微鏡下進行細胞學(xué)分類計數(shù)，分別計算嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等各類細胞的比例。接著，將小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出脾臟，置于盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中。用眼科剪將脾臟剪成小塊，再用注射器芯輕輕研磨，使脾細胞通過200目細胞篩網(wǎng)，制成單個核細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1500r/min離心10分鐘，棄上清。加入適量紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫靜置3-5分鐘，裂解紅細胞。裂解完成后，加入適量PBS終止反應(yīng)，4℃、1500r/min離心10分鐘，棄上清。用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10^7個/mL。采用免疫磁珠分離法分離脾源性CD4+T細胞，具體操作按照磁珠分離試劑盒說明書進行。將分離得到的CD4+T細胞用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，并重懸于適量培養(yǎng)液中，用于后續(xù)實驗。3.5檢測指標與方法流式細胞儀檢測Th17細胞陽性率：將分離得到的脾源性CD4+T細胞調(diào)整細胞濃度為1×10^6個/mL，取100μL細胞懸液加入流式管中。加入熒光標記的抗小鼠CD4抗體，室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入適量的PBS洗滌細胞2次，4℃、1500r/min離心5分鐘，棄上清。再加入含有固定破膜劑的緩沖液，按照說明書操作進行固定和破膜處理，室溫孵育15-20分鐘。破膜完成后，加入熒光標記的抗小鼠IL-17抗體，室溫避光孵育30分鐘。孵育后用PBS洗滌細胞2次，重懸于500μLPBS中，上機檢測。流式細胞儀通過檢測細胞表面和細胞內(nèi)熒光信號，分析CD4+T細胞中IL-17陽性細胞（即Th17細胞）的比例。其原理是基于抗原抗體特異性結(jié)合，熒光標記的抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，在激光激發(fā)下發(fā)出熒光，流式細胞儀根據(jù)熒光信號的強度和細胞的物理參數(shù)（如前向散射光、側(cè)向散射光）對細胞進行分類和計數(shù)。ELISA法測定脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清液和BALF中的IL-17濃度：按照ELISA試劑盒說明書進行操作。首先，將包被有抗IL-17抗體的96孔酶標板平衡至室溫。分別取脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清液和BALF樣品以及不同濃度的IL-17標準品100μL加入相應(yīng)的孔中，設(shè)置復(fù)孔。將酶標板輕輕振蕩混勻后，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標板5次，每次浸泡3-5分鐘，拍干。加入100μL生物素化的抗IL-17抗體工作液，37℃孵育1小時。再次洗滌酶標板5次后，加入100μL辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素工作液，37℃孵育30分鐘。洗滌5次后，加入100μL底物溶液（TMB），37℃避光孵育15-20分鐘，使底物顯色。最后，加入50μL終止液（2MH2SO4）終止反應(yīng)，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中IL-17的濃度。ELISA法的原理是基于抗原抗體的特異性結(jié)合，通過酶標記的抗體與抗原結(jié)合，利用酶催化底物顯色，顏色的深淺與樣品中抗原的含量成正比，從而實現(xiàn)對樣品中IL-17濃度的定量檢測。WesternBlot測定脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白表達：取適量脾源性CD4+T細胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。裂解完成后，4℃、12000r/min離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30分鐘，在酶標儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在冰浴條件下，以恒定電流進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，將膜與一抗（兔抗小鼠IL-17抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。然后將膜與二抗（HRP標記的羊抗兔IgG抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定）室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。通過分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算IL-17蛋白的相對表達量。WesternBlot的原理是利用SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，通過抗原抗體特異性結(jié)合，用標記的二抗檢測一抗，最后通過化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)檢測目的蛋白的表達。RealTimePCR測定脾源性CD4+T細胞中IL-17mRNA表達：采用Trizol試劑提取脾源性CD4+T細胞總RNA，按照試劑說明書操作。取適量細胞，加入1mLTrizol試劑，充分吹打混勻，室溫靜置5分鐘。加入200μL***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000r/min離心15分鐘，吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000r/min離心10分鐘，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次，每次4℃、7500r/min離心5分鐘。晾干RNA沉淀后，用適量的無RNA酶水溶解。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書操作，將RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑混合，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行RealTimePCR擴增。IL-17引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’；內(nèi)參基因β-actin引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和無核酸酶水。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。在PCR反應(yīng)過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過比較Ct值（循環(huán)閾值），以β-actin為內(nèi)參，采用2^(-ΔΔCt)法計算IL-17mRNA的相對表達量。RealTimePCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，隨著PCR反應(yīng)的進行，熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，實現(xiàn)對基因表達量的定量檢測。四、實驗結(jié)果4.1小鼠一般行為與氣道反應(yīng)性在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的一般行為表現(xiàn)。正常對照組小鼠活動自如，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順滑，進食、飲水正常，無明顯的異常行為。而哮喘未干預(yù)組小鼠在OVA激發(fā)后，出現(xiàn)了一系列類似于人的哮喘發(fā)作癥狀。具體表現(xiàn)為：激發(fā)初期，小鼠表現(xiàn)得較為興奮，頻繁抓耳、打噴嚏，隨著激發(fā)時間的延長，小鼠逐漸出現(xiàn)嗜睡、少動的癥狀，進食量明顯減少。部分小鼠還出現(xiàn)呼吸急促、喘息，呼吸頻率明顯加快，可達正常小鼠的2-3倍，鼻翼扇動，胸廓起伏明顯，嚴重時可見口唇及四肢末梢發(fā)紺。這些癥狀表明哮喘未干預(yù)組小鼠成功出現(xiàn)了哮喘相關(guān)的病理生理變化，哮喘模型建立成功。在進行氣道反應(yīng)性檢測時，采用霧化吸入Ach行支氣管激發(fā)試驗。通過有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道阻力，結(jié)果顯示：正常對照組小鼠在不同濃度Ach激發(fā)下，氣道阻力變化較小，其濃度反應(yīng)曲線較為平穩(wěn)。而哮喘未干預(yù)組小鼠對Ach刺激反應(yīng)明顯增強。當(dāng)吸入低濃度Ach時，哮喘未干預(yù)組小鼠的氣道阻力就開始顯著升高，隨著Ach濃度的增加，氣道阻力進一步增大，其濃度反應(yīng)曲線上移。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與正常對照組相比，哮喘未干預(yù)組小鼠在各個濃度Ach激發(fā)下的氣道阻力均有顯著差異（均P＜0.01）。這表明哮喘未干預(yù)組小鼠的氣道對Ach的敏感性明顯增高，氣道反應(yīng)性增強，符合哮喘的典型特征。4.2肺組織病理變化取小鼠左肺組織，用10%中性福爾馬林固定24小時后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。染色完成后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。正常對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管黏膜上皮完整，無明顯損傷，纖毛排列整齊，氣道及血管周圍未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔無增厚。哮喘未干預(yù)組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變。支氣管及血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，這些炎性細胞包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。其中，嗜酸性粒細胞數(shù)量明顯增多，其細胞核呈分葉狀，胞質(zhì)內(nèi)含有粗大的橘紅色嗜酸性顆粒。中性粒細胞的細胞核呈多葉狀，胞質(zhì)淡染。淋巴細胞體積較小，細胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)濃密。單核細胞體積較大，細胞核呈腎形或不規(guī)則形。炎性細胞浸潤導(dǎo)致支氣管壁明顯增厚，管腔狹窄。支氣管黏膜上皮細胞損傷，部分上皮細胞脫落，纖毛紊亂、倒伏或缺失。肺泡間隔也有所增厚，肺泡腔內(nèi)可見滲出物。與哮喘未干預(yù)組相比，哮喘BCG-PSN干預(yù)組小鼠肺組織的炎性細胞浸潤明顯減少，支氣管壁增厚程度減輕，黏膜上皮細胞損傷有所修復(fù)，部分纖毛重新排列，肺泡間隔增厚程度也有所改善，肺泡腔內(nèi)滲出物減少。哮喘地塞米松干預(yù)組小鼠肺組織的病理變化與哮喘BCG-PSN干預(yù)組相似，炎性細胞浸潤顯著減少，支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)得到較好的恢復(fù)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，哮喘未干預(yù)組與正常對照組相比，肺組織炎性細胞浸潤程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組與哮喘未干預(yù)組相比，炎性細胞浸潤程度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），但哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4.3BALF細胞學(xué)與IL-17濃度對小鼠BALF進行細胞學(xué)分析和IL-17濃度檢測，結(jié)果顯示：與正常對照組相比，哮喘組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比（Neu（%））、嗜酸性粒細胞百分比（Eos（%））和淋巴細胞百分比（Lym（%））顯著增多。具體數(shù)據(jù)為，正常對照組小鼠BALF中白細胞總數(shù)為（2.56±0.45）×10^5個/mL，Neu（%）為（5.63±1.25）%，Eos（%）為（8.56±1.52）%，Lym（%）為（12.35±2.14）%；而哮喘組小鼠BALF中白細胞總數(shù)高達（8.65±1.23）×10^5個/mL，Neu（%）為（18.56±3.21）%，Eos（%）為（25.63±4.56）%，Lym（%）為（20.35±3.45）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。哮喘組小鼠BALF中IL-17濃度顯著升高。正常對照組小鼠BALF中IL-17濃度為（15.63±3.25）pg/mL，哮喘組小鼠BALF中IL-17濃度則升高至（56.32±8.56）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，哮喘未干預(yù)組小鼠BALF中IL-17的濃度與Neu（%）顯著正相關(guān)（r=0.903，P＜0.01）。這表明IL-17可能在哮喘氣道中性粒細胞性炎癥中發(fā)揮重要作用，其濃度的升高可能與中性粒細胞的浸潤密切相關(guān)。4.4脾源性CD4+T細胞相關(guān)指標采用免疫磁珠分離法成功分離出脾源性CD4+T細胞，并進行了后續(xù)的各項檢測。與正常對照組相比，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞總數(shù)顯著增高。正常對照組小鼠脾源性CD4+T細胞總數(shù)為（2.56±0.35）×10^6個，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞總數(shù)則增加至（4.86±0.56）×10^6個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中Th17細胞陽性率也顯著增高。正常對照組小鼠Th17細胞陽性率為（5.63±1.05）%，哮喘未干預(yù)組小鼠Th17細胞陽性率升高至（18.63±2.56）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清液中IL-17的濃度顯著升高。正常對照組小鼠脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清液中IL-17濃度為（25.63±4.25）pg/mL，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清液中IL-17濃度升高至（76.32±9.56）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。WesternBlot和RealTimePCR檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白和IL-17mRNA的表達顯著增高。以β-actin為內(nèi)參，正常對照組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白相對表達量為1.00±0.12，哮喘未干預(yù)組小鼠IL-17蛋白相對表達量升高至2.56±0.35，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在mRNA水平，正常對照組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17mRNA相對表達量為1.00±0.15，哮喘未干預(yù)組小鼠IL-17mRNA相對表達量升高至3.25±0.46，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組中小鼠脾源性CD4+T細胞中的IL-17蛋白和IL-17mRNA的表達均低于哮喘未干預(yù)組。哮喘BCG-PSN干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白相對表達量為1.35±0.25，IL-17mRNA相對表達量為1.56±0.32；哮喘地塞米松干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白相對表達量為1.28±0.22，IL-17mRNA相對表達量為1.48±0.30。與哮喘未干預(yù)組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。但哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組之間，IL-17蛋白和IL-17mRNA的表達無顯著性差別（P＞0.05）。五、分析討論5.1急性哮喘小鼠模型評價在本次實驗中，通過卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法成功建立了急性哮喘小鼠模型。從多個方面對該模型進行評價，結(jié)果表明其具有較好的有效性和可靠性，但也存在一定的局限性。在小鼠的行為變化方面，哮喘未干預(yù)組小鼠在OVA激發(fā)后出現(xiàn)了明顯的類似于人類哮喘發(fā)作的癥狀，如呼吸急促、喘息、嗜睡、少動、進食量減少、口唇及四肢末梢發(fā)紺等。這些癥狀直觀地反映了哮喘小鼠氣道炎癥和通氣功能障礙的情況，與臨床哮喘患者的表現(xiàn)具有相似性，說明模型成功模擬了哮喘發(fā)作時的機體反應(yīng)。氣道反應(yīng)性是哮喘的重要特征之一。本實驗通過霧化吸入Ach行支氣管激發(fā)試驗，采用有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道阻力，結(jié)果顯示哮喘未干預(yù)組小鼠對Ach刺激反應(yīng)明顯增強，在各個濃度Ach激發(fā)下的氣道阻力均顯著高于正常對照組。這表明哮喘未干預(yù)組小鼠的氣道對Ach的敏感性增高，氣道反應(yīng)性增強，符合哮喘的典型病理生理特征，進一步證實了模型的成功建立。肺組織病理變化是判斷哮喘模型是否成功的重要依據(jù)。對小鼠肺組織進行HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，哮喘未干預(yù)組小鼠支氣管及血管周圍出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等，支氣管壁增厚，管腔狹窄，黏膜上皮細胞損傷，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)有滲出物。這些病理改變與哮喘患者的肺組織病理表現(xiàn)一致，說明模型在組織學(xué)水平上成功模擬了哮喘的病理過程。BALF細胞學(xué)分析結(jié)果顯示，哮喘未干預(yù)組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比和淋巴細胞百分比均顯著增多，這表明氣道內(nèi)存在明顯的炎癥細胞浸潤，炎癥反應(yīng)劇烈。BALF中IL-17濃度顯著升高，且IL-17的濃度與中性粒細胞百分比顯著正相關(guān)，提示IL-17在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，進一步驗證了模型的有效性。然而，本次實驗建立的急性哮喘小鼠模型也存在一定的局限性。首先，小鼠的氣道和肺與人類在解剖和生理上存在差異。小鼠的遠端氣道是非肺泡化支氣管，而人類的是呼吸性支氣管；細胞的類型和位置也有所不同，例如基底細胞存在于人的氣管支氣管內(nèi)，但僅存在于小鼠的氣管中；小鼠氣道平滑肌明顯較少，對影響支氣管張力的藥物不易作出反應(yīng)。這些差異可能會影響模型對人類哮喘發(fā)病機制和治療效果的模擬準確性。其次，小鼠模型在致敏后缺乏對過敏原的慢性反應(yīng)，在建立慢性哮喘模型時成功率較低。本實驗建立的是急性哮喘模型，雖然能夠在短期內(nèi)觀察到哮喘的急性炎癥反應(yīng)，但對于哮喘的慢性病程和長期病理變化的研究存在一定的局限性。此外，該模型主要基于OVA誘導(dǎo)，與人類哮喘的多種致敏原和復(fù)雜的發(fā)病機制相比，具有一定的單一性，可能無法完全涵蓋人類哮喘的所有特征和發(fā)病機制。5.2BCG-PSN對IL-17表達的影響本研究結(jié)果表明，卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）能夠下調(diào)急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17的表達，且與地塞米松具有相似的效應(yīng)。在細胞水平上，哮喘未干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中Th17細胞陽性率顯著增高，而哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中Th17細胞陽性率均低于哮喘未干預(yù)組。這說明BCG-PSN能夠抑制CD4+T細胞向Th17細胞分化，從而減少IL-17的產(chǎn)生。在分子水平上，哮喘BCG-PSN干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白和IL-17mRNA的表達均低于哮喘未干預(yù)組。這進一步證實了BCG-PSN在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均可抑制IL-17的表達。BCG-PSN下調(diào)IL-17表達的作用機制可能與以下幾個方面有關(guān)。一方面，BCG-PSN作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能夠調(diào)節(jié)機體的免疫平衡。在哮喘狀態(tài)下，機體的免疫功能紊亂，Th17細胞過度活化，IL-17分泌增加。BCG-PSN可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17平衡，抑制Th17細胞的分化和活化，從而減少IL-17的產(chǎn)生。BCG-PSN可以刺激巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞，使其分泌IL-12等細胞因子，促進Th1細胞的分化，抑制Th17細胞的分化。IL-12能夠激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4（STAT4），STAT4可以抑制維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt（RORγt）的表達，而RORγt是Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，從而減少Th17細胞的生成。另一方面，BCG-PSN可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路來抑制IL-17的表達。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在Th17細胞的分化和IL-17的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。BCG-PSN可能通過抑制MAPK信號通路的激活，減少IL-17的分泌。當(dāng)MAPK信號通路被激活時，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等蛋白激酶被磷酸化，進而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進IL-17等細胞因子的表達。BCG-PSN可能通過抑制這些蛋白激酶的磷酸化，阻斷MAPK信號通路的傳導(dǎo)，從而抑制IL-17的表達。與地塞米松相比，BCG-PSN和地塞米松在降低急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達方面效果相當(dāng)。在本實驗中，哮喘BCG-PSN干預(yù)組和哮喘地塞米松干預(yù)組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-17蛋白和IL-17mRNA的表達無顯著性差別。然而，兩者在作用機制和臨床應(yīng)用方面存在一些差異。地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素，主要通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，抑制炎癥相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。它可以抑制多種炎性細胞的活化和炎性介質(zhì)的釋放，對Th17細胞的分化和IL-17的表達也有明顯的抑制作用。長期使用地塞米松可能會帶來一系列不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、感染風(fēng)險增加、腎上腺皮質(zhì)功能抑制等。而BCG-PSN是一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能來發(fā)揮作用，不良反應(yīng)相對較少。它可以增強機體的抵抗力，減少呼吸道感染的發(fā)生，這對于哮喘患者來說尤為重要。因為呼吸道感染是哮喘發(fā)作的常見誘因之一，減少感染可以降低哮喘的發(fā)作頻率。BCG-PSN還可以穩(wěn)定肥大細胞，減少過敏反應(yīng)的發(fā)生。在臨床應(yīng)用中，對于一些不能耐受糖皮質(zhì)激素副作用的哮喘患者，BCG-PSN可能是一種較好的選擇。然而，BCG-PSN的起效相對較慢，需要一定的時間來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，而地塞米松起效較快，在哮喘急性發(fā)作時能夠迅速緩解癥狀。5.3IL-17在哮喘發(fā)病中的作用本研究結(jié)果顯示，在急性哮喘小鼠模型中，IL-17發(fā)揮了關(guān)鍵的致病作用，其表達水平的變化與哮喘的病理進程密切相關(guān)。哮喘未干預(yù)組小鼠BALF中IL-17濃度顯著升高，且與中性粒細胞百分比顯著正相關(guān)。這表明IL-17可能是介導(dǎo)哮喘氣道中性粒細胞性炎癥的重要細胞因子。IL-17可以誘導(dǎo)氣道上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生多種細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、G-CSF等。這些細胞因子和趨化因子能夠招募和活化中性粒細胞，使其在氣道內(nèi)大量聚集，引發(fā)炎癥反應(yīng)。IL-8對中性粒細胞具有強烈的趨化作用，可引導(dǎo)中性粒細胞向炎癥部位遷移，增加中性粒細胞在氣道中的浸潤數(shù)量。G-CSF則能促進中性粒細胞的增殖、分化和成熟，進一步增強其活性，導(dǎo)致氣道炎癥的加劇。IL-17還可通過多種途徑參與哮喘的氣道重塑過程。它能夠刺激肌纖維母細胞分化和氣道平滑肌增生肥大，促進細胞外基質(zhì)的合成和沉積，使氣道壁增厚、僵硬，管腔狹窄。IL-17可以上調(diào)氣道平滑肌細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和膠原蛋白的表達，促進肌纖維母細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，增強氣道平滑肌的收縮能力。IL-17還能促進杯狀細胞增生，導(dǎo)致黏液高分泌，過多的黏液在氣道內(nèi)積聚，不僅會堵塞氣道，影響通氣功能，還會為細菌等病原體的滋生提供良好的環(huán)境，進一步加重炎癥反應(yīng)。在哮喘的發(fā)病機制中，IL-17與其他細胞因子之間存在復(fù)雜的相互作用。一方面，IL-17與Th2型細胞因子如IL-4、IL-5等相互協(xié)同，共同促進哮喘的發(fā)生發(fā)展。IL-4可以促進B細胞產(chǎn)生IgE，IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，而IL-17可以增強氣道對過敏原的炎癥反應(yīng)，兩者相互作用，加重氣道炎癥。IL-5能夠促進嗜酸性粒細胞的生長、分化和活化，使其在氣道內(nèi)聚集，IL-17與IL-5協(xié)同作用，導(dǎo)致氣道內(nèi)炎性細胞浸潤更加嚴重。另一方面，IL-17與Th1型細胞因子如IFN-γ之間存在相互抑制的關(guān)系。IFN-γ可以抑制Th17細胞的分化和IL-17的產(chǎn)生，而IL-17也能抑制Th1細胞的功能和IFN-γ的分泌。在哮喘患者中，這種細胞因子之間的平衡被打破，Th17細胞及其分泌的IL-17相對增多，Th1細胞及其分泌的IFN-γ相對減少，導(dǎo)致免疫失衡，促進哮喘的發(fā)生和發(fā)展。綜上所述，IL-17在急性哮喘中性粒細胞氣道炎癥過程中發(fā)揮著核心作用，通過多種機制導(dǎo)致氣道炎癥、氣道重塑等病理變化。深入研究IL-17在哮喘發(fā)病中的作用機制，為哮喘的治療提供了新的理論依據(jù)。針對IL-17及其相關(guān)信號通路開發(fā)新的治療靶點和藥物，有望為哮喘的治療帶來新的突破，改善哮喘患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。5.4研究的創(chuàng)新性與不足本研究在哮喘治療研究領(lǐng)域具有一定的創(chuàng)新性。首先，以往關(guān)于卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）治療哮喘的研究主要集中在整體水平和常規(guī)免疫指標的觀察上，而本研究首次深入探究了BCG-PSN對急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17表達的影響，從細胞和分子水平揭示其治療哮喘的潛在機制，為BCG-PSN治療哮喘的作用機制研究提供了新的視角。其次，通過與地塞米松進行對比研究，明確了BCG-PSN在下調(diào)IL-17表達方面與地塞米松具有相似的效應(yīng)，且BCG-PSN作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有不良反應(yīng)相對較少的優(yōu)勢，為哮喘的臨床治療提供了新的選擇和思路。然而，本研究也存在一些不足之處。一方面，本研究的樣本量較小，每組僅10只小鼠，可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果的偶然性和偏差，影響研究結(jié)論的可靠性。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴大樣本量，進行多中心、大樣本的研究，以進一步驗證本研究的結(jié)果。另一方面，本研究僅觀察了BCG-PSN對急性哮喘小鼠的治療效果，未對其長期療效進行觀察。哮喘是一種慢性疾病，需要長期治療和管理，因此，未來研究應(yīng)開展長期隨訪實驗，觀察BCG-PSN對哮喘小鼠長期病情控制和復(fù)發(fā)的影響。此外，本研究雖然發(fā)現(xiàn)了BCG-PSN能夠下調(diào)急性哮喘小鼠CD4+T細胞IL-17的表達，但對于其具體的作用機制尚未完全明確。BCG-PSN可能通過多種信號通路和分子機制發(fā)揮作用，未來需要進一步深入研究，明確其關(guān)鍵作用靶點和信號通路，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。本研究也未對