(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN119959532A(66)本國(guó)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(71)申請(qǐng)人中國(guó)科學(xué)院精密測(cè)量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院地址430071湖北省武漢市武昌區(qū)小洪山西區(qū)30號(hào)申請(qǐng)人湖北光谷實(shí)驗(yàn)室劉買利(74)專利代理機(jī)構(gòu)武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙)42001專利代理師董路細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用途本發(fā)明公開了細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用途，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用細(xì)胞色素C(Cytochromec,CC)與鏈霉親和素中具有良好的檢測(cè)效果。利用本發(fā)明所述融合蛋21.細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用途。2.一種重組CC-SA融合蛋白，其特征在于：所述的重組CC-SA融合蛋白由CC和SA通過多3.一種權(quán)利要求2所述的重組CC-SA融合蛋白的編碼基因，其特征在于：所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一種權(quán)利要求2所述的重組CC-SA融合蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟：S1、根據(jù)重組CC-SA融合蛋白的氨基酸序列，利用基因擴(kuò)增技術(shù)合成重組CC-SA融合蛋白的編碼基因；S2、將重組CC-SA融合蛋白的編碼基因插入S3、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的重組CC-SA融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述的表達(dá)載體選自pET-32a(+)載體，感受態(tài)細(xì)胞選自BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。6.一種權(quán)利要求2所述的重組CC-SA融合蛋白在制備ELISA試劑盒中的應(yīng)用。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用背景技術(shù)[0002]酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)定性、定量檢測(cè)抗體(抗原)的免疫酶技術(shù)。固定在載體表面的抗原或者抗體不會(huì)失活，仍然保留其免疫反應(yīng)性。酶標(biāo)記的抗體或者抗原既具有免疫學(xué)活性，還具有酶的催化活性。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，首先將抗原或者抗體固定在固相載體上，然后加入檢測(cè)對(duì)象，讓待測(cè)物質(zhì)與固相化物質(zhì)結(jié)合，形成固相化的“抗原一抗體”復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的抗體或者抗原，與固相化的復(fù)合物結(jié)合，形成酶標(biāo)復(fù)合物，最后加入底物溶液，發(fā)生酶催化底物顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析。[0003]雙抗夾心式ELISA試劑盒是目前市場(chǎng)上最常用的一種，其原理如圖1所示，其組成包括固定的一抗，生物素標(biāo)記的二抗，辣根過氧化酶(HorseradishPeroxidase,HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-SA),顯色液，終止液等。組成，SA可結(jié)合生物素，偶聯(lián)的HRP聚合物可提供較高水平的酶活性，從而便于采用適當(dāng)?shù)牡孜锵到y(tǒng)開展檢測(cè)。[0004]HRP-SA的制備流程如圖2所示，通常包括4個(gè)步驟：1、從鏈霉菌StreptomycesSA復(fù)合物。在該生產(chǎn)過程中，從鏈霉菌和辣根中分別提取相應(yīng)蛋白，需要較大的經(jīng)濟(jì)成本，后續(xù)的交聯(lián)反應(yīng)和純化等生產(chǎn)工藝繁瑣，降低了生產(chǎn)效率，因此，整個(gè)HRP-SA的制備工藝成本和人力成本極大。發(fā)明內(nèi)容[0005]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用途，本發(fā)明將細(xì)胞色素C(Cytochromec,CC)與鏈霉親和素(Streptavidin,SA)通過一小段多肽連接形成融合蛋白，如圖3所示。該融合蛋白既具有CC結(jié)構(gòu)域，具有高過氧化酶活性，能催化底物如魯米諾等，使其氧化產(chǎn)生顯色反應(yīng)；又兼具SA結(jié)構(gòu)域，與生物素具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。利用本發(fā)明的重組CC-SA融合蛋白制備ELISA試劑盒，簡(jiǎn)化了制備工藝，[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：[0007]細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新[0008]一種重組CC-SA融合蛋白，所述的重組CC-SA融合蛋白由細(xì)胞色素C和鏈霉親和素通過多肽連接形成，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0009]一種重組CC-SA融合蛋白的編碼基因，所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQID4NO.2所示。[0010]一種重組CC-SA融合[0011]S1、根據(jù)重組CC-SA融合蛋白的氨基酸序列，利用基因擴(kuò)增技術(shù)合成重組CC-SA融合蛋白的編碼基因；[0012]S2、將重組CC-SA融[0013]S3、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)[0014]進(jìn)一步，所述的表達(dá)載體選自pET-32a(+)載體，感受態(tài)細(xì)胞選自BL21(DE3)感受態(tài)[0015]一種重組CC-SA融合蛋白在制備ELISA試劑盒中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與有益效果在于：[0016]1、本發(fā)明提出了細(xì)胞色素C在制備ELISA試劑盒方面的新用途，利用細(xì)胞色素C(Cytochromec,CC)與鏈霉親和素(Streptavidin,SA)構(gòu)建融合蛋白，該融合蛋白同時(shí)具備重組細(xì)胞色素C催化氧化和SA結(jié)合生物素的功能，而且互不干擾，在ELISA實(shí)驗(yàn)中能夠充分發(fā)揮功效，并且兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不存在被斷開的可能性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。[0017]2、本發(fā)明的重組CC-SA融合蛋白通過感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)而來，只需簡(jiǎn)單的培養(yǎng)和提取即可，經(jīng)濟(jì)成本和人力成本都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于市場(chǎng)上現(xiàn)有的產(chǎn)品，具有很好的市場(chǎng)前景。[0018]3、利用本發(fā)明的重組CC-SA融合蛋白制備ELISA試劑盒，與傳統(tǒng)的由HRP-SA制備的ELISA試劑盒相比，不僅檢測(cè)效果相當(dāng)，而且無需冗余的交聯(lián)等制備工藝，極大簡(jiǎn)化了制備附圖說明[0019]圖1為雙抗夾心式ELISA試劑盒的檢測(cè)原理圖。[0021]圖3為實(shí)施例1的重組CC-SA融合蛋白的結(jié)構(gòu)建構(gòu)示意圖。[0022]圖4為實(shí)施例1的重組CC-SA融合蛋白的質(zhì)粒圖。[0024]圖6為以實(shí)施例1的重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒檢測(cè)人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(AngiotensinConvertingEnzyme,ACE)的效果圖。[0025]圖7為以實(shí)施例1的重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒檢測(cè)人補(bǔ)體系統(tǒng)3a蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Complementsystem3a,C3a)的效果圖。[0026]圖8為以實(shí)施例1的重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞(Hela)培養(yǎng)上清液中C3a蛋白的效果圖。具體實(shí)施方式[0027]為了便于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解和實(shí)施本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施示例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。如無特殊說明，本發(fā)明的實(shí)施例中的試劑和生物原料均通過商業(yè)購(gòu)買。其中，未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)(New5York:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或按照設(shè)備制造廠商所建議的條件。[0029]本實(shí)施例比較利用重組CC-SA融合蛋白制備，具體方法如下：[0031]重組CC-SA融合蛋白質(zhì)粒設(shè)計(jì)如圖4所示，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到目的蛋白CC和SA的氨基酸序列，由奧科(武漢)生物科技有限限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NdeI的酶切。[0032]先分別將目的基因和空載的pET-21(a)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NdeI在37℃[0033]表1限制性內(nèi)切酶酶切體系CC-SA目的基因pET-21(a)載體331111[0035]然后分別用瓊脂糖凝膠電泳分離片段，并用膠回收試劑盒回收目的片段，然后將兩者混合，加入T4連接酶連接10h,最后得[0036]表2酶連接體系試劑添加量(μL)2載體4目的基因2[0039]吸取1-2μL重組CC-SA融合蛋白的質(zhì)粒加入事先準(zhǔn)備好的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰激30min,取出放在42℃水浴鍋中熱激90s,再放回冰上冰激1min,隨后加入500μL液體感受態(tài)細(xì)胞均勻涂到含有氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的固體平板培養(yǎng)基中，接著放于培養(yǎng)箱中，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)8-10h。待固體平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出肉眼可見的單菌落后，挑取單菌落至5mL含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，在轉(zhuǎn)速220rpm和37℃下培養(yǎng)8-10h,將菌液轉(zhuǎn)入1L含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，隨后置于搖床上，在轉(zhuǎn)速220rpm和37℃下培養(yǎng)8-10h,待菌液的OD600達(dá)到0.8-1.0時(shí)，向菌液中加入終濃度為0.1mM的IPTG,于轉(zhuǎn)速60rpm和30℃下繼續(xù)培養(yǎng)18-24h,由于CC-SA是紅色的，當(dāng)它在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中過量6[0041]離心后的菌體用50mLLysisBuffer(50mMTris,5mMEDTA)重懸，隨后加入溶菌酶(1.5mg/mL濕菌體)和5μLDNA酶，置于翻轉(zhuǎn)振蕩器上消化1h。隨后用高壓裂菌儀進(jìn)行破碎；將破碎后的菌體進(jìn)行離心，4℃,20000rpm離心30min,收集上清液，并加入硫酸銨(150g/L)進(jìn)行鹽析3-6h,收集鹽析后的樣品在4℃和轉(zhuǎn)速20000rpm下離心30min,收集上清液，封裝過濾，所得的濾液為目的蛋白的粗提液。[0043]蛋白第一步純化實(shí)驗(yàn)所使用的色譜柱為HitrapSPHP陽離子交換色譜柱，用含有20mMPBNa,1MNaCl(pH7.0)緩沖液梯度洗脫得到目的蛋白的粗提液(目的蛋白為紅色，收集紅色樣品即可),待洗脫結(jié)束，使用截留分子量30kDa的濃縮管將其濃縮至5mL內(nèi)，得到的蛋白精提液體用于第二步純化；第二步純化所使用的色譜柱為HiLoadSuperdex200pg制備尺寸排阻色譜柱，使用20mMPBNa,150mMNaCl(pH7.0)緩沖液洗脫得到目的蛋白精提液體；使用截留分子量30kDa的濃縮管將純化的蛋白用ddH?0換洗3次除去里面的鹽分，凍干保存于-80℃。最后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)對(duì)純化得到的目的蛋白進(jìn)行分析鑒定，如圖5所示，膠圖上的條帶約為30kD,與它的理論分子量一致，表明蛋白表達(dá)成功。[0045]本實(shí)施例比較利用重組CC-SA融合蛋白與利用商用試劑盒里的HRP-SA(上海碧云天生物股份有限公司)制備的ELISA試劑盒檢測(cè)兔血管緊張素轉(zhuǎn)化酶標(biāo)準(zhǔn)品(ACE),具體方法如下：量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，最后用透明封板膜封住標(biāo)準(zhǔn)品孔。按照上述方法設(shè)置3組標(biāo)[0047]2、將經(jīng)步驟1處理的酶標(biāo)板在室溫下孵育120min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將各酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。[0048]3、向3組標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入生物素標(biāo)記的ACE抗體(100μL/孔),用封板膜(透明)封住各標(biāo)準(zhǔn)品孔。[0049]4、將經(jīng)步驟3處理的酶標(biāo)板在室溫下孵育60min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將各酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。HRP-SA溶液，向兩實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入0.1mM的HRP-SA溶液和CC-SA溶液(100μL/孔),用白色封板膜封住兩實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)品孔。[0051]6、將每個(gè)組的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔在室溫下分別避光孵育20min、40min和60min,孵育結(jié)[0052]7、向經(jīng)步驟6處理的各標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入顯色劑TMB溶液(100μL/孔),用封板膜(白色)封住各標(biāo)準(zhǔn)品孔，在室溫避光孵育18min。7品孔的A450值，比較兩實(shí)驗(yàn)組兔血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的穩(wěn)定性。[0054]9、以重組CC-融合蛋白制備的ELISA試劑盒和以商用的HRP-SA制備的ELISA試劑盒起到了相當(dāng)?shù)臏y(cè)試效果，甚至在孵育較短的時(shí)間內(nèi)，以本發(fā)明的重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒的測(cè)試效果更好。[0056]本實(shí)施例利用重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒檢測(cè)人補(bǔ)體系統(tǒng)3a(C3a)標(biāo)[0057]1、將C3a標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋液稀釋30倍，得到C3a工作液，將C3a工作液分別加入到孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，最后用透明封板膜封住。按照上述方法設(shè)置2[0058]2、將經(jīng)步驟1處理的酶標(biāo)板在室溫下孵育120min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將各酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。[0059]3、向2組標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入生物素標(biāo)記的C3a抗體(100μL/孔),用透明封板膜封住各標(biāo)準(zhǔn)品孔。[0060]4、將經(jīng)步驟3處理的酶標(biāo)板在室溫下孵育60min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將各酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。[0061]5、用20mMPBS溶解CC-SA,配制0.1mM的CC-SA溶液，向?qū)嶒?yàn)組標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入0.1mM的CC-SA溶液(100μL/孔),用白色封板膜封住實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)品孔。[0062]6、將經(jīng)步驟5處理的酶標(biāo)板在室溫下避光孵育20min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將各酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。[0063]7、向兩組標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入顯色劑TMB溶液(100μL/孔),用白色封板膜封住各標(biāo)準(zhǔn)品孔，在室溫避光孵育18min。[0064]8、向兩組標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別50μL終止液(2MH?SO?溶液),混勻后立即測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)品孔中ACE的吸光度，并讀出A450值。[0065]以重組CC-SA融合蛋白制備的ELISA試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品C3a的A450值，結(jié)果如圖7所盒產(chǎn)生了顯著的A450值，表明標(biāo)準(zhǔn)品C3a蛋白成功被檢測(cè)到。[0067]本實(shí)施例利用基于重組CC-SA融合蛋白的ELISA試劑盒檢測(cè)Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液胞培養(yǎng)上清液。將Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入酶標(biāo)板孔的底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，最后用透明封板膜封住孔。按照上述方法設(shè)置2組實(shí)際對(duì)照組。[0069]2、將經(jīng)步驟1處理的的酶標(biāo)板在室溫下孵育120min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將酶標(biāo)板置于厚吸水紙上拍干。8[0070]3、向2組實(shí)際樣品孔中分別加入生物素標(biāo)記的C3a抗體(100μL/孔),用透明封板膜封住各實(shí)際樣品孔。[0071]4、將經(jīng)步驟4處理的酶標(biāo)板在室溫下孵育60min,孵育結(jié)束后，洗板5次，最后將酶標(biāo)板置于厚吸