1敷料中重組膠原蛋白的檢測液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法本文件適用于各種敷料中重組膠原蛋白的定性鑒別和定注：敷料中重組膠原蛋白可能有全長、片段、同型別片段編輯組合或不同型別片段編輯組合等類型。若該重組膠GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格YY/T1805.3組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原采用液相色譜法將混合物中各組分進(jìn)行分離，采用質(zhì)譜法將待測物質(zhì)離子化，按照離子的質(zhì)荷比（m/z）大小進(jìn)行分離，通過分析離子的質(zhì)荷比和相對豐度獲得樣品組分的結(jié)構(gòu)和分子量信息，進(jìn)而對5.1試劑或材料25.1.6重組膠原蛋白特異性特征多肽對照品（經(jīng)設(shè)計(jì)和驗(yàn)證確認(rèn)后進(jìn)行化學(xué)合成）或用于供試品的重5.1.7基質(zhì)對照樣品（與相應(yīng)的供試品敷料用基質(zhì)）：甲基氨基甲烷，加水5mL溶解，以鹽酸調(diào)pH至8.0，移入10mL容量5.2儀器和設(shè)備）：）：6.1供試品特異性特征多肽設(shè)計(jì)原則和確根據(jù)供試品中所含重組膠原蛋白的源及不同型別的膠原蛋白序列進(jìn)行Blast多序列比對，只在某一特定種屬來源（如人）的膠原蛋白序列通過實(shí)際樣品（供試品中所含重組膠原蛋白原料）的酶解產(chǎn)物HPLC-MS/MS測試，分析所選特征3組膠原蛋白之外的所有組分）中，按照本文件中給出的樣品前處理方法和基于HPLC-MS/MS的定量檢信噪比為3和10所對應(yīng)的重組膠原蛋白的濃度分別作為檢測限和定量限。以上確認(rèn)的數(shù)據(jù)可用于低于最低于檢測限時表示在該濃度下未檢測到供試品中重組膠原蛋蛋白原料或合成的特征多肽對照品加標(biāo)的方式，即：將基質(zhì)對照樣品制備3份，加入一定量（以相當(dāng)于供試品所含重組膠原蛋白量為核心，設(shè)定高、中、低3個劑量組）的重組膠原蛋白原料或合成的特征多添加了重組膠原蛋白原料或合成的特征多肽對照品的基質(zhì)對照樣品組結(jié)果與實(shí)際添加的重組膠原蛋白原料或合成的特征多肽對照品比較，分析目收率過高或者過低，無法滿足80%～1積比（v/v）1:1加入0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）復(fù)溶，磁力攪拌20～30min，使組質(zhì)量體積比（m/v）1:2加入0.1mol/LTris-HCl準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的固體類產(chǎn)品中的液體/半固體組分，按照6.3.2或6.3.3的方4用于檢測限和定量限確認(rèn)的樣品，以及檢測回收率分析樣品按照6.2的要求配制后，與相應(yīng)供試若供試品所含重組膠原蛋白為聚合體或有三螺旋結(jié)構(gòu)，解酶的質(zhì)量比（m/m20～50）:1混合，于適宜溫度下恒溫振蕩反應(yīng)，反應(yīng)一定時間使樣品完全酶），標(biāo)準(zhǔn)樣品酶解和標(biāo)準(zhǔn)工作.1稱取一定量的重組膠原蛋白原料，用0.1mol/LTris-HCl.2特征多肽標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：用相應(yīng)的基質(zhì)對照樣品溶液（6.3.5)稀釋成系列濃度的特征多），5.2流速：0.2mL/min～.2.3柱溫：25℃~30℃。.5色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱[粒徑3μm或5μm100mm.3檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）。根據(jù)特征多肽的離子質(zhì)荷比進(jìn)行二級質(zhì)按照液相色譜-質(zhì)譜條件（6.4.2）測定，供試品樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品中待測物（目標(biāo)特征多肽）的保留時間標(biāo)，以所測定的目標(biāo)特征多肽的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（1）得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，X——特征多肽含量或重組膠原蛋白原料含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。Y——特征多肽峰面積。），），計(jì)算出供試品中重組膠原蛋白的含量[見式（2）或式（供試品中重組膠原蛋白含量Xi，單位為微克每克(μg/g），用系統(tǒng)處理軟件或按式（2）計(jì)算：6Xi——供試品中重組膠原蛋白含量，單位為微克每克(μg/g）。Ci——測試樣品中特征多肽的含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。M1——重組膠原蛋白分子量。M2——重組膠原蛋白特征多肽分子量；X——酶解后樣品稀釋倍數(shù)。n——重組膠原蛋白理論序列中特征多肽的重復(fù)個供試品中重組膠原蛋白含量Xi，單位為微克每毫升(μg/mL），按式（3）計(jì)算：Ci——測試樣品中特征多肽的含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。M1——重組膠原蛋白分子量。M2——重組膠原蛋白特征多肽分子量。X——酶解后樣品稀釋倍數(shù)。n——重組膠原蛋白理論序列中特征多肽的重復(fù)個），），供試品中重組膠原蛋白含量Xi，單位為微克每毫升(μg/mL），按式（4）計(jì)算：Xi——供試品中重組膠原蛋白含量，單位為微克每克(μg/g）。Ci——測試樣品中重組膠原蛋白含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。X——酶解后樣品稀釋倍數(shù)。n——重組膠原蛋白理論序列中特征多肽的重復(fù)個供試品中重組膠原蛋白含量Xi，單位為微克每毫升(μg/mL），按式（4）計(jì)算：7Xi——供試品中重組膠原蛋白含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。Ci——測試樣品中重組膠原蛋白含量，單位為微克每毫升(μg/mL）。X——酶解后樣品稀釋倍數(shù)。n——重組膠原蛋白理論序列中特征多肽的重復(fù)個Xs*——添加了重組膠原蛋白原料或合成特征多肽對照品的基質(zhì)對照樣品中重組膠原蛋白質(zhì)量或特Xs——理論添加的重組膠原蛋白原料或合成特征多肽質(zhì)量，單位為毫克（mg）。檢測加標(biāo)回收率：80%～18A.1.1試劑或材料A.1.1.1供試品：醫(yī)用重組III型膠原蛋白噴劑敷料（以下簡稱為噴劑敷料，液體狀）、醫(yī)用重組III型膠A.1.1.2對照品：重組III型膠原蛋白原料，是供試品的功能成分，凍干粉，純度大于95%，用于定性鑒A.1.1.3基質(zhì)對照樣品：對應(yīng)于三種敷料的供試品基質(zhì)（除重組III型A.1.1.4其它試劑：見本文件正文相應(yīng)條款。A.1.1.5溶液配制：見本文件正文條款5.1.8。A.1.2儀器和設(shè)備A.2定性鑒別和定量檢測方法A.2.1特征多肽設(shè)計(jì)和確認(rèn)按正文6.1條款的要求進(jìn)行供試品特異性特征多肽的設(shè)計(jì)。將供試品所含重組膠原蛋白的理論氨基酸序列以胰蛋白酶進(jìn)行理論酶切，收集所有肽段信息，利用BioFinder軟件進(jìn)行分析，檢索高度匹配的重組III型膠原蛋白肽段，與蛋白數(shù)據(jù)庫中不同種屬來源和不同型別的膠原蛋白序列進(jìn)行Blast多序列比對，根據(jù)正文6.1條款的篩選原則，篩選僅存在于供試品（人III型膠原蛋白）的肽段，且不存在于常見將供試品所含重組膠原蛋白原料按正文6.4條款進(jìn)行胰蛋白酶酶解和特征多肽檢測，確認(rèn)所選擇的A.2.1.1色譜條件流動相A相為含0.1%甲酸水溶液；流動相B相為含0.1%甲酸乙腈溶液；色譜柱為PeptideCSH）；0222A.2.1.2質(zhì)譜條件9AGCTarget：300%，最大離子注入時間為：100ms；％，A.2.2方法學(xué)確認(rèn)按正文6.2條款的要求進(jìn)行樣品準(zhǔn)備，具體見A.2.3.4A.2.3樣品前處理A.2.3.1供試品樣品精密量取噴劑敷料（液體狀）2mL于10mL離心管中；精密稱取Tris-HCl（pH8.0）溶液2mL，磁力攪拌20～30mi向修復(fù)敷料和敷料液中分別加入0.1mol/LA.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)樣品母液A.2.3.3基質(zhì)對照樣品A.噴劑敷料基質(zhì)對照樣品溶液磁力攪拌20～30min，使敷料組分充分溶解并混合均勻備用。A.修復(fù)敷料基質(zhì)對照樣品溶液磁力攪拌20～30min，使敷料組分充分混合均勻備用。A.敷料液基質(zhì)對照樣品溶液A.2.3.4檢測限和定量限確認(rèn)樣品分別向噴劑敷料、修復(fù)敷料以及敷料液的基質(zhì)對照樣品中添加不同量的低濃度重組I原蛋白原料溶液后，按與A.2.3.1供試品樣品相同A.2.3.5檢測回收率分析樣品A.在噴劑敷料的基質(zhì)對照樣品中分別添加高中低劑量的重組III型膠原蛋白原料，如：10A.在修復(fù)敷料和敷料液的基質(zhì)對照樣品中分別添加高中低劑量的重組III型膠原蛋白原料，A.2.4試樣制備A.2.4.1樣品溶解A.2.4.2樣品酶解A.標(biāo)準(zhǔn)樣品酶解及標(biāo)準(zhǔn)工作液配制A..2精密吸取適量的重組III型膠原蛋白原料酶解液（A..1分別用（A.2.3.3）中制A.供試品樣品酶解），A.檢測限和定量限確認(rèn)樣品酶解取前處理后的檢測限和定量限確認(rèn)樣品（A.A.檢測回收率分析樣品取前處理后的檢測回收率分析樣品（A.2.3.5）,按A.2.4.A.色譜條件），30℃,進(jìn)樣量為5μL，色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（粒徑5μm，150mm×2.1mm），洗脫條件555A.質(zhì)譜條件根據(jù)不同的質(zhì)譜儀器設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)，監(jiān)測離子通道參數(shù)見注1：以上質(zhì)譜操作條件是典型操作參數(shù)，可根據(jù)不同儀器的特點(diǎn)，對操作參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整，選取最優(yōu)SRM條件檢注2：優(yōu)先選擇受試物相對應(yīng)的子離子碎片，推薦使用受試A.2.5定性鑒別和定量檢測按文件正文的6.5和6.6條款進(jìn)行定性鑒A.3.1特征多肽設(shè)計(jì)和確認(rèn)重組III型膠原原料樣品胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的總離子流圖（圖A.1）經(jīng)過BioFinder軟件分析，檢m/z526.79042的一級質(zhì)譜圖（圖A.2）表明該離子帶雙電荷，其分子量與多肽GEAGIPGVPGAK的理論分子量一致，m/z526.79042的二級質(zhì)譜圖（圖A.3）的碎片離子與多肽GEAGIPGVPGAK的理論碎片離多肽，用于供試品的定性鑒別分析和定量檢測。NL:NL:2.89E9TICMSPF-III_20230421.2222.1828.7127.3551.6751.5751.7051.7551.5751.7051.7551.5351.4751.8955.9149.7456.0859.6567.782.262.304.624028.9229.9628.9229.9631.8846.8577.2269.8877.2269.8800102030圖A.2重組III型膠原蛋白原料酶解產(chǎn)物中m/圖A.3重組III型膠原蛋白原料酶解產(chǎn)物中A.3.2方法學(xué)驗(yàn)證A.3.2.1檢測限和定量限的確認(rèn)A.噴劑敷料中添加重組III型膠原蛋白原料終濃度為0.5ng/mL、1ng/mL的質(zhì)譜圖見圖噪比S/N為3，因此，確定噴劑敷料產(chǎn)品的重組III型膠原蛋白原料檢測限為0.5ng/mL、定量限為1圖A.4噴劑敷料中重組III型膠原蛋白原料終濃度為0.5n因此，確定敷料液的重組III型膠原蛋白原料檢出限為0.5ng/g、定量限為圖A.5凝膠敷料中重組III型膠原蛋白原料終濃度為0圖因此，確定修復(fù)敷料產(chǎn)品的重組III型膠原蛋白原料檢出限為1ng/g、定量限為2n圖A.6修復(fù)敷料中重組III型膠原蛋白原料終濃度為1ng/g（AA.3.2.2添加回收率確認(rèn)A.噴劑敷料將噴劑敷料基質(zhì)對照樣品作為溶液配制不同重組III型膠原原料濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖A.7。添加濃度為100μg/蛋白噴劑敷料的特征多肽質(zhì)譜圖見圖A.8；添加濃度為10μg/劑敷料的特征多肽質(zhì)譜圖見圖A.9；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到醫(yī)用重組III型膠原蛋白噴劑敷料基質(zhì)對照樣品前處理的重組III型膠原蛋白添加回收率見表A.4。結(jié)果表明，噴劑敷料基質(zhì)中PF-IIIY=75184+37679.7*XR^2=0.9933W:Equal70000006000000Area5000000Area40000003000000200000010000000050100150ug/ml555A.敷料液將敷料液基質(zhì)對照樣品作為溶液配制不同濃HPLC-MS/MS分析，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線PF-IIIY=144003+19184.3*XR^2=0.9931W:Equal35000003000000Area2500000Area200000015000001000000500000005010圖A.11敷料液空白基質(zhì)中重組III型膠原蛋白原料添加濃度為100圖A.12敷料液空白基質(zhì)中重組III型膠原蛋白原料添加濃度為10圖A.修復(fù)敷料將修復(fù)敷料基質(zhì)對照樣品作為溶液配制不同HPLC-MS/MS分析，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線PF-IIIY=7201.72+36281.7*XR^2=0.9970W:Equal700000060000005000000Area4000000Area300000020000001