用機(jī)械法

或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理原代培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液懸浮生長貼壁生長(大多數(shù)）④接觸抑制細(xì)胞分裂受阻解決傳代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)取動物組織分散成單個細(xì)胞②制成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)。①收集細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞:直接用離心法收集貼壁細(xì)胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細(xì)胞，用離心法收集①營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、②代謝廢物積累、③細(xì)胞密度過大等第二節(jié)動物細(xì)胞工程第2課時

動物細(xì)胞融合

溫故而知新植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)

有沒有技術(shù)讓不同種動物的體細(xì)胞雜交，培育出集不同細(xì)胞優(yōu)勢于一身的動物細(xì)胞呢？1970年熒光標(biāo)記的人-鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：使

動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。動物細(xì)胞融合技術(shù)1兩個或多個1.概念：2.結(jié)果：3.原理：形成

的雜交細(xì)胞，即融合后形成的雜交細(xì)胞是具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。細(xì)胞膜具有一定的流動性。4.誘導(dǎo)融合的常用方法物理法：化學(xué)法：生物法：電融合法聚乙二醇（PEG)滅活的病毒——動物細(xì)胞融合特有受精作用單核5．意義：細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。（1）“滅活病毒”中滅活的具體含義是什么？是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（能誘導(dǎo)細(xì)胞融合）（2）滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是什么？

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動性和植物細(xì)胞的全能性步驟誘導(dǎo)方法物理法：電融合法、離心法等；化學(xué)法：PEG融合法、高Ca2＋—高pH融合法等結(jié)果細(xì)胞膜的流動性酶解法去掉細(xì)胞壁后，誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞，再經(jīng)過植物組織培養(yǎng)形成雜種植株分散成單個細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞融合PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法等形成雜種植株形成雜交細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用2(1)是研究____________________________和________________等的重要手段。(2)為制造____________開辟了新途徑。細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤培育生物新品種單克隆抗體單克隆抗體及其應(yīng)用3缺陷：產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。動物體內(nèi)抗原刺激漿細(xì)胞抗體B細(xì)胞增殖分化抗原不純抗體不純（1）傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷如何獲得大量、單一的抗體？思考單克隆抗體1、需解決問題：一種B淋巴細(xì)胞細(xì)胞群抗體克隆由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克隆），形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。體外培養(yǎng)時，一個B淋巴細(xì)胞不能無限增殖2、遺憾：如何解決這一難題？一個極富創(chuàng)造力的方案：動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體1975年，米爾斯坦和科勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體用抗原注射小鼠從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)已免疫B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞小鼠的脾臟中獲取2、單克隆抗體的制備過程置于選擇性培養(yǎng)基（HAT）上培養(yǎng)2雜交瘤細(xì)胞13第一次篩選多種雜交瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞自身融合B細(xì)胞自身融合雜交細(xì)胞132未融合的B淋巴細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡克隆化培養(yǎng)抗體檢測第二次篩選(抗原-抗體雜交技術(shù))多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞二稀釋到之后將培養(yǎng)液滴入96孔板的每個孔中，每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞。二單克隆抗體及其應(yīng)用二單克隆抗體及其應(yīng)用二單克隆抗體及其應(yīng)用抗原1二單克隆抗體及其應(yīng)用抗體檢測呈陽性注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)分離、提純單克隆抗體體內(nèi)或體外培養(yǎng)能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備項(xiàng)目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低規(guī)模小，產(chǎn)量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高基于單克隆抗體制備的過程，回答有關(guān)問題：(1)為什么要對小鼠注射特定的抗原？提示：為了獲得能產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞。(2)單克隆抗體制備過程中，第一次篩選和第二次篩選的目的是什么？方法是什么？其原理是什么？提示：思考第一次篩選第二次篩選目的方法原理得到雜交瘤細(xì)胞得到能產(chǎn)生所需要抗體的雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基（HAT）進(jìn)行篩選抗體檢測抗原-抗體的特異性結(jié)合只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長單克隆抗體的制備過程動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選第二次篩選誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)，專一抗體檢驗(yàn)體外培養(yǎng)或小鼠腹腔內(nèi)增殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備既能大量繁殖又能產(chǎn)生專一抗體單克隆抗體的應(yīng)用41、診斷試劑——最廣泛應(yīng)用抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體比原來診斷方法提前了10d左右，準(zhǔn)確率在90﹪以上。具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點(diǎn)診斷優(yōu)點(diǎn)：新冠病毒抗原檢測試劑盒艾滋病檢測試劑主要用于癌癥治療。如：單克隆抗體+藥物=“生物導(dǎo)彈”2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小(“生物導(dǎo)彈”—單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)“生物導(dǎo)彈”追蹤癌細(xì)胞1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。①

可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；②

一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。思考?討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？①

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗