滅活方式對(duì)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的影響實(shí)證研究徐建男蘇州市吳中區(qū)疾病預(yù)防控制中心江蘇215128摘要：目的研究不同滅活方式對(duì)物體表面攜帶的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的影響。方法用不同方法對(duì)標(biāo)本滅活后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)新型冠狀病毒肺炎病毒核酸。結(jié)果未滅活組和滅活組CT值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：F=48.74，Eta=0.72，P<0.05；N基因：F=65.597，Eta=0.781，P<0.05）；滅活組組間60℃，60℃30min和56℃45min之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P=0.306；N基因：P=0.920），60℃30min與75%乙醇之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P<0.05，N基因：P<0.05），56℃45min與75%乙醇之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P<0.05，N基因：P<0.05）。CT值在22~26間，未滅活組和滅活組無差異，CT值比較接近，隨著CT值的增大，未滅活組和滅活組處理差別逐漸加大，當(dāng)未滅活組CT值≥36時(shí)，不同處理的滅活組全部CT值＞40，而未滅活組CT值≥34時(shí)，75%乙醇處理CT值＞40。結(jié)論物體表面攜帶的2019新型冠狀病毒標(biāo)本在核酸檢測(cè)前進(jìn)行滅活處理，核酸檢測(cè)陽性結(jié)果有可能轉(zhuǎn)陰，75%乙醇處理相比60℃30min和56℃45min處理轉(zhuǎn)陰的機(jī)率更大。關(guān)鍵詞：物體表面2019新型冠狀病毒滅活實(shí)時(shí)熒光PCR2019年底，一種以發(fā)熱、肺部感染為主要癥狀的傳染性疾病在湖北武漢暴發(fā)，2020年1月12日，世界衛(wèi)生組織將引起此次疫情的病原正式命名為2019新型冠狀病毒（2019NewCoronavirus，2019-nCov）[1]。2月11日，國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布了關(guān)于修訂新型冠狀病毒肺炎英文命名事宜的通知，決定將“新型冠狀病毒肺炎”英文名稱修訂為“COVID-19”，同時(shí)，國(guó)際病毒分類委員會(huì)聲明，將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”。目前，國(guó)家衛(wèi)生健康委推薦的病原學(xué)檢查方法是實(shí)時(shí)PCR（Real-timePCR，RT-PCR）或/和新一代測(cè)序（Next-generationsequencing，NGS）方法[2]，由于NGS方法的價(jià)格昂貴，人員要求高等局限性，在基層醫(yī)療和疾控機(jī)構(gòu)仍然是以RT-PCR為主。中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》中，指出需將樣品56℃孵育至少45min或更高溫度進(jìn)行滅活[3]。Leclercq等[4]對(duì)MERS-Cov病毒研究在56℃孵育25min病毒滴度會(huì)降低10-4，進(jìn)一步升高溫度到65℃15min沒有任何殘留。Rabenau等[5]也發(fā)現(xiàn)在56℃孵育30min后，SARS-Cov病毒滴度低于檢測(cè)限，溫度升高到60℃30min，SARS-Cov病毒完全滅活。隨著調(diào)查研究的進(jìn)一步深入，相關(guān)方面證實(shí)物體攜帶2019新型冠狀病毒也可以傳染給人類，所以各級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)開展了對(duì)物體表面攜帶2019新型冠狀病毒的檢測(cè)。自2020年下半年起，為了明確SARS-CoV-2滅活后是否對(duì)核酸檢測(cè)有一定的影響，本研究將對(duì)滅活前和不同滅活方式（56℃45min、60℃30min、75%的乙醇處理）滅活后進(jìn)行比較分析。材料與方法1.1標(biāo)本來源選擇區(qū)級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)送檢的物體表面經(jīng)過核酸檢測(cè)PCR結(jié)果陽性標(biāo)本，10份（標(biāo)本號(hào)1-10）標(biāo)本為蘇州市相城區(qū)疾控中心篩選送檢的陽性標(biāo)本，10份（標(biāo)本號(hào)11-20）標(biāo)本為蘇州市工業(yè)園區(qū)疾控中心篩選送檢的陽性標(biāo)本。1.2標(biāo)本處理及滅活用DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，貨號(hào)：12430-054）處理標(biāo)本，1）100μl標(biāo)本+300μlDMEM4-8℃，30min；2）100μl標(biāo)本+300μlDMEM60℃，30min；3）100μl標(biāo)本+300μlDMEM56℃，45min；4）100μl標(biāo)本+300μl無水乙醇，形成終濃度75%的環(huán)境，4-8℃，30min。1.3核酸提取及熒光PCR檢測(cè)選用RocheMagNAPure96system全自動(dòng)核酸提取儀配套MagNaPure96DNAandViralNASmallVolumeKit試劑盒提取病毒核酸，選用達(dá)安生物科技有限公司的2019-Ncov核酸檢測(cè)試劑盒（國(guó)械注準(zhǔn)20203400063），按試劑盒說明書在羅氏LightCycler480II熒光RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)可以檢測(cè)ORF和N基因，陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)參考試劑說明書。所有標(biāo)本進(jìn)行3次重復(fù)，取平均循環(huán)閾值（CyclingThreshold，CT）進(jìn)行計(jì)算。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，未滅活組和不同滅活組間標(biāo)本的CT值采用Mauchly球形度檢驗(yàn)和Greenhouse-Geisser檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果未滅活組處理與滅活組處理后樣本Ct值比較對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，表1顯示各實(shí)驗(yàn)條件下ORF基因和N基因的CT值分布。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示未滅活組和滅活組CT值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：F=48.74，Eta=0.72，P<0.05；N基因：F=65.597，Eta=0.781，P<0.05）；滅活組組間60℃表1未滅活組與滅活組ORF基因和N基因平均CT值比較標(biāo)本號(hào)未滅活組（4-8℃）CT值滅活組60℃30min水浴CT值56℃45min水浴CT值75%乙醇（4-8℃）CT值ORFNORFNORFNORFN134.4433.6436.0435.4736.2934.78>4037.21223.7521.8123.8921.6524.1422.2525.2122.87333.9031.2434.9132.7735.1932.4336.6835.75425.0922.8425.8723.5625.6823.4727.2324.98530.7528.5332.2029.9131.5929.5733.6931.06634.5832.4935.8134.2536.4234.32>4037.52732.3629.9034.9731.9234.1730.7636.5635.54834.9832.8336.8734.4836.5534.65>40>40934.7532.3036.5633.6735.9634.07>4037.571033.7631.3735.4632.3434.9232.6837.8436.181136.6133.87>4037.78>4037.63>40>401236.4736.87>40>40>40>40>40>401329.6128.3631.7529.5631.5630.5434.8533.221436.3435.36>40>40>40>40>40>401537.3536.23>40>40>40>40>40>401630.5028.4332.5131.9733.0130.7235.2634.281736.7035.59>40>40>40>40>40>401837.0734.66>4036.72>4037.08>40>401036.5834.58>4037.22>4037.74>40>402036.2533.85>4036.42>4036.48>4037.0160℃30min和56℃45min之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P=0.306；N基因：P=0.920），60℃30min與75%乙醇之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P<0.05，N基因：P<0.05），56℃45min與75%乙醇之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ORF基因：P<0.05，N基因：P<0.05）。未滅活組處理和滅活組處理ORF基因和N基因CT值區(qū)間變化從圖1和圖2中可以看出CT值在22~26間，未滅活組和滅活組無差異，CT值比較接近，隨著CT值的增大，未滅活組和滅活組處理差別逐漸加大，當(dāng)未滅活組CT值≥36時(shí)，不同處理的滅活組全部CT值＞40，而未滅活組CT值≥34時(shí)，75%乙醇處理CT值＞40。圖1未滅活組處理和滅活組處理ORF基因CT值的區(qū)間變化圖2未滅活組處理和滅活組處理N基因CT值的區(qū)間變化討論新型冠狀病毒肺炎作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，其傳播速度快，感染性強(qiáng)，給全世界帶來了嚴(yán)重的健康威脅和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。核酸檢測(cè)作為目前確診COVID-19最主要的方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，在病毒早期快速診斷和動(dòng)態(tài)觀察抗病毒治療效果中具有優(yōu)勢(shì)[6]。SARS-COV-2屬于β屬冠狀病毒，與蝙蝠SARS樣冠狀病毒同源性超過85%，具有高度的傳染性[7]。新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第四版）中指出對(duì)紫外線和熱敏感、56℃30min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒[8]。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中如何能降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展核酸檢測(cè)有著非常重要的作用，由此在可采用前處理滅活病毒從而降低實(shí)驗(yàn)人員的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過對(duì)未滅活處理和滅活處理標(biāo)本的核酸CT值比較發(fā)現(xiàn)，未滅活組和各滅活組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在CT值22-26之間，未滅活處理和各滅活組之間無明顯差別，這也與陳培松等[9]研究結(jié)果一致，隨著未滅活組標(biāo)本CT值增加，各滅活組CT值相應(yīng)也會(huì)增大，但是當(dāng)未滅活組CT值=36及以上，滅活組CT值增加更大，CT值會(huì)超過40，依據(jù)試劑盒說明書要求CT值＞40判為陰性，由此會(huì)出現(xiàn)漏檢的可能。在滅活組60℃30min和56℃45min之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種滅活方式相差不大，而75%乙醇處理相比60℃30min和56℃45min處理，CT值增加更多，當(dāng)未滅活處理CT值=34及以上，75%乙醇處理就有可能會(huì)超過40，從而判為陰性。本研究其中10份（標(biāo)本號(hào)11-20），標(biāo)本12、14和15號(hào)如果選擇滅活處理的話，就非常有可能判為陰性，造成漏篩。由此本研究發(fā)現(xiàn)滅活處理確實(shí)會(huì)造成RNA降解，特別是當(dāng)病毒濃度比較低時(shí)，影響較大，有可能漏檢，這也與段秀枝等[10]研究一致。由此可見，物體表面攜帶的2019新型冠狀病毒標(biāo)本在核酸檢測(cè)前進(jìn)行滅活處理，核酸檢測(cè)陽性結(jié)果有可能轉(zhuǎn)陰，75%乙醇處理相比60℃30min和56℃45min處理轉(zhuǎn)陰的機(jī)率更大。因此在保障生物安全的前提下，是否進(jìn)行滅活標(biāo)本滅活處理，各實(shí)驗(yàn)室慎重選擇，避免出現(xiàn)有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。4小結(jié)進(jìn)行不同滅活方式對(duì)物體表面新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的影響的文章的撰寫，是因?yàn)檫@個(gè)是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中遇到的現(xiàn)實(shí)問題，市一級(jí)疾控中心為了確保后續(xù)研究和陽性標(biāo)本的復(fù)核需要一般不進(jìn)行滅活檢測(cè)，但是目前開展檢測(cè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)都對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了滅活，而且滅活的條件還不盡相同，遇到核酸滴度很低的標(biāo)本時(shí)極易漏檢，而這種漏檢在特殊情況下是有較大風(fēng)險(xiǎn)的，尤其是在大面積篩查時(shí)要注意這種風(fēng)險(xiǎn)。另外由于滅活會(huì)降低臨檢標(biāo)本的CT值，而這在現(xiàn)實(shí)檢測(cè)中會(huì)導(dǎo)致該類滅活標(biāo)本（臨界標(biāo)本）結(jié)果不易判讀，結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，復(fù)核結(jié)果也不易相同。造成結(jié)果漏檢或誤判。因此還是建議在高度懷疑標(biāo)本時(shí)不建議事先滅活檢測(cè)，可以在做好個(gè)人防護(hù)的情況下利用提取核酸的過程完成滅活。這樣能盡量避免檢測(cè)漏檢。此文中的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)還比較粗糙，實(shí)驗(yàn)路線中很多工作還沒有實(shí)施，有些數(shù)據(jù)體量較小，還不能很好的用于評(píng)價(jià)。因此建議使用其他高靈敏度的方法或抗原抗體方法來驗(yàn)證是否漏檢進(jìn)行更可靠的評(píng)價(jià)。方法不限于抗體、中和抗體、數(shù)字PCR和臨床進(jìn)展等來完善方法結(jié)論。5參考文獻(xiàn)[1]ZhuN,ZhangD,WangW,etal.AnovelcoronavirusfrompatientswithpneumoniainChina,2019[J].NewEnglandJournalofMedicine,2020.[2]國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳國(guó)家中醫(yī)藥管理局辦公室.新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕184號(hào)[S].2020:2020年3月3日.[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì).新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2020,100（00）:E003-E003.

[4]LeclercqI,BatéjatC,BurguièreAM,etal.HeatInactivationoftheMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus.InfluenzaOtherRespirViruses,2014,8（5）：585-586.[5]RabenauHF,CinatlJ,MorgensternB,etal.StabilityandinactivationofSARScoronavirus[J].Medicalmicrobiologyandimmunology,2005,1