ICS

TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIAXXX-XXXX

T/NAIA026—2021

土壤中蛋白酶的測定

Methodfordeterminationoftheproteasesinthesoil

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會(huì)發(fā)布

發(fā)布

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土壤中蛋白酶的測定

1范圍

本文件規(guī)定了土壤中蛋白酶的測定方法，其中包括原理、試劑、儀器與設(shè)備、分析步驟、

精密度。

本文件適用于土壤中蛋白酶的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適

用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1土壤蛋白酶

土壤蛋白酶參與土壤中存在的氨基酸、蛋白質(zhì)以及其他含蛋白質(zhì)氮的有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化。

它們的水解產(chǎn)物是高等植物的氮源之一。

4原理

采用酵素為基質(zhì)，利用土壤蛋白酶的酶促作用把蛋白質(zhì)水解成肽，肽進(jìn)一步水解為氨基

酸。氨基酸與茚三酮共熱反應(yīng)，生成藍(lán)紫色的絡(luò)合物（特征顏色反應(yīng)），其顏色深淺程度與

氨基酸的含量成正比，用分光光度計(jì)測定氨基酸含量。并以氨基氮的含量來表示土壤蛋白酶

的活性。

5試劑

所用試劑和水，在沒有注明其他要求時(shí)均為分析純試劑和GB/T6682中規(guī)定的二級水，

所述溶液若未指明溶劑均系水溶液。試驗(yàn)中所需制劑及制品在沒有注明其他要求時(shí)均按

GB/T603的規(guī)定制備。

5.11%酪素溶液（用pH7.4的0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液配制）：稱取10g酵素，加水

溶解，并移入1L的容量瓶中定容，搖勻備用。

5.2磷酸氫二鈉[c（Na2HPO4﹒7H2O）=0.2mol/L]溶液:稱取53.65g的磷酸氫二鈉于1000

mL燒杯中，溶于水中，并移入1L的容量瓶中定容，搖勻備用。

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5.3磷酸二氫鈉[c（NaH2PO4﹒H2O）=0.2mol/L]溶液:稱取27.80g的磷酸二氫鈉于1000

mL燒杯中，加水溶解，并移入1L的容量瓶中定容，搖勻備用。

5.4pH7.4的0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液：使用時(shí)，量取19.0mL（5.2）溶液和81.0mL

（5.3）溶液，并將其混合即可。

5.52%的茚三酮溶液（用丙酮配制）：稱取2g的茚三酮，溶于丙酮中，用丙酮稀釋至100

mL。

5.6甲苯

5.7甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1000g甘氨酸溶于水中，定容1000mL，即為0.0200

mg/mL氨基氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。直接用0.0200mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)系列。

5.8無水乙醇。

6儀器與設(shè)備

6.1恒溫培養(yǎng)箱

6.2離心機(jī)

6.3水浴鍋

6.4可見分光光度計(jì)

7分析步驟

7.1試液制備

稱取過2mm孔徑篩的風(fēng)干土4.00g，置于50mL的塑料離心管中，加1%酵素溶液20

mL和1mL甲苯，旋緊瓶蓋，搖勻后于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出，

冷卻。

過濾法：將培養(yǎng)液直接過濾，吸取10mL濾液于另一支塑料離心管中，加入20mL無水

乙醇，搖勻，常溫10000r/min離心5min。離心液備用。

離心法：將培養(yǎng)液于10000r/min離心5min，吸取5mL上清液，加入20mL無水乙醇,

搖勻，常溫10000r/min離心5min。離心液備用。

7.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定

分別準(zhǔn)確吸取0.0200mg/mL氨基氮標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、

4.00、5.00mL于50mL具塞比色管中，即為0.00、0.0040、0.0100、0.0200、0.0400、

0.0600、0.0800、0.100mg，加1mL茚三酮溶液，用水補(bǔ)足至5mL，沸水浴10min，將比

色管取出后，冷卻，用水稀釋至刻度。搖勻后于可見分光光度計(jì)570nm處比色，以吸光度

為縱坐標(biāo)，氨基氮的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，并繪制校準(zhǔn)曲線。

7.3測定

準(zhǔn)確吸取7.1所得離心液2mL于50mL具塞比色管中，以下同標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定。

7.4對照試驗(yàn)

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每個(gè)土壤樣品均做無基質(zhì)對照，以除掉土壤中原來含有的氨基氮而引起的誤差。整個(gè)試

驗(yàn)要做無土壤對照，分析步驟同樣品測定。

7.5結(jié)果計(jì)算

土壤蛋白酶的活性，以培養(yǎng)24h后1g土壤中氨基氮的質(zhì)量，用mg表示。按下列公式計(jì)

算：

XAD………（1）

式中：

X—1g土壤中氨基氮質(zhì)量