如何選擇合適的重組蛋白表達系統(tǒng)？重組蛋白表達是生物學(xué)、藥物開發(fā)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、診斷研發(fā)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)。選擇正確的表達系統(tǒng)（host/host‐expressionsystem）對于蛋白的產(chǎn)量、活性、結(jié)構(gòu)完整性以及下游應(yīng)用決定性意義。一個看似簡單的蛋白如果表達系統(tǒng)選錯，可能大量表達不出、折疊錯誤、承擔(dān)錯誤的翻譯后修飾（post‐translationalmodifications,PTMs）或形成包涵體，導(dǎo)致失敗。重組蛋白表達系統(tǒng)選擇流程框架某文獻中提出一個“四個關(guān)鍵問題（decisionpoints）”的流程，用來引導(dǎo)研究者選擇合適表達系統(tǒng)。1.蛋白來源是原核(prokaryotic)還是真核(eukaryotic)?如果目標蛋白本質(zhì)上為原核蛋白，則通常使用原核表達系統(tǒng)，如大腸桿菌(E.coli)；如果是真核蛋白，則可能需要真核系統(tǒng)來支持復(fù)雜的折疊及PTMs。2.若是真核蛋白，是否需要翻譯后修飾（PTMs）、多少個二硫鍵(disulfidebonds)、蛋白分子量(MW)、是否是膜蛋白/蛋白復(fù)合體？例如，如果蛋白含有多個(≥4)二硫鍵，或需要復(fù)雜的糖基化(glycosylation)，或MW很大(>100kDa)，或是大型膜蛋白，則傾向使用真核系統(tǒng)（酵母、昆蟲或哺乳動物細胞）。3.選擇哪種真核系統(tǒng)：酵母(yeast)、昆蟲細胞(insectcells)、哺乳動物細胞(mammaliancells)？真核系統(tǒng)之間主要差別體現(xiàn)在glycosylation類型（N‐、O‐糖基化的差異性）、蛋白折疊能力、分泌與分泌路徑(secretionpathways)、成本與速度。4.是否需要高產(chǎn)量/規(guī)?；磉_/頻繁表達？如果對蛋白產(chǎn)量要求高或者需要反復(fù)表達，那么“穩(wěn)定細胞株”(stablecellline)或者“使用病毒載體系統(tǒng)”（如baculovirusininsectcells）通常值得投入較多時間與資源；若只是短期或小規(guī)模實驗，可能選擇快速的transientexpression（如哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染表達）或發(fā)酵型酵母/細胞系。通過回答上述四個問題，可以在E.coli、酵母、昆蟲、哺乳動物或某些“異類”(exotic)系統(tǒng)中做出合理選擇。各表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點比較表達系統(tǒng)優(yōu)勢劣勢適用情況大腸桿菌(E.coli)快速、成本低、操作簡單、菌體生長快；產(chǎn)量高；很多工具/質(zhì)粒/株系成熟；適合原核蛋白，不需要復(fù)雜PTMs的情況。無或很有限的翻譯后修飾（尤其是復(fù)雜糖基化）；難以正確折疊含多個二硫鍵、多域蛋白或膜蛋白；易形成包涵體；一些蛋白可能對E.coli毒性較大。原核來源蛋白；真核蛋白但結(jié)構(gòu)簡單、不需要糖基化；蛋白規(guī)模較?。ㄒ话阈∮赲~100kDa）；研究初期快速表達、篩選或者做酶、抗原等用途。酵母(Yeast,如Saccharomycescerevisiae、Pichia/Komagataella)真核系統(tǒng)，具有一定的PTMs能力（蛋白折疊、分泌、糖基化雖然與哺乳動物不同）；能做較高密度發(fā)酵；成本中等；相對容易培養(yǎng)與規(guī)模化。糖基化型態(tài)與哺乳動物不同（高mannose/hyper‐mannose等）；分泌效率有時低；對某些蛋白折疊或分子間相互作用復(fù)雜性支持不足；可能出現(xiàn)蛋白降解問題。真核蛋白但對哺乳動物型糖基化要求不高；中等分子量／中等復(fù)雜性蛋白；需要中等產(chǎn)量；預(yù)算、設(shè)施不如哺乳動物細胞豐富。昆蟲細胞/Baculovirus表達系統(tǒng)(Insect/BEVS)真核系統(tǒng)；能做多種PTMs（盡管與哺乳動物存在差異,如sialylation程度不同）；蛋白折疊/分泌能力比酵母好；可以表達較大的蛋白或蛋白復(fù)合體；比哺乳動物細胞成本低一些；規(guī)模擴大較為可行。昆蟲糖基化非完全哺乳動物型；病毒操作需要設(shè)施安全控制；轉(zhuǎn)染載體準備（baculovirus株）周期相對較長；某些蛋白穩(wěn)定性或活性可能受限。需要較為復(fù)雜真核修飾但不要求完全哺乳動物型的蛋白；膜蛋白或復(fù)合體；中高量；結(jié)構(gòu)生物學(xué)要求較高但預(yù)算比哺乳動物低。哺乳動物細胞(Mammaliancells)提供最接近天然的折疊環(huán)境和PTMs（如復(fù)雜N‐糖基化、O‐糖基化、磷酸化、以及蛋白修飾/剪切/定位等）；適合復(fù)雜蛋白、抗體、疫苗蛋白、膜蛋白等；表達蛋白功能性高。成本高（培養(yǎng)基、設(shè)備、無菌空間、轉(zhuǎn)染或病毒載體生產(chǎn)等）；培養(yǎng)周期慢；設(shè)施與技術(shù)要求高；產(chǎn)量通常比E.coli或酵母低；如果做stablecellline建立耗時。對蛋白功能性要求非常高、需要人類型PTMs的蛋白；抗體或者藥物候選蛋白；臨床/診斷應(yīng)用；膜蛋白、高度復(fù)雜的蛋白復(fù)合體。其他需要考慮的關(guān)鍵因素1.目標用途（downstreamapplication）結(jié)構(gòu)生物學(xué)（晶體學(xué)、電鏡、NMR）：通常要求蛋白折疊良好、均一、盡可能接近天然修飾。功能/活性研究：需要確保PTMs、輔因子、膜環(huán)境（若為膜蛋白）等正確。抗體/疫苗/治療蛋白：人性化修飾、免疫原性、糖型等至關(guān)重要。工業(yè)酶/大規(guī)模生物制劑：產(chǎn)量與成本要求往往比PTMs要求更寬松。2.蛋白穩(wěn)定性/可溶性/折疊難度多域蛋白、較大蛋白更易在表達中折疊不良。二硫鍵數(shù)量：多個二硫鍵在還原環(huán)境中折斷，需要分泌或在特定空間（如大腸桿菌的periplasm）表達。膜蛋白或含膜錨蛋白片段：表達在親脂環(huán)境中或需要共表達伴侶／輔助蛋白。3.翻譯后修飾（PTMs）Glycosylation（N‐和O‐型）；磷酸化、羥基化、甲基化、脂肪酸化等；蛋白末端剪切/signalpeptide；有輔因子的蛋白，如需金屬離子、輔酶、輔蛋白。4.表達產(chǎn)量與成本含培養(yǎng)基、設(shè)備、人工、純化過程等成本。表達周期（從構(gòu)建載體到得到純化蛋白所需時間）。規(guī)模試驗vs規(guī)模生產(chǎn)的可行性。5.時間與資源限制實驗室或企業(yè)是否具備相應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)施與經(jīng)驗。比如有些實驗室對哺乳動物細胞操作熟練，有些則沒有；是否可獲得baculovirusvector系統(tǒng)等。操作復(fù)雜性與安全性要求（病毒載體、動物細胞可能需要更嚴格的實驗室條件）。6.免疫原性/臨床應(yīng)用要求若蛋白用于人體用途，需要人類類型的糖基化、低免疫原性。表達系統(tǒng)可能影響外源糖基、非人類糖殘基等。合規(guī)性（GMP條件、純度的要求等）。7.可擴展性若將來需要大規(guī)模生產(chǎn)，表達系統(tǒng)必須具備從研究規(guī)模放大到生產(chǎn)規(guī)模的能力。重組蛋白表達系統(tǒng)選擇流程建議1.收集蛋白的基本信息*來源（物種、原核or真核）*氨基酸序列：是否存在signalpeptide,transmembranedomains,glycosylationsites,cysteine二硫鍵數(shù)目等*分子量/結(jié)構(gòu)（單域／多域／復(fù)合體）*有無已知輔因子、必需的PTMs2.確定目標與用途*是用于結(jié)構(gòu)研究、功能驗證、免疫反應(yīng)、疫苗、診斷、藥物開發(fā)或工業(yè)應(yīng)用？*是否對蛋白活性/折疊/糖基化有嚴格要求？*所需蛋白純度、數(shù)量、時間節(jié)點。3.初步選擇表達系統(tǒng)類別根據(jù)第一步中蛋白屬性，如果蛋白簡單–原核系統(tǒng)可嘗試；若真核蛋白且需要多重PTMs、復(fù)雜結(jié)構(gòu)，則考慮真核系統(tǒng)。4.比較真核系統(tǒng)內(nèi)的選項若確定真核系統(tǒng)，需要在酵母、昆蟲、哺乳動物間比較：哪個可以提供所需glycosylation類型、分泌效率、成本、設(shè)施支持等。5.評估時間／資源與實驗室能力*是否有經(jīng)驗做哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定株？*是否有baculovirus操作經(jīng)驗？*是否有設(shè)備、培養(yǎng)基、無菌操作支持這些系統(tǒng)？6.進行小規(guī)模試驗（pilot）在候選系統(tǒng)中做幾個小規(guī)模表達測試，以驗證可溶性、產(chǎn)量、活性或正確修飾。7.優(yōu)化表達構(gòu)建/條件*載體選擇，如強啟動子、融合標簽（tag）以幫助折疊或純化、定位信號等。*密度、溫度、誘導(dǎo)條件、共表達伴侶/輔因子等。*如果是在真核系統(tǒng)中，檢測glycan類型、翻譯后修飾狀態(tài)。8.決定最終系統(tǒng)并擴大規(guī)模如果目標是生產(chǎn)大量蛋白或長期用途，投入建立stablecellline或scale‐upinsect/mammalianbatch/發(fā)酵系統(tǒng)。基于上述分析，下面是幾個總結(jié)性建議，可用作快速參考：先不要急于選最“高級”的系統(tǒng)，先評估蛋白屬性與需求；往往一個簡單系統(tǒng)已經(jīng)足夠。規(guī)劃好downstream活性／修飾要求，如果功能性依賴P