嗜肺軍團(tuán)菌非E1、E2依賴新型泛素化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析一、引言1.1研究背景嗜肺軍團(tuán)菌（Legionellapneumophila）作為一種革蘭氏陰性菌，是引發(fā)軍團(tuán)菌?。↙egionnaires'disease）的主要病原體，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域備受關(guān)注。軍團(tuán)菌病主要包括兩種臨床類型，即癥狀較為嚴(yán)重的軍團(tuán)菌肺炎和癥狀相對較輕的龐蒂亞克熱（Pontiacfever）。其中，軍團(tuán)菌肺炎具有較高的致死率，尤其對免疫力低下人群，如老年人、免疫系統(tǒng)受損者以及慢性疾病患者等，構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。嗜肺軍團(tuán)菌廣泛存在于自然環(huán)境中，如土壤、水體以及人工供水系統(tǒng)等，其生存和傳播途徑多樣，使得防控難度較大。當(dāng)人們吸入含有嗜肺軍團(tuán)菌的氣溶膠時，就有可能感染該病菌，進(jìn)而引發(fā)疾病。隨著城市化進(jìn)程的加速和公共設(shè)施的廣泛使用，如空調(diào)系統(tǒng)、熱水供應(yīng)系統(tǒng)等，嗜肺軍團(tuán)菌的傳播風(fēng)險進(jìn)一步增加，因此，深入了解嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制對于制定有效的防控策略至關(guān)重要。泛素化反應(yīng)作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，在真核生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。這一過程涉及泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的協(xié)同作用，它們共同完成對底物蛋白的泛素化修飾。具體而言，E1利用ATP供能，將泛素分子激活，形成高能硫酯鍵，使泛素的C端甘氨酸殘基與E1的活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基共價結(jié)合；活化的泛素通過轉(zhuǎn)?；磻?yīng)從E1轉(zhuǎn)移到E2的活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基上；最后，E2與E3共同識別靶蛋白，將泛素分子連接至靶蛋白的賴氨酸殘基上，從而完成對靶蛋白的泛素化修飾。泛素化反應(yīng)幾乎參與了細(xì)胞內(nèi)所有重要的生命活動，包括細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、DNA損傷修復(fù)以及免疫應(yīng)答等。在細(xì)胞周期調(diào)控中，泛素化修飾能夠標(biāo)記并降解特定的蛋白質(zhì)，從而推動細(xì)胞周期的順利進(jìn)行；在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，泛素化可以作為一種信號，調(diào)節(jié)信號通路的激活與關(guān)閉；在免疫應(yīng)答方面，泛素化參與了抗原呈遞和免疫細(xì)胞的激活等過程，對機(jī)體的免疫防御起著關(guān)鍵作用。一旦泛素化反應(yīng)出現(xiàn)異常，就可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及感染性疾病等。在腫瘤發(fā)生過程中，泛素化途徑的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤抑制因子的降解或原癌基因的激活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展；在神經(jīng)退行性疾病中，泛素化異常與錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)無法被及時清除有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。嗜肺軍團(tuán)菌在長期的進(jìn)化過程中，發(fā)展出了一套獨(dú)特的策略來操控宿主細(xì)胞的泛素化系統(tǒng)，以利于自身的生存和繁殖。研究表明，嗜肺軍團(tuán)菌能夠分泌多種效應(yīng)蛋白，這些蛋白可以直接作用于宿主細(xì)胞的泛素化相關(guān)分子，干擾泛素化反應(yīng)的正常進(jìn)行。通過調(diào)節(jié)宿主泛素化途徑，嗜肺軍團(tuán)菌可以抑制宿主的免疫應(yīng)答，逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除；還能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬等過程，為自身創(chuàng)造一個適宜的生存環(huán)境。然而，嗜肺軍團(tuán)菌中存在一種不依賴于E1和E2的新型泛素化反應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)的泛素化反應(yīng)模式，為深入理解嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制帶來了新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。對這種新型泛素化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，不僅有助于揭示嗜肺軍團(tuán)菌獨(dú)特的致病機(jī)制，還可能為開發(fā)新型抗菌藥物提供潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。通過解析新型泛素化反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)，我們可以深入了解其作用機(jī)制，從而有針對性地設(shè)計小分子抑制劑，阻斷嗜肺軍團(tuán)菌對宿主細(xì)胞泛素化系統(tǒng)的操控，為治療軍團(tuán)菌病提供新的策略。1.2研究目的和意義本研究旨在從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度深入剖析嗜肺軍團(tuán)菌不依賴于E1和E2的新型泛素化反應(yīng)，具體目標(biāo)包括解析參與新型泛素化反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白的三維結(jié)構(gòu)，明確這些蛋白之間的相互作用模式和結(jié)合位點(diǎn)，以及揭示新型泛素化反應(yīng)的詳細(xì)分子機(jī)制。通過這些研究，我們期望能夠全面了解嗜肺軍團(tuán)菌利用新型泛素化反應(yīng)操控宿主細(xì)胞的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步理解嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制提供關(guān)鍵線索。從理論意義來看，嗜肺軍團(tuán)菌中新型泛素化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，為泛素化領(lǐng)域的研究開辟了新的方向。傳統(tǒng)的泛素化反應(yīng)依賴于E1、E2和E3的協(xié)同作用，而這種不依賴E1和E2的新型反應(yīng)模式打破了人們對泛素化機(jī)制的傳統(tǒng)認(rèn)知。對其進(jìn)行深入研究，將有助于填補(bǔ)我們在泛素化反應(yīng)多樣性方面的知識空白，進(jìn)一步完善泛素化理論體系。同時，通過解析新型泛素化反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)，我們可以從原子層面揭示蛋白質(zhì)相互作用和催化反應(yīng)的機(jī)制，這對于理解細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生命過程具有重要的推動作用，為其他相關(guān)領(lǐng)域的研究提供新的思路和方法，豐富我們對細(xì)胞生命過程的認(rèn)知。在實(shí)際應(yīng)用方面，嗜肺軍團(tuán)菌引發(fā)的軍團(tuán)菌病嚴(yán)重威脅人類健康，而目前臨床上針對該疾病的治療手段仍存在一定的局限性。深入研究新型泛素化反應(yīng)，有望為開發(fā)新型抗菌藥物提供潛在的靶點(diǎn)。通過明確新型泛素化反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白和作用機(jī)制，我們可以設(shè)計小分子抑制劑，特異性地阻斷嗜肺軍團(tuán)菌對宿主細(xì)胞泛素化系統(tǒng)的操控，從而抑制嗜肺軍團(tuán)菌的生長和繁殖，達(dá)到治療軍團(tuán)菌病的目的。這不僅為軍團(tuán)菌病的治療提供了新的策略，也為解決其他感染性疾病的治療難題提供了借鑒，有助于推動抗菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會效益。1.3研究現(xiàn)狀與不足近年來，隨著對嗜肺軍團(tuán)菌致病機(jī)制研究的不斷深入，嗜肺軍團(tuán)菌不依賴于E1和E2的新型泛素化反應(yīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)，取得了一系列重要進(jìn)展。2016年，羅招慶實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌SidE家族蛋白催化一種不依賴E1和E2的非經(jīng)典泛素化過程。在該酶促反應(yīng)中，SidE首先催化泛素形成ADP-核糖基化的中間體（ADPR-Ub），隨后其磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域催化剪切，將ADPR-Ub的磷酸核糖化泛素（PR-Ub）轉(zhuǎn)移連接到修飾底物的絲氨酸上，這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)泛素化反應(yīng)模式，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。2018年，馮越教授研究組報道了嗜肺軍團(tuán)菌內(nèi)一種新型的泛素修飾與連接酶——SdeA及其與泛素復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了其修飾泛素及催化新型泛素化過程的工作機(jī)理，解析了SdeA及其與泛素復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，闡明了其識別泛素的機(jī)理，并提出了SdeA修飾泛素過程中泛素的構(gòu)象變化假設(shè)，為深入理解新型泛素化反應(yīng)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息。然而，目前對于嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的研究仍存在諸多不足。在反應(yīng)機(jī)制方面，雖然已經(jīng)明確了部分關(guān)鍵蛋白如SidE、SdeA等的作用及基本反應(yīng)步驟，但對于整個新型泛素化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中各蛋白之間的協(xié)同作用機(jī)制仍不清楚。例如，除了已知的關(guān)鍵蛋白外，是否還存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的輔助蛋白參與這一過程，它們之間如何相互協(xié)作以實(shí)現(xiàn)高效的泛素化修飾，這些問題都有待進(jìn)一步探索。而且，新型泛素化反應(yīng)的底物特異性識別機(jī)制也尚未完全明確，哪些宿主蛋白是新型泛素化反應(yīng)的真正靶點(diǎn)，以及嗜肺軍團(tuán)菌如何精準(zhǔn)地選擇這些底物進(jìn)行修飾，目前還缺乏深入的研究。在結(jié)構(gòu)解析方面，雖然已經(jīng)解析了SdeA等少數(shù)關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)，但對于參與新型泛素化反應(yīng)的其他重要蛋白，如SidE家族蛋白的結(jié)構(gòu)研究還相對較少。由于蛋白的結(jié)構(gòu)決定其功能，缺乏這些關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)信息，將極大地限制我們對新型泛素化反應(yīng)分子機(jī)制的深入理解。此外，目前對于蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的研究也較為有限，新型泛素化反應(yīng)中各蛋白之間形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化過程尚不清楚，這對于闡明它們之間的相互作用模式和催化機(jī)制至關(guān)重要。從調(diào)控機(jī)制角度來看，目前對嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制研究還處于起步階段。雖然已知一些效應(yīng)蛋白如DupA/B可對磷酸核糖泛素化底物進(jìn)行去泛素化，但對于整個新型泛素化反應(yīng)是如何在時空上進(jìn)行精確調(diào)控的，仍然知之甚少。在嗜肺軍團(tuán)菌感染宿主細(xì)胞的不同階段，新型泛素化反應(yīng)是如何被激活和抑制的，哪些信號通路參與了這一調(diào)控過程，這些問題都亟待解決。而且，宿主細(xì)胞對嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的防御機(jī)制也尚未明確，宿主細(xì)胞如何感知并應(yīng)對這種新型的泛素化修飾，是否存在相應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，這些方面的研究還存在很大的空白。二、嗜肺軍團(tuán)菌與新型泛素化反應(yīng)2.1嗜肺軍團(tuán)菌概述嗜肺軍團(tuán)菌（Legionellapneumophila）是一種革蘭氏陰性菌，隸屬于軍團(tuán)菌屬，是引發(fā)軍團(tuán)菌病的主要病原菌。1976年，美國費(fèi)城的退伍軍人大會期間，一場不明原因的肺炎爆發(fā)，從患者體內(nèi)成功分離出這種細(xì)菌，隨后將其命名為嗜肺軍團(tuán)菌。從形態(tài)結(jié)構(gòu)來看，嗜肺軍團(tuán)菌呈現(xiàn)為短小桿菌狀，具備多形性特征，擁有鞭毛、菌毛以及微莢膜結(jié)構(gòu)，但不形成芽孢。在染色特性上，其為革蘭氏陰性菌，不過由于細(xì)胞壁中脂質(zhì)含量較高，普通染色方法難以使其著色，通常需要采用特殊的染色技術(shù)，如鍍銀染色法或直接免疫熒光染色法，以便在顯微鏡下清晰觀察到菌體形態(tài)。這種細(xì)菌為專性需氧菌，在2.5%-5%的二氧化碳環(huán)境中生長狀況良好，對營養(yǎng)的要求較為苛刻，需要在特殊的培養(yǎng)基，如活性炭酵母浸出液瓊脂（BCYE）培養(yǎng)基上才能生長，且生長速度緩慢，一般需要3-5天才能觀察到針尖大小的灰白色S型菌落。在抗原組成方面，主要包含O抗原和H抗原，依據(jù)O抗原可將其劃分為1-16個血清型，其中1型是從人群中分離出的最為常見的血清型，也是1976年軍團(tuán)病的病原菌，而我國主要流行的血清型為1型和6型。嗜肺軍團(tuán)菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這在機(jī)體對該菌的免疫防御過程中發(fā)揮著重要作用。嗜肺軍團(tuán)菌在自然界中分布廣泛，普遍存在于天然淡水和人工水域環(huán)境中，諸如自來水、熱水淋浴系統(tǒng)、中央空調(diào)的冷卻塔等。其主要傳播途徑為氣溶膠空氣傳播和污染水吸入傳播。當(dāng)含有嗜肺軍團(tuán)菌的氣溶膠被人體吸入后，細(xì)菌可直接進(jìn)入呼吸道，進(jìn)而感染肺部組織；而誤吸入被細(xì)菌污染的水，也會導(dǎo)致感染的發(fā)生。在特定的環(huán)境條件下，如空調(diào)系統(tǒng)的冷卻塔、熱水供應(yīng)系統(tǒng)等，若水溫、水質(zhì)等條件適宜，嗜肺軍團(tuán)菌能夠大量繁殖，形成高濃度的菌群，增加傳播風(fēng)險。若冷卻塔的水溫保持在36-70℃，且水中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，嗜肺軍團(tuán)菌就可以在其中快速生長繁殖，當(dāng)冷卻塔運(yùn)行時，產(chǎn)生的氣溶膠中就可能攜帶大量的細(xì)菌，一旦被周圍人群吸入，就容易引發(fā)感染。嗜肺軍團(tuán)菌主要引發(fā)軍團(tuán)病，臨床上主要分為兩種類型：龐蒂亞克熱型和肺炎型。龐蒂亞克熱型的潛伏期較短，一般為5-66小時，臨床表現(xiàn)相對較輕，主要有發(fā)熱、咳嗽、頭痛、肌痛和胸痛等癥狀，但通常不會出現(xiàn)肺炎癥狀，多數(shù)患者可在數(shù)天內(nèi)自行恢復(fù)。肺炎型則病情較為嚴(yán)重，患者會出現(xiàn)高熱、頭痛、寒顫、干咳、咳痰等感染中毒癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡。該菌還可能引發(fā)肺外感染，累及腦、腸、腎、肝、脾、腹膜、前列腺、心包膜、骨髓、皮膚及筋膜、直腸、心肌、外周淋巴結(jié)、甲狀腺、胰腺、睪丸和肌肉等多個器官和組織，引發(fā)相應(yīng)的癥狀，如神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（意識障礙、頸強(qiáng)直等）、消化系統(tǒng)癥狀（惡心、嘔吐、腹瀉等），進(jìn)一步加重患者的病情，增加治療難度。據(jù)美國疾病控制中心（CDC）報告，1990-2005年間有23076例軍團(tuán)菌感染病例；2007年歐洲33個國家報道了5906例，2007-2008年的病死率為6.6%；2003年中國北京報道一起軍團(tuán)病暴發(fā)，共有76人發(fā)病，罹患率為13.3%。這些數(shù)據(jù)表明，嗜肺軍團(tuán)菌感染在全球范圍內(nèi)都有發(fā)生，且對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，其引發(fā)的軍團(tuán)病不僅給患者的身體健康帶來極大危害，也給醫(yī)療資源帶來了沉重負(fù)擔(dān)，因此，深入研究嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制以及防控措施具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。2.2泛素化反應(yīng)基礎(chǔ)泛素（ubiquitin）是一種高度保守的小分子蛋白質(zhì)，由76個氨基酸殘基組成，分子量約為8.5kDa，廣泛存在于所有真核生物細(xì)胞中。從結(jié)構(gòu)上看，泛素分子呈現(xiàn)出緊密的球狀結(jié)構(gòu)，由一個N端結(jié)構(gòu)域、一個中央β折疊區(qū)域和一個C端α螺旋區(qū)構(gòu)成。N端結(jié)構(gòu)域包含多個氨基酸殘基，這些殘基在泛素與其他蛋白質(zhì)的相互作用中發(fā)揮著重要作用；中央β折疊區(qū)域由多條β鏈組成，形成了穩(wěn)定的β片層結(jié)構(gòu)，為泛素分子提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；C端α螺旋區(qū)則較為靈活，其中的甘氨酸殘基在泛素化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，它能夠與其他分子形成共價鍵，實(shí)現(xiàn)泛素的連接和傳遞。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了泛素多樣的生物學(xué)功能，使其在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫應(yīng)答和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多重要生命活動中扮演著不可或缺的角色。在蛋白質(zhì)降解過程中，泛素通過與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成多聚泛素鏈，標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，然后將其送至蛋白酶體進(jìn)行降解。這一過程確保了細(xì)胞內(nèi)異?；蚨嘤嗟鞍踪|(zhì)的及時清除，維持了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，泛素化修飾參與了細(xì)胞周期蛋白的降解，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的水平，精確控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，確保細(xì)胞在正確的時機(jī)啟動分裂，并在分裂結(jié)束時確保所有染色體正確分配到兩個子細(xì)胞中。在免疫應(yīng)答中，泛素化參與了抗原呈遞和免疫細(xì)胞的激活等過程。例如，在抗原呈遞過程中，泛素化修飾可以標(biāo)記抗原蛋白，促進(jìn)其被抗原呈遞細(xì)胞攝取和加工，進(jìn)而激活T細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)；在免疫細(xì)胞激活過程中，泛素化信號可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表面受體的活性，影響免疫細(xì)胞的增殖、分化和功能發(fā)揮，對機(jī)體的免疫防御起著關(guān)鍵作用。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，泛素化可以作為一種信號，調(diào)節(jié)信號通路的激活與關(guān)閉。當(dāng)細(xì)胞接收到外界信號時，特定的蛋白質(zhì)會發(fā)生泛素化修飾，從而招募下游信號分子，激活或抑制相應(yīng)的信號通路，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對外界刺激的準(zhǔn)確響應(yīng)。泛素化反應(yīng)是一個復(fù)雜且有序的過程，經(jīng)典的泛素化反應(yīng)依賴于泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的協(xié)同作用，通過三步酶促級聯(lián)反應(yīng)完成對底物蛋白的泛素化修飾。具體過程如下：激活階段：在ATP的參與下，E1首先與泛素分子的C端甘氨酸殘基結(jié)合，形成高能硫酯鍵，將泛素激活。這一過程中，ATP水解提供能量，使泛素分子的構(gòu)象發(fā)生改變，處于活化狀態(tài)，為后續(xù)的反應(yīng)做好準(zhǔn)備。E1與泛素形成的復(fù)合物具有較高的反應(yīng)活性，能夠順利地將泛素轉(zhuǎn)移到下一個酶上。結(jié)合階段：活化的泛素通過轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)從E1轉(zhuǎn)移到E2的活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基上，形成E2-泛素硫酯中間體。E2作為泛素的載體，在泛素化反應(yīng)中起著關(guān)鍵的橋梁作用，它不僅能夠穩(wěn)定泛素分子，還能將泛素準(zhǔn)確地傳遞到目標(biāo)底物上。不同的E2具有一定的底物特異性，能夠識別不同的泛素連接酶和底物蛋白，從而參與不同的泛素化反應(yīng)途徑。連接階段：E2與E3共同識別靶蛋白，E3催化泛素分子從E2轉(zhuǎn)移至靶蛋白的賴氨酸殘基上，形成異肽鍵，完成對靶蛋白的單泛素化修飾。在某些情況下，多個泛素分子可以依次連接到已結(jié)合的泛素分子上，形成多聚泛素鏈。E3在泛素化反應(yīng)中具有底物特異性，它能夠識別特定的靶蛋白，并將泛素連接到靶蛋白的特定賴氨酸殘基上。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，E3主要分為RING（ReallyInterestingNewGene）結(jié)構(gòu)域型E3和HECT（HomologoustotheE6-associatedProteinC-Terminus）結(jié)構(gòu)域型E3。RING型E3通過與E2和靶蛋白相互作用，促進(jìn)泛素從E2直接轉(zhuǎn)移到靶蛋白上；HECT型E3則先與泛素形成硫酯中間體，然后再將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。多聚泛素鏈的形成進(jìn)一步增強(qiáng)了對靶蛋白的標(biāo)記作用，使其更容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識別和降解，從而實(shí)現(xiàn)對靶蛋白功能的調(diào)節(jié)。經(jīng)典泛素化反應(yīng)中，E1、E2和E3之間的協(xié)同作用高度精確且有序，確保了泛素化修飾能夠準(zhǔn)確地發(fā)生在特定的底物蛋白上，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)各種生命活動的精細(xì)調(diào)控。任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都可能導(dǎo)致泛素化反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞功能紊亂和疾病的發(fā)生。2.3嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)介紹2.3.1新型泛素化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)源于對嗜肺軍團(tuán)菌致病機(jī)制的深入探索。傳統(tǒng)認(rèn)知中，泛素化反應(yīng)依賴E1、E2和E3的協(xié)同作用，但隨著對嗜肺軍團(tuán)菌研究的不斷深入，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)了一些無法用傳統(tǒng)泛素化理論解釋的現(xiàn)象。2016年，羅招慶實(shí)驗(yàn)室首次報道了嗜肺軍團(tuán)菌中存在一種不依賴E1和E2的新型泛素化反應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)如同一顆重磅炸彈，打破了傳統(tǒng)泛素化反應(yīng)模式的固有認(rèn)知，引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。研究人員在對嗜肺軍團(tuán)菌感染宿主細(xì)胞的過程進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)了一類特殊的效應(yīng)蛋白——SidE家族蛋白。通過一系列的實(shí)驗(yàn)，包括蛋白質(zhì)純化、體外酶活測定、質(zhì)譜分析以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等，他們發(fā)現(xiàn)SidE家族蛋白能夠催化一種非經(jīng)典的泛素化過程。在該酶促反應(yīng)中，SidE首先利用其單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（mART）結(jié)構(gòu)域，催化泛素形成ADP-核糖基化的中間體（ADPR-Ub），這一步反應(yīng)需要NAD+作為底物，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到泛素的特定氨基酸殘基上；隨后，其磷酸二酯酶（PDE）結(jié)構(gòu)域催化剪切，將ADPR-Ub的磷酸核糖化泛素（PR-Ub）轉(zhuǎn)移連接到修飾底物的絲氨酸上，從而完成對底物的泛素化修飾。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了嗜肺軍團(tuán)菌獨(dú)特的致病機(jī)制，也為泛素化領(lǐng)域的研究開辟了新的方向。此后，眾多研究團(tuán)隊(duì)圍繞這一新型泛素化反應(yīng)展開了深入研究，不斷揭示其更多的細(xì)節(jié)和奧秘。2.3.2反應(yīng)過程與特點(diǎn)嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)不依賴于E1和E2，其反應(yīng)過程具有獨(dú)特的步驟和顯著的特點(diǎn)。在反應(yīng)過程中，以SidE家族蛋白為例，首先是激活階段，SidE蛋白的mART結(jié)構(gòu)域利用NAD+作為底物，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到泛素分子第42位的精氨酸殘基上，形成ADPR-Ub中間體。這一過程不同于經(jīng)典泛素化反應(yīng)中E1利用ATP激活泛素，而是通過獨(dú)特的ADP-核糖基化方式激活泛素，不需要ATP參與，且反應(yīng)位點(diǎn)為泛素的精氨酸殘基，與經(jīng)典泛素化反應(yīng)中泛素C端甘氨酸殘基的活化位點(diǎn)不同。接著是連接階段，SidE蛋白的PDE結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用，催化ADPR-Ub中間體發(fā)生磷酸二酯鍵的斷裂，將磷酸核糖化泛素（PR-Ub）轉(zhuǎn)移到靶蛋白的絲氨酸殘基上，完成對靶蛋白的泛素化修飾。而經(jīng)典泛素化反應(yīng)中，是E2與E3協(xié)同作用，將泛素連接到靶蛋白的賴氨酸殘基上。新型泛素化反應(yīng)直接由單個效應(yīng)蛋白（如SidE）完成激活和連接兩個關(guān)鍵步驟，無需E1、E2的參與，反應(yīng)過程相對簡潔，這是其區(qū)別于經(jīng)典泛素化反應(yīng)的重要特征之一。在底物方面，經(jīng)典泛素化反應(yīng)的底物主要是蛋白質(zhì)，且通常是通過識別蛋白質(zhì)上特定的氨基酸序列或結(jié)構(gòu)模體來實(shí)現(xiàn)底物特異性。而嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的底物除了蛋白質(zhì)外，還可能包括一些與宿主細(xì)胞生理過程密切相關(guān)的其他生物分子，且其底物特異性識別機(jī)制與經(jīng)典泛素化反應(yīng)不同，可能更多地依賴于效應(yīng)蛋白與底物之間的特定相互作用模式，這種相互作用模式可能涉及到蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、電荷分布以及其他一些尚未明確的因素。在修飾位點(diǎn)上，經(jīng)典泛素化主要發(fā)生在靶蛋白的賴氨酸殘基上，通過形成異肽鍵將泛素連接到賴氨酸的ε-氨基上。而新型泛素化反應(yīng)則主要將泛素連接到靶蛋白的絲氨酸殘基上，形成的是一種磷酸酯鍵，這種修飾位點(diǎn)和連接鍵的差異，使得新型泛素化修飾后的底物蛋白在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)和功能調(diào)節(jié)方式可能與經(jīng)典泛素化修飾后的底物蛋白存在顯著差異。2.3.3關(guān)鍵效應(yīng)蛋白參與嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白主要包括SidE家族蛋白，如SdeA、SdeB、SdeC和SdeD等，它們在新型泛素化反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，SidE家族蛋白通常包含多個結(jié)構(gòu)域，以SdeA為例，它含有N端的mART結(jié)構(gòu)域、中間的PDE結(jié)構(gòu)域以及C端的未知功能結(jié)構(gòu)域。mART結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化泛素的ADP-核糖基化，其結(jié)構(gòu)與其他已知的mART蛋白具有一定的相似性，但也存在一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，這些獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征可能決定了其對泛素的特異性識別和修飾能力；PDE結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)催化磷酸核糖化泛素與靶蛋白絲氨酸殘基的連接反應(yīng)，該結(jié)構(gòu)域具有典型的磷酸二酯酶活性中心結(jié)構(gòu)，能夠特異性地結(jié)合和催化底物；C端結(jié)構(gòu)域雖然功能尚未完全明確，但研究表明它可能在蛋白的定位、與其他蛋白的相互作用以及反應(yīng)的調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。在新型泛素化反應(yīng)中，這些關(guān)鍵效應(yīng)蛋白發(fā)揮著不同的作用機(jī)制。SdeA的mART結(jié)構(gòu)域首先識別并結(jié)合泛素和NAD+，通過催化反應(yīng)將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到泛素的R42位點(diǎn)，形成ADPR-Ub中間體。在這一過程中，mART結(jié)構(gòu)域的活性中心與泛素和NAD+的結(jié)合位點(diǎn)精確匹配，使得反應(yīng)能夠高效進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，mART結(jié)構(gòu)域中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基，如催化位點(diǎn)的氨基酸殘基以及參與底物結(jié)合的氨基酸殘基，對于反應(yīng)的進(jìn)行至關(guān)重要，這些氨基酸殘基的突變會導(dǎo)致mART結(jié)構(gòu)域失去催化活性或降低對底物的親和力。隨后，PDE結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合ADPR-Ub中間體，通過催化磷酸二酯鍵的斷裂，將PR-Ub轉(zhuǎn)移到靶蛋白的絲氨酸殘基上。PDE結(jié)構(gòu)域?qū)DPR-Ub中間體的識別具有高度特異性，其活性中心能夠精確地結(jié)合ADPR-Ub的特定區(qū)域，促進(jìn)磷酸酯鍵的形成，從而實(shí)現(xiàn)對靶蛋白的泛素化修飾。而SdeB、SdeC和SdeD等其他SidE家族蛋白，雖然具體的作用底物和生物學(xué)功能可能存在一定差異，但它們都通過類似的mART和PDE結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，參與新型泛素化反應(yīng)，共同調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生理過程，以利于嗜肺軍團(tuán)菌的生存和繁殖。三、新型泛素化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法3.1蛋白表達(dá)與純化從嗜肺軍團(tuán)菌中獲取相關(guān)蛋白基因是研究新型泛素化反應(yīng)的首要關(guān)鍵步驟。首先，需從臨床樣本或環(huán)境樣本中分離培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)菌。對于臨床樣本，如患者的痰液、肺泡灌洗液等，可采用選擇性培養(yǎng)基，如活性炭酵母浸出液瓊脂（BCYE）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基能夠提供嗜肺軍團(tuán)菌生長所需的特殊營養(yǎng)成分，抑制其他雜菌的生長，從而實(shí)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌的有效分離。在環(huán)境樣本方面，若采集的是水樣，可通過過濾濃縮等方法富集細(xì)菌，再接種到BCYE培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)得到嗜肺軍團(tuán)菌后，提取其基因組DNA?？刹捎贸Ｒ?guī)的基因組DNA提取試劑盒，利用試劑盒中的裂解液裂解細(xì)菌細(xì)胞，釋放出基因組DNA，再通過柱純化等方式去除雜質(zhì)，獲得高純度的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，設(shè)計特異性引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)蛋白基因。引物的設(shè)計至關(guān)重要，需根據(jù)目標(biāo)蛋白基因的序列信息，利用專業(yè)的引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5.0等進(jìn)行設(shè)計。引物應(yīng)具有良好的特異性，避免與其他基因序列發(fā)生非特異性結(jié)合，同時要保證引物的退火溫度適宜，以確保PCR反應(yīng)的高效進(jìn)行。在PCR反應(yīng)體系中，除了模板DNA、引物外，還需加入TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，如變性溫度、退火溫度、延伸時間等，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白基因的大量擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的目標(biāo)蛋白基因連接至合適的表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。常用的表達(dá)載體有pET系列、pGEX系列等，這些載體具有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢。以pET-28a載體為例，其含有T7啟動子，能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，且?guī)в蠬is標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。連接反應(yīng)通常采用T4DNA連接酶，將目標(biāo)蛋白基因與線性化的表達(dá)載體在合適的緩沖體系中進(jìn)行連接，通過轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，如BL21（DE3）等。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，只有成功導(dǎo)入重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長，從而篩選出陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保目標(biāo)蛋白基因序列的準(zhǔn)確性，避免在擴(kuò)增或連接過程中出現(xiàn)堿基突變等錯誤。將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加適量的抗生素，如卡那霉素（針對pET-28a載體），以維持重組表達(dá)質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以220rpm左右的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)大腸桿菌，使其進(jìn)入對數(shù)生長期。當(dāng)菌體密度達(dá)到一定程度，通常通過紫外分光光度計測定OD600值，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG的濃度一般在0.1-1mM之間，具體濃度需根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行優(yōu)化。誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和時間也需要進(jìn)行優(yōu)化，對于一些容易形成包涵體的蛋白，可降低誘導(dǎo)溫度至16-20℃，延長誘導(dǎo)時間至12-16h，以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體，通過離心的方法將菌體沉淀下來。采用合適的裂解方法破碎菌體，釋放出目標(biāo)蛋白。常用的裂解方法有超聲破碎法和化學(xué)裂解法。超聲破碎法利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)，使細(xì)胞破碎，在進(jìn)行超聲破碎時，需設(shè)置合適的超聲功率、超聲時間和間歇時間，避免因溫度過高導(dǎo)致蛋白變性?；瘜W(xué)裂解法通常使用含有去污劑（如TritonX-100）和蛋白酶抑制劑（如PMSF）的裂解緩沖液，裂解緩沖液能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，釋放出蛋白，同時蛋白酶抑制劑可防止蛋白在裂解過程中被降解。裂解后的樣品通過離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，上清液中即含有目標(biāo)蛋白。蛋白純化是獲得高純度目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常用的蛋白純化技術(shù)包括親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等，這些技術(shù)可以根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇和組合。親和層析利用目標(biāo)蛋白與配體之間的特異性相互作用進(jìn)行分離純化。若目標(biāo)蛋白基因連接了His標(biāo)簽，可采用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。將含有目標(biāo)蛋白的上清液通過鎳柱，His標(biāo)簽與鎳離子特異性結(jié)合，而其他雜質(zhì)蛋白則不與鎳柱結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)初步分離。用含有咪唑的洗脫緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，咪唑能夠競爭結(jié)合鎳離子，使目標(biāo)蛋白從鎳柱上洗脫下來。在洗脫過程中，可采用梯度洗脫的方式，逐漸增加咪唑的濃度，以提高洗脫效果，獲得高純度的目標(biāo)蛋白。離子交換層析基于蛋白表面的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離。根據(jù)目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)（pI）選擇合適的離子交換樹脂，若目標(biāo)蛋白的pI大于緩沖液的pH值，蛋白帶正電荷，可選用陽離子交換樹脂；反之，若pI小于緩沖液的pH值，蛋白帶負(fù)電荷，可選用陰離子交換樹脂。將經(jīng)過親和層析初步純化的蛋白樣品上樣到離子交換柱，目標(biāo)蛋白與離子交換樹脂結(jié)合，通過改變緩沖液的離子強(qiáng)度或pH值，使目標(biāo)蛋白與離子交換樹脂的結(jié)合力發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)洗脫和進(jìn)一步純化。凝膠過濾層析則依據(jù)蛋白分子大小進(jìn)行分離。將經(jīng)過離子交換層析進(jìn)一步純化的蛋白樣品上樣到凝膠過濾柱，凝膠過濾柱中的凝膠顆粒具有不同大小的孔徑，小分子蛋白能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在柱內(nèi)停留時間較長，而大分子蛋白則被排阻在凝膠顆粒外部，先流出柱子。通過這種方式，可將目標(biāo)蛋白與其他大小不同的雜質(zhì)蛋白分離，進(jìn)一步提高蛋白的純度。在整個蛋白純化過程中，需要對每一步純化后的蛋白進(jìn)行純度檢測，常用的檢測方法為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），通過觀察SDS-PAGE膠上蛋白條帶的數(shù)量和位置，判斷蛋白的純度和分子量大小，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整純化條件，直至獲得高純度的目標(biāo)蛋白，滿足后續(xù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的需求。3.2晶體生長與優(yōu)化在成功表達(dá)并純化出高質(zhì)量的目標(biāo)蛋白后，晶體生長成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的是獲得適合X射線衍射分析的高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。晶體生長的原理基于蛋白質(zhì)分子在溶液中的有序排列。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)時，蛋白質(zhì)分子會從無序的溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻木w結(jié)構(gòu)。在這個過程中，首先會形成晶核，晶核是晶體生長的起始點(diǎn)，隨后周圍的蛋白質(zhì)分子會不斷地聚集到晶核上，使晶體逐漸長大。常用的晶體生長方法包括懸滴法和坐滴法，這兩種方法都基于蒸氣擴(kuò)散原理。懸滴法的操作過程如下：在一個凹形的懸滴板中加入一定量的池液，池液中包含了各種結(jié)晶條件的成分，如鹽類、緩沖劑、沉淀劑等。在懸滴板的蓋板上，先點(diǎn)上適量的高濃度純化蛋白溶液，一般蛋白濃度在5-40mg/ml之間，然后再向蛋白溶液中加入等量的池液，輕輕混合均勻，形成懸滴。將蓋板翻轉(zhuǎn)，使懸滴懸掛在池液上方，用密封性良好的封口膜將懸滴板密封起來，以防止水分蒸發(fā)。由于懸滴中的水分會逐漸蒸發(fā)到池液中，導(dǎo)致懸滴中的蛋白質(zhì)溶液濃度逐漸升高，最終達(dá)到過飽和狀態(tài)，從而促使蛋白質(zhì)分子結(jié)晶。坐滴法與懸滴法類似，不同之處在于坐滴法是將蛋白溶液和池液的混合液直接滴在坐滴板的小孔中，而不是懸掛在蓋板上。在坐滴板的儲液槽中加入池液，然后在坐滴板的小孔中依次加入高濃度純化蛋白溶液和池液，混合均勻后，用透明度較高的封口膜將坐滴板封口，將其放置在培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，同樣要注意避免震動及溫度的劇烈變化，為晶體生長提供穩(wěn)定的環(huán)境。在進(jìn)行晶體生長實(shí)驗(yàn)之前，需要進(jìn)行充分的準(zhǔn)備工作。首先，要確保蛋白樣品的質(zhì)量，樣品純度需達(dá)到90%以上，這可以通過前面的蛋白純化步驟來保證。同時，需要確定合適的蛋白濃度，蛋白濃度直接影響著晶體篩選過程中晶體的生長，是一個關(guān)鍵條件。在進(jìn)行大量的條件篩選之前，建議先選擇一到兩種經(jīng)典的篩選試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，比如Crystalscreen、PEGRx等，選取2種以上的濃度進(jìn)行測試，通過觀察整板蛋白溶液和篩選液混合后的狀態(tài)來確認(rèn)最終合適的濃度。若整板超過80%以上都是蛋白沉淀狀態(tài)，說明蛋白濃度可能偏高，需要降低；反之，若蛋白溶液過于稀薄，可能難以形成晶體，需要適當(dāng)提高蛋白濃度。還需要測試蛋白溶液的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)在溶液中的聚合狀態(tài)和穩(wěn)定性會影響蛋白質(zhì)的結(jié)晶，如果某種蛋白在經(jīng)過大量條件篩選之后依然沒有篩選出結(jié)晶條件，那么可以嘗試通過多參數(shù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性檢測儀UNcle或者X射線小角散射儀來檢測蛋白質(zhì)在溶液中的狀態(tài)，篩選出合適的buffer、金屬離子添加劑或者抑制劑等，保證蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定性良好，然后再進(jìn)行結(jié)晶篩選。多參數(shù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性檢測儀UNcle主要通過獲得蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性參數(shù)Tm和蛋白溶液中膠體穩(wěn)定性參數(shù)Tagg來檢測升溫過程中蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性，還可以通過動態(tài)光散射DLS來進(jìn)行溶液中蛋白質(zhì)分子的粒徑分析，檢測蛋白質(zhì)在溶液中的聚合狀態(tài)；生物小角X射線散射儀主要通過收集溶液中蛋白的散射信號，分析數(shù)據(jù)解析出不同溶液中蛋白質(zhì)分子的Rg（分子旋轉(zhuǎn)半徑），來判斷蛋白質(zhì)在溶液中的聚合狀態(tài)。在晶體生長的初篩階段，會使用多種商業(yè)結(jié)晶試劑盒，如Indexl-96、Crystalscreen、CrystalscreenⅡ、SaltRx、WizardⅠ、WizardⅡ、WizardⅢ、PEGion、PEGRx-1、PEGRx-2和Natrix等，這些試劑盒中包含了約2000多個不同的結(jié)晶條件，涵蓋了不同的鹽類、緩沖劑、沉淀劑以及pH值等組合，為尋找合適的結(jié)晶條件提供了廣泛的選擇。將純化后的蛋白溶液與結(jié)晶試劑盒中的各種條件溶液按照一定比例混合，通過懸滴法或坐滴法進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，在不同的溫度條件下，如4℃、10℃、22℃等進(jìn)行培養(yǎng)，觀察晶體的生長情況。初篩得到的晶體往往質(zhì)量不高，無法滿足X射線衍射分析的要求，因此需要對晶體進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的方法主要是改變?nèi)芤簵l件，包括調(diào)整鹽類種類、濃度，改變沉淀劑的濃度，調(diào)整緩沖液的種類和pH值等。在初篩得到的最佳晶體條件附近，進(jìn)行pH和沉淀劑濃度的二維梯度實(shí)驗(yàn)，通過系統(tǒng)地改變這兩個參數(shù)，觀察晶體生長的變化，找到最適合晶體生長的條件組合。向蛋白懸滴液中加入各種添加劑，如小分子有機(jī)物、金屬離子等，這些添加劑可能會與蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用，影響蛋白質(zhì)分子的排列方式，從而促進(jìn)高質(zhì)量晶體的生長。在優(yōu)化過程中，需要密切觀察晶體的生長情況，包括晶體的大小、形狀、完整性等，根據(jù)觀察結(jié)果不斷調(diào)整優(yōu)化條件，直至獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體，為后續(xù)的X射線衍射數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)。3.3X射線晶體學(xué)技術(shù)X射線晶體學(xué)技術(shù)是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典且重要的方法，在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮著核心作用。其基本原理基于X射線與晶體中原子的相互作用。當(dāng)X射線照射到蛋白質(zhì)晶體時，晶體中的原子會對X射線產(chǎn)生散射作用。由于晶體中原子呈周期性規(guī)則排列，這些散射的X射線會發(fā)生相干疊加，形成特定的衍射圖案。具體而言，X射線與晶體中原子的電子云相互作用，原子的電子云密度越高，對X射線的散射能力越強(qiáng)。晶體中最小的重復(fù)單元——晶胞的大小和形狀決定了衍射線的方向，即衍射圖上斑點(diǎn)的位置；而晶胞內(nèi)所有原子的電子對衍射斑點(diǎn)的強(qiáng)度都有貢獻(xiàn)。衍射線與晶胞參數(shù)的對應(yīng)關(guān)系可以由Laue方程或Bragg方程給出。Bragg定律指出，晶體所產(chǎn)生的衍射可以看作是X射線束被晶體的一系列平行平面反射造成的，只有當(dāng)反射線光程差等于X射線束波長的整數(shù)倍時，才能產(chǎn)生衍射，其公式為nλ＝2dhklsinθ，其中n為整數(shù)，λ為X射線波長，dhkl為晶面間距，θ為反射角。通過測量衍射圖案中斑點(diǎn)的位置和強(qiáng)度，就可以獲得關(guān)于蛋白質(zhì)分子中原子的空間位置信息，進(jìn)而解析出蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)行X射線衍射數(shù)據(jù)收集時，首先需要將生長得到的高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行快速冷凍，以減少晶體中的熱運(yùn)動和輻射損傷，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在冷凍過程中，通常會使用含有防凍劑的溶液，如甘油等，防止晶體在冷凍過程中因水分結(jié)冰而破裂。然后，將冷凍后的晶體安裝在X射線衍射儀的樣品臺上，X射線源發(fā)出的X射線照射到晶體上，產(chǎn)生衍射圖案。目前常用的X射線源有旋轉(zhuǎn)陽極X射線發(fā)生器和同步輻射光源。旋轉(zhuǎn)陽極X射線發(fā)生器是實(shí)驗(yàn)室中較為常見的X射線源，它通過高速旋轉(zhuǎn)的陽極靶產(chǎn)生X射線，具有設(shè)備相對簡單、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，但X射線的強(qiáng)度和穩(wěn)定性相對較弱；同步輻射光源則是利用電子在同步加速器中高速運(yùn)動產(chǎn)生的同步輻射光作為X射線源，其具有高亮度、高準(zhǔn)直性、寬波段等優(yōu)點(diǎn)，能夠獲得高質(zhì)量的衍射數(shù)據(jù)，尤其適用于對微弱衍射信號的檢測和對晶體結(jié)構(gòu)高精度的解析，但同步輻射光源設(shè)備龐大、建設(shè)和運(yùn)行成本高昂，通常需要在專門的同步輻射實(shí)驗(yàn)室中使用。在數(shù)據(jù)收集過程中，需要圍繞不同的旋轉(zhuǎn)軸對晶體進(jìn)行多角度的旋轉(zhuǎn)，以獲取完整的三維衍射數(shù)據(jù)。一般來說，會在一定的角度范圍內(nèi)，如0-360°，以一定的步長，如0.1-1°，對晶體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，并在每個角度位置收集衍射圖像。通過對大量不同角度的衍射圖像進(jìn)行收集和分析，能夠獲得全面的衍射數(shù)據(jù)，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析提供充足的信息。探測器則用于記錄衍射圖案，常見的探測器有電荷耦合器件（CCD）探測器和互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）探測器。CCD探測器具有較高的靈敏度和分辨率，能夠準(zhǔn)確地記錄衍射斑點(diǎn)的位置和強(qiáng)度信息；CMOS探測器則具有更快的讀取速度和更低的噪聲，在數(shù)據(jù)收集效率上具有一定優(yōu)勢。收集到X射線衍射數(shù)據(jù)后，接下來就是利用相關(guān)軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和模型構(gòu)建。首先要解決的是相位問題，因?yàn)樵谘苌鋵?shí)驗(yàn)中，只能直接測量衍射點(diǎn)的強(qiáng)度信息，而衍射數(shù)據(jù)的相位無法從實(shí)驗(yàn)收集的數(shù)據(jù)中直接得到，但相位信息對于計算電子密度分布至關(guān)重要，是晶體結(jié)構(gòu)解析的核心問題之一。目前常用的解決相位問題的方法有同晶置換法、分子置換法和多波長反常散射法等。同晶置換法是利用兩個晶體具有相同的空間對稱性和相同的晶胞參數(shù)（即同晶型）的特點(diǎn)。在不改變分子和晶體結(jié)構(gòu)的情況下，對蛋白質(zhì)晶體（母體）進(jìn)行化學(xué)修飾，使其局部被重原子置換，得到衍生物晶體。由于引入的重原子僅影響晶體的衍射強(qiáng)度，而不改變衍射方向，通過比較母體晶體和衍生物晶體的衍射圖像，如利用帕特森函數(shù)法，可以得到衍生物晶體中重原子的位置信息及蛋白質(zhì)母體的相位信息。分子置換法適用于結(jié)構(gòu)同源性較高的蛋白質(zhì)或突變體蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾物。當(dāng)待測蛋白質(zhì)與已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)具有較高的結(jié)構(gòu)相似度時，可以利用已知的同源結(jié)構(gòu)作為模型，計算其結(jié)構(gòu)因子，并與實(shí)驗(yàn)測定的衍射數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比較，從而確定相位。在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)解析中，如果存在與目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)相似的已知蛋白結(jié)構(gòu)，就可以采用分子置換法來解決相位問題。多波長反常散射法是基于當(dāng)X射線的頻率接近原子光譜吸收帶時，X射線不僅被散射，還會被共振吸收，從而擾亂正常散射，產(chǎn)生反常散射的原理。對于含有重原子的衍生物晶體，通過在至少兩個不同波長下收集反常散射數(shù)據(jù)，就可以利用這些數(shù)據(jù)獲取相位信息。在獲得相位信息后，就可以根據(jù)衍射數(shù)據(jù)和相位信息計算電子密度。通過傅立葉變換，將衍射數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為電子密度函數(shù)，從而得到晶胞內(nèi)的電子密度分布。電子密度在空間坐標(biāo)（x,y,z）處的值可以由相關(guān)函數(shù)計算得出，其中涉及到結(jié)構(gòu)振幅、相位和密勒指數(shù)等參數(shù)。根據(jù)計算得到的電子密度圖，就可以開始構(gòu)建蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。利用專業(yè)的分子建模軟件，如Coot、Phenix等，根據(jù)電子密度圖中的信息，逐步構(gòu)建出蛋白質(zhì)分子中各個原子的位置和連接方式，形成初步的結(jié)構(gòu)模型。在構(gòu)建模型的過程中，需要不斷地對模型進(jìn)行優(yōu)化和修正，使其與衍射數(shù)據(jù)更好地吻合。通過比較模型計算得到的衍射數(shù)據(jù)與實(shí)際收集到的衍射數(shù)據(jù)，對模型中的原子坐標(biāo)、鍵長、鍵角等參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，反復(fù)迭代，直到模型的各項(xiàng)參數(shù)符合晶體學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，如R因子（R-factor）和自由R因子（FreeR-factor）達(dá)到合理范圍，從而得到準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，為深入研究嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的分子機(jī)制提供堅實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。3.4其他結(jié)構(gòu)分析技術(shù)除了X射線晶體學(xué)技術(shù)外，冷凍電鏡技術(shù)和核磁共振技術(shù)在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中也發(fā)揮著重要作用。冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-electronmicroscopy，Cryo-EM）是近年來發(fā)展迅速的一種結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究技術(shù)，尤其在解析難以結(jié)晶蛋白的結(jié)構(gòu)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。其原理是將樣品快速冷凍在液氮溫度下，使樣品中的水分子迅速形成非晶態(tài)冰，從而固定樣品的結(jié)構(gòu)，減少樣品在電子束照射下的損傷。在冷凍狀態(tài)下，用電子束照射樣品，電子與樣品中的原子相互作用產(chǎn)生散射，通過探測器記錄散射電子的信號，獲得一系列不同角度的二維投影圖像。這些二維投影圖像包含了樣品的結(jié)構(gòu)信息，利用計算機(jī)圖像處理技術(shù)，對大量的二維投影圖像進(jìn)行分析和處理，通過三維重構(gòu)算法，最終重建出樣品的三維結(jié)構(gòu)。在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)研究中，冷凍電鏡技術(shù)可用于解析那些難以通過X射線晶體學(xué)獲得晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白或蛋白復(fù)合物。例如，對于一些較大的蛋白復(fù)合物，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以形成高質(zhì)量的晶體，而冷凍電鏡技術(shù)可以直接對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。通過冷凍電鏡技術(shù)，研究人員可以觀察到新型泛素化反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白之間的相互作用方式和復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)，為深入理解反應(yīng)機(jī)制提供重要的結(jié)構(gòu)信息。與X射線晶體學(xué)相比，冷凍電鏡技術(shù)不需要蛋白質(zhì)結(jié)晶，避免了晶體生長過程中可能出現(xiàn)的問題，如晶體質(zhì)量不佳、難以獲得晶體等，能夠研究更多種類的蛋白質(zhì)和生物大分子復(fù)合物。而且，冷凍電鏡技術(shù)可以在接近生理?xiàng)l件下對樣品進(jìn)行分析，能夠更好地反映蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和動態(tài)變化，對于研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)功能和相互作用具有重要意義。核磁共振技術(shù)（NuclearMagneticResonance，NMR）則是基于原子核在磁場中的共振行為來研究分子結(jié)構(gòu)和相互作用的一種技術(shù)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，NMR技術(shù)利用蛋白質(zhì)分子中氫、碳、氮等原子核的核磁共振信號來獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子處于強(qiáng)磁場中時，原子核的磁矩會與磁場相互作用，產(chǎn)生能級分裂。通過施加射頻脈沖，使原子核發(fā)生共振躍遷，檢測共振信號的頻率、強(qiáng)度和耦合常數(shù)等參數(shù)，這些參數(shù)包含了蛋白質(zhì)分子中原子之間的距離、化學(xué)鍵的長度和角度等信息。利用這些信息，通過一系列的計算和分析方法，可以構(gòu)建出蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。NMR技術(shù)在研究蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)和相互作用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。它可以在溶液中對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，能夠?qū)崟r監(jiān)測蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化和動態(tài)過程，這對于理解新型泛素化反應(yīng)中蛋白質(zhì)的活性調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。在新型泛素化反應(yīng)中，關(guān)鍵蛋白在催化反應(yīng)過程中可能會發(fā)生構(gòu)象變化，NMR技術(shù)可以捕捉到這些動態(tài)變化信息，為揭示反應(yīng)的動態(tài)過程提供依據(jù)。而且，NMR技術(shù)還可以用于研究蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用，如新型泛素化反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白與泛素、底物蛋白之間的相互作用，通過分析NMR信號的變化，可以確定相互作用的位點(diǎn)和親和力，深入了解蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制。但NMR技術(shù)也存在一定的局限性，它通常適用于分子量較小的蛋白質(zhì)或蛋白結(jié)構(gòu)域的研究，對于分子量較大的蛋白質(zhì)，由于信號復(fù)雜，解析難度較大。而且，NMR實(shí)驗(yàn)的樣品需求量相對較大，實(shí)驗(yàn)周期較長，這也在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。四、新型泛素化反應(yīng)關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)解析4.1SidE家族蛋白結(jié)構(gòu)4.1.1mART結(jié)構(gòu)域SidE家族蛋白中的mART結(jié)構(gòu)域在新型泛素化反應(yīng)的起始階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)催化泛素的ADP-核糖基化修飾。從三維結(jié)構(gòu)特征來看，mART結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式，由多個α螺旋和β折疊組成，形成了一個相對緊湊的球狀結(jié)構(gòu)。以SdeA蛋白的mART結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，其核心區(qū)域由一個中央β折疊片層和環(huán)繞在周圍的α螺旋構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)排列賦予了mART結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定的空間構(gòu)象。在催化泛素ADP-核糖基化修飾的過程中，mART結(jié)構(gòu)域的活性中心起著至關(guān)重要的作用?；钚灾行耐ǔＳ梢唤M特定的氨基酸殘基組成，這些殘基在空間上相互靠近，形成了一個能夠特異性結(jié)合泛素和NAD+的口袋。在這個口袋中，一些氨基酸殘基通過與泛素和NAD+的相互作用，實(shí)現(xiàn)對底物的精準(zhǔn)識別和定位。研究表明，mART結(jié)構(gòu)域中的某些保守氨基酸殘基，如天冬氨酸、谷氨酸等，參與了催化反應(yīng)的酸堿催化過程，它們能夠調(diào)節(jié)底物的電子云分布，促進(jìn)煙酰胺從NAD+上的脫離，使NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚灾虚g體（oxocarbeniumcationintermediate），進(jìn)而將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到泛素的特定氨基酸殘基上。mART結(jié)構(gòu)域與底物泛素之間存在著高度特異性的結(jié)合模式。通過X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)mART結(jié)構(gòu)域與泛素的結(jié)合主要依賴于多種相互作用。在二者結(jié)合的過程中，mART結(jié)構(gòu)域的ARTT和PNloop，以及α-helicallobe均發(fā)揮了重要作用。泛素分子中參與結(jié)合的則主要是其C端區(qū)域，尤其是泛素的R72和R74兩個氨基酸分別結(jié)合到mART結(jié)構(gòu)域表面的兩個帶負(fù)電的凹槽中，起到最關(guān)鍵的錨定作用。這兩個氨基酸的單突變均可使得泛素失去被SdeA的mART結(jié)構(gòu)域修飾的能力。除了這些關(guān)鍵氨基酸之間的相互作用外，mART結(jié)構(gòu)域與泛素之間還存在著氫鍵、范德華力等弱相互作用，這些弱相互作用進(jìn)一步穩(wěn)定了二者的結(jié)合，確保了催化反應(yīng)的高效進(jìn)行。而且，mART結(jié)構(gòu)域與泛素的結(jié)合模式還具有一定的動態(tài)變化特性，在催化反應(yīng)過程中，mART結(jié)構(gòu)域和泛素的構(gòu)象可能會發(fā)生微調(diào)，以適應(yīng)催化反應(yīng)的需求，這種動態(tài)變化對于理解mART結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制具有重要意義。4.1.2PDE結(jié)構(gòu)域PDE結(jié)構(gòu)域在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，負(fù)責(zé)催化磷酸核糖化泛素轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上，是實(shí)現(xiàn)底物泛素化修飾的重要步驟。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，PDE結(jié)構(gòu)域具有典型的磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)特征，通常由多個結(jié)構(gòu)模塊組成，形成了一個具有特定空間構(gòu)象的催化結(jié)構(gòu)域。PDE結(jié)構(gòu)域包含一個保守的活性中心，活性中心由一系列保守的氨基酸殘基組成，這些殘基在空間上形成了一個能夠特異性結(jié)合磷酸核糖化泛素（PR-Ub）和底物絲氨酸的催化口袋。在催化口袋中，一些氨基酸殘基通過與底物的相互作用，實(shí)現(xiàn)對底物的識別和定位。研究發(fā)現(xiàn)，PDE結(jié)構(gòu)域中的某些保守氨基酸殘基，如組氨酸、天冬氨酸等，參與了催化反應(yīng)的親核攻擊過程，它們能夠激活底物絲氨酸的羥基，使其作為親核試劑進(jìn)攻PR-Ub的磷酸基團(tuán)，從而形成磷酸酯鍵，將PR-Ub轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上。PDE結(jié)構(gòu)域催化磷酸核糖化泛素轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上的分子機(jī)制是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程。當(dāng)PDE結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合PR-Ub后，催化口袋中的氨基酸殘基會對PR-Ub的磷酸基團(tuán)進(jìn)行活化，使其處于一種易于發(fā)生反應(yīng)的狀態(tài)。與此同時，底物絲氨酸被定位到催化口袋中合適的位置，其羥基與PR-Ub的磷酸基團(tuán)接近。在催化殘基的作用下，底物絲氨酸的羥基對PR-Ub的磷酸基團(tuán)發(fā)起親核攻擊，斷裂磷酸二酯鍵，形成磷酸酯鍵，從而將PR-Ub轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上，完成對底物的泛素化修飾。PDE結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝z氨酸具有一定的選擇性，這種選擇性可能與底物絲氨酸周圍的氨基酸序列、電荷分布以及空間構(gòu)象等因素有關(guān)。通過對不同底物的研究發(fā)現(xiàn)，底物絲氨酸周圍的某些氨基酸殘基能夠與PDE結(jié)構(gòu)域形成特異性的相互作用，從而促進(jìn)底物的識別和修飾，進(jìn)一步體現(xiàn)了PDE結(jié)構(gòu)域催化機(jī)制的特異性和精細(xì)性。4.1.3結(jié)構(gòu)域間相互作用mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域作為SidE家族蛋白中參與新型泛素化反應(yīng)的兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，它們之間存在著緊密而復(fù)雜的相互作用，這種相互作用對新型泛素化反應(yīng)的順利進(jìn)行起著至關(guān)重要的影響。從相互作用方式來看，mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域在空間上緊密相鄰，通過一系列的氨基酸殘基之間的相互作用實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域間的穩(wěn)定結(jié)合。研究表明，mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域之間存在著多種相互作用形式。在一些SidE家族蛋白中，mART結(jié)構(gòu)域的一段loop區(qū)域會延伸到PDE結(jié)構(gòu)域中，與PDE結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸殘基形成氫鍵、鹽橋等相互作用，從而增強(qiáng)兩個結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合穩(wěn)定性。在SdeA蛋白中，mART結(jié)構(gòu)域的789-797段氨基酸形成的“Plug”loop伸到PDE結(jié)構(gòu)域中，與PDE結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基相互作用，對維持mART結(jié)構(gòu)域的活性和兩個結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用具有重要意義。除了loop區(qū)域的相互作用外，mART結(jié)構(gòu)域和PDE結(jié)構(gòu)域的表面還存在著一些互補(bǔ)的電荷分布和疏水區(qū)域，這些區(qū)域之間的靜電相互作用和疏水相互作用也有助于兩個結(jié)構(gòu)域的緊密結(jié)合。這種結(jié)構(gòu)域間的相互作用對新型泛素化反應(yīng)具有多方面的影響。從催化活性角度來看，PDE結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持mART結(jié)構(gòu)域的正常活性至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域分離或二者之間的相互作用被破壞時，mART結(jié)構(gòu)域的催化活性會顯著降低，甚至喪失。這是因?yàn)镻DE結(jié)構(gòu)域可以通過與mART結(jié)構(gòu)域的相互作用，穩(wěn)定mART結(jié)構(gòu)域的活性中心構(gòu)象，促進(jìn)底物的結(jié)合和催化反應(yīng)的進(jìn)行。在泛素修飾過程中，mART結(jié)構(gòu)域催化生成的ADP-核糖基化泛素（ADPR-Ub）需要及時傳遞給PDE結(jié)構(gòu)域，以便進(jìn)行后續(xù)的磷酸核糖化泛素轉(zhuǎn)移連接反應(yīng)。mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域之間的緊密相互作用，使得ADPR-Ub能夠高效地從mART結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到PDE結(jié)構(gòu)域，保證了新型泛素化反應(yīng)的連續(xù)性和高效性。這種結(jié)構(gòu)域間的相互作用還可能影響SidE家族蛋白對底物的特異性識別和結(jié)合。兩個結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用可以形成一個更大的底物結(jié)合表面，增加對底物的親和力和特異性，使得SidE家族蛋白能夠更精準(zhǔn)地識別和修飾目標(biāo)底物，從而實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞生理過程的精確調(diào)控。4.2其他相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)除了SidE家族蛋白外，在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)中，還存在其他一些相關(guān)蛋白，它們在反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其結(jié)構(gòu)解析成果也為深入理解新型泛素化反應(yīng)提供了關(guān)鍵信息。以效應(yīng)蛋白DupA/B為例，它們能夠?qū)α姿岷颂欠核鼗孜镞M(jìn)行去泛素化，在調(diào)節(jié)新型泛素化反應(yīng)的動態(tài)平衡中扮演著重要角色。雖然目前關(guān)于DupA/B的結(jié)構(gòu)解析研究相對較少，但已有的研究表明，DupA/B具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。從氨基酸序列分析來看，DupA/B含有一些保守的基序，這些基序可能參與了其與磷酸核糖泛素化底物的識別和結(jié)合過程。通過生物信息學(xué)預(yù)測和初步的結(jié)構(gòu)建模分析，發(fā)現(xiàn)DupA/B可能形成一種獨(dú)特的空間構(gòu)象，其中包含多個α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)元件相互作用，形成了一個能夠特異性結(jié)合底物的活性中心。研究還推測，DupA/B的活性中心可能含有一些能夠催化磷酸酯鍵水解的關(guān)鍵氨基酸殘基，如天冬氨酸、谷氨酸等，這些殘基通過與底物的磷酸基團(tuán)相互作用，促進(jìn)去泛素化反應(yīng)的進(jìn)行。盡管目前還缺乏高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)或冷凍電鏡結(jié)構(gòu)來詳細(xì)闡明DupA/B的三維結(jié)構(gòu)，但已有的研究為進(jìn)一步深入研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。再如效應(yīng)蛋白LnaB，浙江大學(xué)朱永群、周艷實(shí)驗(yàn)室與北京大學(xué)劉小云實(shí)驗(yàn)室合作研究發(fā)現(xiàn)，LnaB以ATP為配體，并以宿主肌動蛋白（actin）為激活劑，在新型泛素化反應(yīng)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。從結(jié)構(gòu)上看，LnaB具有特定的結(jié)構(gòu)域，其中包含一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個催化結(jié)構(gòu)域。ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合ATP分子，為催化反應(yīng)提供能量；催化結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)催化底物的修飾反應(yīng)。通過X射線晶體學(xué)技術(shù)，研究人員解析了LnaB與ATP、底物等復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，詳細(xì)揭示了LnaB與底物的結(jié)合模式以及催化反應(yīng)的分子機(jī)制。在與底物結(jié)合時，LnaB的催化結(jié)構(gòu)域通過一系列的氨基酸殘基與底物相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，LnaB能夠催化磷酸核糖化泛素（PR-Ub）發(fā)生單磷酸腺苷酸化（AMPylation）修飾，反應(yīng)生成的ADPR-Ub可進(jìn)一步由效應(yīng)蛋白MavL水解成為Ub，從而實(shí)現(xiàn)對非經(jīng)典泛素化過程的逆轉(zhuǎn)。這一過程不僅揭示了新型泛素化反應(yīng)中存在的一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制，也為深入理解嗜肺軍團(tuán)菌如何調(diào)控宿主細(xì)胞的泛素化系統(tǒng)提供了重要線索。LnaB的結(jié)構(gòu)研究還發(fā)現(xiàn)，其與宿主肌動蛋白的相互作用位點(diǎn)位于蛋白表面的一個特定區(qū)域，通過與肌動蛋白的結(jié)合，LnaB能夠被激活，從而促進(jìn)其對底物的催化修飾反應(yīng)。這種宿主蛋白與病原菌效應(yīng)蛋白之間的相互作用，進(jìn)一步體現(xiàn)了嗜肺軍團(tuán)菌在感染宿主細(xì)胞過程中，通過巧妙地利用宿主細(xì)胞內(nèi)的分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)自身的生存和繁殖。五、新型泛素化反應(yīng)的機(jī)制探討5.1基于結(jié)構(gòu)的反應(yīng)催化機(jī)制從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度深入剖析嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)的催化機(jī)制，能夠?yàn)槲覀兝斫膺@一獨(dú)特的生物學(xué)過程提供關(guān)鍵線索。以SidE家族蛋白為例，其mART結(jié)構(gòu)域在催化泛素ADP-核糖基化修飾的過程中，展現(xiàn)出高度特異性的底物識別和催化活性。在底物識別方面，mART結(jié)構(gòu)域與泛素的結(jié)合具有獨(dú)特的模式。通過對mART結(jié)構(gòu)域與泛素復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，泛素分子的C端區(qū)域在結(jié)合過程中起著關(guān)鍵作用，尤其是R72和R74兩個氨基酸，它們分別結(jié)合到mART結(jié)構(gòu)域表面的兩個帶負(fù)電的凹槽中，這種精確的結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)了對泛素的特異性識別，確保了修飾反應(yīng)的準(zhǔn)確性。mART結(jié)構(gòu)域的ARTT和PNloop以及α-helicallobe等結(jié)構(gòu)元件也參與了與泛素的相互作用，它們通過氫鍵、范德華力等弱相互作用進(jìn)一步穩(wěn)定了二者的結(jié)合，為后續(xù)的催化反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。mART結(jié)構(gòu)域的催化活性中心由一組保守的氨基酸殘基組成，這些殘基在空間上相互靠近，形成了一個能夠特異性結(jié)合NAD+并催化ADP-核糖基化反應(yīng)的活性口袋。在催化反應(yīng)中，部分mART蛋白的催化機(jī)制被認(rèn)為是SN1反應(yīng)，即煙酰胺基團(tuán)會先從NAD+中脫離，使得NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚灾虚g體（oxocarbeniumcationintermediate）。在這個過程中，活性中心的一些氨基酸殘基，如天冬氨酸、谷氨酸等，通過酸堿催化作用，促進(jìn)煙酰胺從NAD+上的脫離，使NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚灾虚g體，為后續(xù)的親核攻擊反應(yīng)創(chuàng)造條件。隨后，R42作為親核基團(tuán)，其ε氨基N原子對活性中間體中與煙酰胺基團(tuán)相連的核糖C1原子發(fā)起親核攻擊，實(shí)現(xiàn)了ADP-核糖基團(tuán)向泛素R42位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，完成了泛素的ADP-核糖基化修飾。在SdeAmART和泛素-NADH復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，起初R72比被修飾的R42更靠近活性中心，這看似與R42被mART修飾相矛盾。但通過將復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的NADH替換成活性中間體，并進(jìn)行分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，在模擬過程中R72遠(yuǎn)離了活性中心，而R42進(jìn)入活性中心并占據(jù)了之前R72所在的位置，最終使得R42的親核基團(tuán)和NAD+的親電基團(tuán)之間的平均距離縮短至4.46?，從而使得R42能夠被修飾。PDE結(jié)構(gòu)域在催化磷酸核糖化泛素轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上的過程中，同樣依賴于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和催化活性中心。PDE結(jié)構(gòu)域的活性中心由一系列保守的氨基酸殘基組成，形成了一個能夠特異性結(jié)合磷酸核糖化泛素（PR-Ub）和底物絲氨酸的催化口袋。在底物識別階段，PDE結(jié)構(gòu)域通過與PR-Ub和底物絲氨酸之間的相互作用實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)識別。PDE結(jié)構(gòu)域中的一些氨基酸殘基與PR-Ub的磷酸基團(tuán)、核糖部分以及底物絲氨酸周圍的氨基酸殘基形成氫鍵、靜電相互作用等，確保了底物能夠準(zhǔn)確地定位到活性中心。在催化反應(yīng)中，PDE結(jié)構(gòu)域的活性中心通過一系列的化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)磷酸核糖化泛素的轉(zhuǎn)移連接。催化口袋中的某些氨基酸殘基，如組氨酸、天冬氨酸等，參與了親核攻擊過程，它們能夠激活底物絲氨酸的羥基，使其作為親核試劑進(jìn)攻PR-Ub的磷酸基團(tuán)。在這個過程中，底物絲氨酸的羥基對PR-Ub的磷酸基團(tuán)發(fā)起親核攻擊，斷裂磷酸二酯鍵，形成磷酸酯鍵，從而將PR-Ub轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上，完成對底物的泛素化修飾。PDE結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝z氨酸具有一定的選擇性，這種選擇性可能與底物絲氨酸周圍的氨基酸序列、電荷分布以及空間構(gòu)象等因素有關(guān)。通過對不同底物的研究發(fā)現(xiàn)，底物絲氨酸周圍的某些氨基酸殘基能夠與PDE結(jié)構(gòu)域形成特異性的相互作用，從而促進(jìn)底物的識別和修飾，進(jìn)一步體現(xiàn)了PDE結(jié)構(gòu)域催化機(jī)制的特異性和精細(xì)性。5.2與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制嗜肺軍團(tuán)菌的新型泛素化反應(yīng)對宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，成為其逃避宿主免疫防御的關(guān)鍵策略。在宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答信號通路中，核因子κB（NF-κB）信號通路是重要的防御機(jī)制之一。正常情況下，當(dāng)宿主細(xì)胞受到病原體入侵時，細(xì)胞表面的模式識別受體（PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使IκB激酶（IKK）復(fù)合物磷酸化抑制蛋白IκB，使其降解，從而釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，啟動一系列免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞因子、趨化因子等，以抵御病原體的入侵。嗜肺軍團(tuán)菌的新型泛素化反應(yīng)通過修飾關(guān)鍵信號分子，干擾NF-κB信號通路的激活。研究發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌分泌的效應(yīng)蛋白能夠利用新型泛素化反應(yīng)，對NF-κB信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白NEMO進(jìn)行修飾。NEMO是IKK復(fù)合物的重要組成部分，在NF-κB信號通路的激活中起著關(guān)鍵作用。嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白通過新型泛素化反應(yīng)，將磷酸核糖化泛素連接到NEMO的特定絲氨酸殘基上，這種修飾會干擾NEMO與IKK復(fù)合物其他成員的相互作用，阻礙IKK復(fù)合物的正常組裝和激活。研究表明，被新型泛素化修飾后的NEMO無法有效地招募和激活I(lǐng)KKα和IKKβ，使得IκB不能被正常磷酸化和降解，NF-κB被持續(xù)抑制在細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核啟動免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答受到抑制，嗜肺軍團(tuán)菌得以逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。在細(xì)胞凋亡信號通路方面，細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞抵御病原體感染的一種重要防御機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到病原體感染時，會啟動細(xì)胞凋亡程序，通過程序性死亡來限制病原體的復(fù)制和傳播。嗜肺軍團(tuán)菌的新型泛素化反應(yīng)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號通路，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，RIP1是一種典型的介導(dǎo)細(xì)胞存活與凋亡的分子，在細(xì)胞凋亡信號通路中發(fā)揮著重要作用。嗜肺軍團(tuán)菌通過新型泛素化反應(yīng)，抑制RIP1的泛素化修飾，使其參與細(xì)胞凋亡信號通路的能力受到抑制。正常情況下，RIP1會在特定的泛素化修飾后，招募下游的凋亡相關(guān)蛋白，激活細(xì)胞凋亡信號通路。而嗜肺軍團(tuán)菌利用新型泛素化反應(yīng)，干擾了RIP1的正常泛素化修飾過程，使得RIP1無法有效地招募凋亡相關(guān)蛋白，阻斷了細(xì)胞凋亡信號通路的激活，從而使宿主細(xì)胞無法通過凋亡來清除感染的嗜肺軍團(tuán)菌，為嗜肺軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖創(chuàng)造了有利條件。嗜肺軍團(tuán)菌通過新型泛素化反應(yīng)逃避宿主免疫防御的分子機(jī)制是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程。除了上述對免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡信號通路的干擾外，新型泛素化反應(yīng)還可能通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的其他信號通路和生理過程來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白可能利用新型泛素化反應(yīng)，修飾宿主細(xì)胞內(nèi)的一些免疫相關(guān)受體，改變其功能和定位，使其無法正常識別病原體或傳遞免疫信號。嗜肺軍團(tuán)菌還可能通過新型泛素化反應(yīng)，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的自噬過程。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我降解機(jī)制，能夠清除病原體和受損的細(xì)胞器等。嗜肺軍團(tuán)菌通過新型泛素化反應(yīng)，干擾自噬相關(guān)蛋白的功能，抑制自噬體的形成或自噬溶酶體的融合，從而逃避自噬的清除作用。這些分子機(jī)制的協(xié)同作用，使得嗜肺軍團(tuán)菌能夠成功地逃避宿主免疫防御，在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖，導(dǎo)致感染的發(fā)生和疾病的發(fā)展。5.3調(diào)控機(jī)制研究在嗜肺軍團(tuán)菌新型泛素化反應(yīng)中，細(xì)胞內(nèi)存在著復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，這些調(diào)控機(jī)制對維持新型泛素化反應(yīng)的動態(tài)平衡以及嗜肺軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖起著至關(guān)重要的作用。在正調(diào)控方面，鈣離子-鈣調(diào)蛋白（Ca2+-CaM）信號通路對新型泛素化反應(yīng)具有重要的激活作用。當(dāng)嗜肺軍團(tuán)菌感染宿主細(xì)胞后，會引起宿主細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，進(jìn)而激活Ca2+-CaM信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，CaM可以與嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白SidJ相互作用，激活SidJ的谷氨酸修飾酶活性。激活后的SidJ能夠?qū)deA等SidE家族蛋白進(jìn)行修飾，從而增強(qiáng)它們的新型泛素化活性，促進(jìn)泛素化反應(yīng)的進(jìn)行。具體來說，SidJ利用宿主蛋白CaM執(zhí)行一種谷氨酸化修飾，這種修飾可能改變了SdeA的構(gòu)象，使其活性中心更易于與底物結(jié)合，從而提高了新型泛素化反應(yīng)的效率。在某些實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)人為增加宿主細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活Ca2+-CaM信號通路時，新型泛素化反應(yīng)的活性顯著增強(qiáng)，底物的泛素化修飾水平明顯提高；而當(dāng)使用鈣離子螯合劑降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制Ca2+-CaM信號通路時，新型泛素化反應(yīng)的活性則受到明顯抑制，底物的泛素化修飾水平降低。宿主細(xì)胞內(nèi)的一些代謝產(chǎn)物也可能對新型泛素化反應(yīng)起到正調(diào)控作用。例如，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作為新型泛素化反應(yīng)中關(guān)鍵的底物，其濃度的變化會直接影響反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NAD+濃度較高時，能夠?yàn)閙ART結(jié)構(gòu)域催化泛素的ADP-核糖基化修飾提供充足的底物，從而促進(jìn)新型泛素化反應(yīng)的進(jìn)行。研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)基中添加適量的NAD+，可以顯著提高新型泛素化反應(yīng)的效率，增加底物的泛素化修飾程度；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NAD+被消耗或其合成受到抑制，導(dǎo)致NAD+濃度降低時，新型泛素化反應(yīng)的活性會受到明顯抑制。在負(fù)調(diào)控方面，效應(yīng)蛋白DupA/B能夠?qū)α姿岷颂欠核鼗孜镞M(jìn)行去泛素化，從而抑制新型泛素化反應(yīng)。DupA/B具有特定的結(jié)構(gòu)特征，雖然目前其高分辨率結(jié)構(gòu)尚未完全解析，但從已有的研究推測，它可能通過與磷酸核糖泛素化底物特異性結(jié)合，利用其自身的酶活性催化磷酸酯鍵的水解，將磷酸核糖化泛素從底物上移除，從而實(shí)現(xiàn)去泛素化過程。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)DupA/B時，磷酸核糖泛素化底物的水平顯著降低，新型泛素化反應(yīng)受到明顯抑制；而當(dāng)敲低DupA/B的表達(dá)時，底物的磷酸核糖泛素化水平升高，新型泛素化反應(yīng)增強(qiáng)。效應(yīng)蛋白LnaB以ATP為配體，并以宿主肌動蛋白（actin）為激活劑，在新型泛素化反應(yīng)中發(fā)揮著獨(dú)特的負(fù)調(diào)控作用。LnaB能夠催化磷酸核糖化泛素（PR-Ub）發(fā)生單磷酸腺苷酸化（AMPylation）修飾，反應(yīng)生成的ADPR-Ub可進(jìn)一步由效應(yīng)蛋白MavL水解成為Ub，從而實(shí)現(xiàn)對非經(jīng)典泛素化過程的逆轉(zhuǎn)。具體而言，LnaB在與ATP結(jié)合并被宿主肌動蛋白激活后，其催化結(jié)構(gòu)域與PR-Ub相互作用，將AMP基團(tuán)轉(zhuǎn)移到PR-Ub上，改變了其結(jié)構(gòu)和活性。隨后，MavL識別并結(jié)合ADPR-Ub，利用其水解酶活性將ADPR-Ub水解為Ub，從而降低了磷酸核糖泛素化底物的水平，抑制了新型泛素化反應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)干擾LnaB的功能或降低其表達(dá)水平時，新型泛素化反應(yīng)增強(qiáng)，底物的磷酸核糖泛素化修飾增加；而當(dāng)增強(qiáng)LnaB的活性時，新型泛素化反應(yīng)受到抑制，底物的修飾水平降低。這些調(diào)控機(jī)制在嗜肺軍團(tuán)菌感染過程中發(fā)揮著重要作用。在感染初期，正調(diào)控機(jī)制可能被激活，促進(jìn)新型泛素化反應(yīng)的進(jìn)行，幫助嗜肺軍團(tuán)菌迅速干擾宿主細(xì)胞的正常生理過程，抑制宿主免疫應(yīng)答，為自身的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。隨著感染的發(fā)展，負(fù)調(diào)控機(jī)制可能發(fā)揮作用，對新型泛素化反應(yīng)進(jìn)行適度抑制，以維持宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，避免因過度的泛素化修飾導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，從而確保嗜肺軍團(tuán)菌能夠持續(xù)在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。正調(diào)控和負(fù)調(diào)控機(jī)制之間的動態(tài)平衡對于嗜肺軍團(tuán)菌感染的進(jìn)程和結(jié)局具有重要影響，深入研究這些調(diào)控機(jī)制，有助于我們?nèi)胬斫馐确诬妶F(tuán)菌的致病機(jī)制，為開發(fā)新型的抗菌治療策略提供理論依據(jù)。六、研究成果與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞嗜肺軍團(tuán)菌不依賴于E1和E2的新型泛素化反應(yīng)，綜合運(yùn)用多種結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，從關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)解析、反應(yīng)機(jī)制探討以及與宿主細(xì)胞的相互作用等多個層面展開深入研究，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的成果。在關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)解析方面，成功解析了SidE家族蛋白中mART結(jié)構(gòu)域和PDE結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，揭示了它們獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。mART結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出由多個α螺旋和β折疊組成的球狀結(jié)構(gòu)，其活性中心由特定氨基酸殘基構(gòu)成，能夠特異性結(jié)合泛素和NAD+，并催化泛素的ADP-核糖基化修飾；PDE結(jié)構(gòu)域具有典型的磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)特征，其活性中心可特異性結(jié)合磷酸核糖化泛素和底物絲氨酸，催化磷酸核糖化泛素轉(zhuǎn)移連接到底物絲氨酸殘基上。明確了mART結(jié)構(gòu)域與PDE結(jié)構(gòu)域之間緊密的相互作用方式，二者通過氨基酸殘基間的氫鍵、鹽橋以及靜電和疏水相互作用等實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定結(jié)合，這種相互作用對維持mART結(jié)構(gòu)域的活性、促進(jìn)泛素修飾過程以及增強(qiáng)對底物的特異性識別具有關(guān)鍵作用。在新型泛素化反應(yīng)機(jī)制研究方面，基于關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)信息，深入闡釋了新型泛素化反應(yīng)的催化機(jī)制。mART結(jié)構(gòu)域通過獨(dú)特的底物識別模式，利用保守氨基酸殘基的酸堿催化作用，實(shí)現(xiàn)對泛素的ADP-核糖基化修飾；PDE結(jié)構(gòu)域則通過對底物的精準(zhǔn)識別和活性中心氨基酸殘基的親核攻擊作用，完成磷酸核糖化泛素向底物絲氨酸殘基的轉(zhuǎn)移連接，從而實(shí)現(xiàn)對底物的泛素化修飾。研究還揭示了新型泛素化反應(yīng)對宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響機(jī)制，嗜肺軍團(tuán)菌通過新型泛素化反應(yīng)修飾宿主細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵蛋白，如NEMO、RIP1等，干擾這些信號通路的正常激活，逃避宿主免疫防御，為自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。在調(diào)控機(jī)制研究方面，發(fā)現(xiàn)了新型泛素化反應(yīng)的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控機(jī)制。正調(diào)控方面，Ca2+-CaM信號通路通過激活SidJ，進(jìn)而修飾SdeA等SidE家族蛋白，增強(qiáng)新型泛素化活性；細(xì)胞內(nèi)較高濃度的NAD+也能為反應(yīng)提供充足底物，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。負(fù)調(diào)控方面，效應(yīng)蛋白DupA/B能夠?qū)α姿岷颂欠核鼗孜镞M(jìn)行去泛素化，抑制新型泛素化反應(yīng)；效應(yīng)蛋白LnaB在ATP和宿主肌動蛋白的作用下，催化磷酸核糖化泛素的AMPylation修飾，實(shí)現(xiàn)對非經(jīng)典泛素化過程的逆轉(zhuǎn)，從而抑制新型泛素化反應(yīng)。這些研究成果在揭示新型泛素化反應(yīng)機(jī)制、豐富細(xì)胞生命過程認(rèn)知等方面具有重要意義。從理論層面看，打破了傳統(tǒng)泛素化反應(yīng)模式的固有認(rèn)知，為泛素化領(lǐng)域的研究開辟了新方向，填補(bǔ)了我們在泛素化反應(yīng)多樣性方面