第四章酶的分離純化與制劑制備提取分離法：最早采用從動物、植物細(xì)胞中，將酶提取出來，再進(jìn)行分離純化的過程。在動、植物資源豐富的地區(qū)仍采用酶的生產(chǎn)方法？化學(xué)合成法：實(shí)驗(yàn)室階段按照酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中氨基酸或核苷酸的排列順序，通過化學(xué)反應(yīng)將單體連接起來獲得酶。60年代，人工合成牛胰島素、核糖核酸酶核酸類酶的合成亦成功成本高、難以工業(yè)化牛胰島素生物合成法：主要方法通過人工操作，利用微生物、動植物細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的生命活動生產(chǎn)所需的酶。無論哪種方法，酶的分離純化都是酶生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)！酶的純化過程及制劑制備選擇原料將酶提取出來

酶提取液粗酶液純化酶

均質(zhì)酶破碎胞外酶均可酶制劑學(xué)習(xí)目標(biāo)：P47酶活檢測的目的防止酶損失太多，考察酶回收率；評估純化效率，純化倍數(shù)（純度提高比）。酶回收率(產(chǎn)率)=純化后總活力/純化前總活力×100%每次總活力/第一次總活力×100%

純化倍數(shù)=純化后比活力/純化前比活力每次比活力/第一次比活力第一節(jié)細(xì)胞破碎酶存在位置胞外酶胞內(nèi)酶分泌到細(xì)胞外或細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁間的酶在細(xì)胞內(nèi)起催化作用的酶一般為水解酶類多數(shù)酶一、目的：使胞內(nèi)酶釋放二、方法（一）機(jī)械破碎法：機(jī)械力1、搗碎法：破碎程度低高速旋轉(zhuǎn)葉片的剪切力脆嫩的組織細(xì)胞和微生物細(xì)胞二、方法2、研磨法：研缽、電動球磨機(jī)3、勻漿法：

（二）物理破碎法1、溫度差法：

較高溫低溫?zé)崦浝淇s脆弱細(xì)胞－革蘭氏陰性菌難以工業(yè)化2、壓力差法（1）滲透壓差法

2、壓力差法

出口降壓法（2）突然降壓法

爆炸式降壓法3、超聲波法利用10～25kHz超聲波，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴而破碎。防酶失活：（1）冷庫中進(jìn)行（2）冰浴中間歇進(jìn)行適用：微生物破碎

第二節(jié)酶的提取

酶的提取：在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┲羞^程。酶的溶解性質(zhì)：易溶于極性溶液。易溶于水，但純水的效果并不是最好的一、提取方法1、鹽溶液提?。合←}溶液，0.02～0.5mol/L低濃度鹽：鹽溶；高濃度鹽：鹽析2、酸溶液提取：pH不可太低3、堿溶液提取：pH不可太高4、有機(jī)溶劑提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含較多非極性基團(tuán)的酶二、影響酶提取的主要因素1、溶解度：多數(shù)易溶于水，少數(shù)溶于有機(jī)溶劑2、擴(kuò)散速度：速度越大，提取效果越好3、溫度：溫度增高，增加溶解度和擴(kuò)散速度，過高，易引起酶變性失活。4、pH：避開酶的等電點(diǎn)。5、提取液體積：增加，提高提取率，過量會降低酶濃度。一篇論文上：酶的提?。喝?g兔肝，用PBS緩沖液，固液比1:5，20℃提取30min，共提取3次。請問具體怎么操作？提取率不高，改進(jìn)措施？第三節(jié)固液分離一、離心1、常速離心機(jī)低速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速8000r/min以下，分離細(xì)胞及其碎片、粗結(jié)晶、培養(yǎng)基殘?jiān)?、高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速0.8×104～2.5×104r/min，分離沉淀、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器等。有些有冷凍裝置。3、超速離心機(jī)：

最大轉(zhuǎn)速﹥2.5×104r/min，分離生物大分子、細(xì)胞器、病毒。均有冷凍裝置。超速離心機(jī)制備用～分析用～分析－制備兩用～4、過濾式離心機(jī)5、管式離心機(jī)6、碟片式離心機(jī)

（二）過濾（粗濾）分離：酵母、霉菌、動植物細(xì)胞、培養(yǎng)基殘?jiān)＿^濾介質(zhì)：濾紙、濾布等。推動力不同常壓過濾加壓過濾粗濾減壓過濾活性炭1、常壓過濾推動力：液位差如：濾紙過濾,吊籃（袋）過濾優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便缺點(diǎn)：過濾速度慢，分離效果差難以大規(guī)模連續(xù)使用2、加壓過濾推動力：壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力如：壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備較簡單，過濾速度較快，過濾效果較好。在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用！3、減壓過濾推動力：過濾介質(zhì)上下方之間的壓力差（下方抽真空）如：抽濾瓶、真空抽濾機(jī)缺點(diǎn)：多用于粘性不大的物料真空轉(zhuǎn)鼓式過濾機(jī)

思考：1.設(shè)計(jì)枯草桿菌蛋白酶（胞外酶）粗酶液制備的技術(shù)路線。2.如果制備大腸桿菌青霉素?；福ò麅?nèi)酶）粗酶液呢？3.設(shè)計(jì)制備人血SOD粗酶液的技術(shù)路線。

第四節(jié)沉淀分離沉淀：添加某些物質(zhì)或改變某些條件使待提取酶或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低，而形成無定形沉淀的過程。沉淀分離：利用條件改變時不同物質(zhì)溶解度改變程度不同的性質(zhì)，使酶或雜質(zhì)形成沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。一、一般沉淀操作的過程1、樣品中加入沉淀劑或改變條件；2、沉淀物的陳化；3、離心或過濾，收集或除去沉淀物；二、方法（一）鹽析：通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)溶解度降低，從溶液析出的過程。溶解度會為零嗎？1、鹽對溶解度的影響生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：帶某種電荷，相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系周圍有水化膜，避免了相互碰撞當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時：

鹽溶－低鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度增大

鹽析－高鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度下降，2、鹽溶與鹽析原理鹽析：A.中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜；B.無機(jī)離子中和表面電荷，分子間的排斥力減弱，相互靠攏；鹽溶：A.中性鹽使表面電荷增多，分子間的排斥力增強(qiáng)，占優(yōu)勢；B.中性鹽的親水性使水化膜變薄，劣勢；鹽使蛋白質(zhì)脫水化膜示意圖疏水區(qū)鹽使蛋白質(zhì)溶解度增加示意圖3、影響鹽析的因素溶質(zhì)種類溶質(zhì)濃度：

pH值：欲分離蛋白質(zhì)pI附近；鹽析溫度：室溫或低溫；蛋白質(zhì)濃度大，鹽用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽用量大，分辨率高；4、鹽析的方法（1）一次鹽析：主要含目的蛋白質(zhì)（2）分段鹽析：含多種蛋白質(zhì)的混合液，使不同蛋白質(zhì)分批分離。如一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀。5、提高鹽濃度的方法飽和度：溶液中加入的飽和鹽溶液的體積與混合

溶液總體積之比。（1）加飽和溶液飽和度溶液的配制：見課本P87例1：用硫酸銨沉淀某酶需0.3的飽和度，現(xiàn)有70ml酶液，需飽和硫酸銨多少ml？特點(diǎn)：飽和度低、溫和6、提高鹽濃度的方法例3：如果沉淀某一種酶需要60%飽和度的硫酸銨，那么1L溶液中需硫酸銨固體的量是多少？（2）直接加鹽法例2：往酶液中加入硫酸銨，使其終濃度為390g/L。酶液500ml，硫酸銨多少？例4：如果一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀，怎么沉淀這種酶？特點(diǎn)：飽和度高，易局部過飽和（二）有機(jī)溶劑沉淀法通過加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。1、原理：（1）降低了溶液的介電常數(shù)，溶質(zhì)間靜電斥力減少，從而聚集；（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了蛋白質(zhì)表面水化膜的厚度，導(dǎo)致凝聚。2、主要影響因素溫度：低溫（防止變性和提高收率）時間：短時溶液pH值：欲分離酶的pI附近樣品濃度:0.5~2%

?。喝軇┯昧看?，回收率低，共沉作用小 濃：溶劑用量小，共沉作用強(qiáng)，分辨率低3、常用沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，毒性大；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48

丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取水溶性好4、特點(diǎn)分辨率高；溶劑易分離，并可回收使用；不含無機(jī)鹽易使蛋白質(zhì)失活；（三）等電點(diǎn)沉淀法通過調(diào)節(jié)溶液pH至酶的pI，使酶的溶解度最低而沉淀析出。1、原理：酶所帶靜電荷為0，靜電斥力消失，分子聚集。2、應(yīng)用水化膜仍存在，酶仍有一定溶解度，沉淀不完全，所以常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法一起使用。單獨(dú)使用時，常用于除去pI相差較大的雜蛋白。3、操作時注意事項(xiàng)（1）受無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低（2）酸堿調(diào)節(jié)要慢，注意攪拌（四）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀，而不影響所需的酶。方法熱變性酸堿變性金屬離子變性慎重使用?。?！第五節(jié)膜分離高分子膜做過濾介質(zhì)的過濾，也稱膜過濾包括微濾、超濾、納濾、反滲透、透析等常用于酶分離純化的有超濾和透析1、超濾：超濾膜（2nm≤截留顆粒R≤0.2μm）截留分子質(zhì)量介于500~1000kD的大分子和膠體粒子。分離病毒、生物大分子，用于酶的分離純化、

濃縮、脫鹽和換液減小濾餅層的堆積，保證過濾速度的穩(wěn)定常采用切向流過濾，液體流動方向與過濾方向垂直小型切向流超濾的膜包及超濾濃縮示意圖采用超濾離心管實(shí)現(xiàn)濃縮和換液的示意圖不同孔徑的超濾膜具有不同的蛋白分離范圍截留分子量：被截留物質(zhì)的最小分子量選擇截留分子量為目的蛋白分子量的1/3的超濾膜2.透析小分子利用擴(kuò)散作用擴(kuò)散到膜外，大分子被截留在膜內(nèi)，從而使大、小分子分離的方法主要用于實(shí)驗(yàn)室水平的除鹽、有機(jī)溶劑及小分

子抑制劑等。第六節(jié)萃取分離利用各種組分在兩個互不相溶的液相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如有機(jī)溶劑萃取、超臨界萃取雜質(zhì)溶質(zhì)萃取劑LightphaseHeavyphase原溶劑1.雙水相萃取

利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而達(dá)到分離。2.6％PEG7.6％Dextran4.9％PEG1.8％Dextran1、雙水相含有一定濃度的兩種高聚物或高聚物和鹽或正負(fù)離子表面活性劑的水溶液形成的互不相溶有明顯界面的兩個水相。2、雙水相系統(tǒng)：（1）PEG－鹽（2）PEG－DEXTRAN（3）正/負(fù)離子表面活性劑3、雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)（1）平衡時間短（2）含水量高，適合于生物活性物質(zhì)的分離純化（3）設(shè)備簡單（4）操作簡便（5）易于放大2.反膠束萃取利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。1、膠束：表面活性劑在水溶液中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”，溶解非極性物質(zhì)水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”2、反膠束：表面活性劑在有機(jī)溶劑中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”，“水池”溶解極性物質(zhì)保護(hù)作用有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”3、反膠束萃取的原理兩相界面的表面活性劑在帶相反電荷蛋白質(zhì)的靜電引力下發(fā)生變性，變成包含蛋白質(zhì)的反膠束，分離反膠束后，置于水溶液中，反膠束解散，形成膠束，蛋白質(zhì)被釋放于水溶液中。有機(jī)相水相水相有機(jī)相水相有機(jī)相水相4、影響萃取的因素（1）水相pH

陽離子表面活性劑pH>pI

陰離子表面活性劑pH<pI（2）離子強(qiáng)度：I高，萃取率低第四節(jié)沉淀分離學(xué)習(xí)目標(biāo)：

1.能進(jìn)行沉淀方法的選擇2.能熟練進(jìn)行沉淀用鹽或有機(jī)溶劑量的計(jì)算3.能評價(jià)沉淀方法優(yōu)劣沉淀分離：利用條件改變時不同物質(zhì)溶解度改變程度不同的性質(zhì)，使酶或雜質(zhì)形成無定形沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。與結(jié)晶的區(qū)別結(jié)晶：溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出酶結(jié)晶條件：溶解度的變化要慢酶達(dá)到一定純度顯微鏡下的溶菌酶晶體一、一般沉淀操作的過程1、樣品中加入沉淀劑或改變條件；2、沉淀物的陳化；3、離心或過濾，收集或除去沉淀物；二、方法（一）鹽析：通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)溶解度降低，從溶液析出的過程。溶解度會為零嗎？1、鹽對溶解度的影響生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：帶某種電荷，相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系周圍有水化膜，避免了相互碰撞當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時：

鹽溶－低鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度增大

鹽析－高鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度下降，2、鹽溶與鹽析原理鹽析：A.中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜；B.無機(jī)離子中和表面電荷，分子間的排斥力減弱，相互靠攏；鹽溶：A.中性鹽使表面電荷增多，分子間的排斥力增強(qiáng)，占優(yōu)勢；B.中性鹽的親水性使水化膜變薄，劣勢；鹽使蛋白質(zhì)脫水化膜示意圖疏水區(qū)鹽使蛋白質(zhì)溶解度增加示意圖3、影響鹽析的因素溶質(zhì)種類溶質(zhì)濃度：

pH值：欲分離蛋白質(zhì)pI附近；鹽析溫度：室溫或低溫；蛋白質(zhì)濃度大，鹽用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽用量大，分辨率高；4、鹽析的方法（1）一次鹽析：主要含目的蛋白質(zhì)（2）分段鹽析：含多種蛋白質(zhì)的混合液，使不同蛋白質(zhì)分批分離。如一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀。5、提高鹽濃度的方法飽和度：溶液中加入的飽和鹽溶液的體積與混合

溶液總體積之比。（1）加飽和溶液飽和度溶液的配制：見課本P87例1：用硫酸銨沉淀某酶需0.3的飽和度，現(xiàn)有70ml酶液，需飽和硫酸銨多少ml？特點(diǎn)：飽和度低、溫和6、提高鹽濃度的方法例3：如果沉淀某一種酶需要60%飽和度的硫酸銨，那么1L溶液中需硫酸銨固體的量是多少？（2）直接加鹽法例2：往酶液中加入硫酸銨，使其終濃度為390g/L。酶液500ml，硫酸銨多少？例4：如果一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀，怎么沉淀這種酶？特點(diǎn)：飽和度高，易局部過飽和（二）有機(jī)溶劑沉淀法通過加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。1、原理：（1）降低了溶液的介電常數(shù)，溶質(zhì)間靜電斥力減少，從而聚集；（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了蛋白質(zhì)表面水化膜的厚度，導(dǎo)致凝聚。2、主要影響因素溫度：低溫（防止變性和提高收率）時間：短時溶液pH值：欲分離酶的pI附近樣品濃度:0.5~2%

稀：溶劑用量大，回收率低，共沉作用小 濃：溶劑用量小，共沉作用強(qiáng)，分辨率低3、常用沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，毒性大；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48

丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取水溶性好4、特點(diǎn)分辨率高；溶劑易分離，并可回收使用；不含無機(jī)鹽易使蛋白質(zhì)失活；（三）等電點(diǎn)沉淀法通過調(diào)節(jié)溶液pH至酶的pI，使酶的溶解度最低而沉淀析出。1、原理：酶所帶靜電荷為0，靜電斥力消失，分子聚集。2、應(yīng)用水化膜仍存在，酶仍有一定溶解度，沉淀不完全，所以常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法一起使用。單獨(dú)使用時，常用于除去pI相差較大的雜蛋白。3、操作時注意事項(xiàng)（1）受無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低（2）酸堿調(diào)節(jié)要慢，注意攪拌（四）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀，而不影響所需的酶。方法熱變性酸堿變性金屬離子變性慎重使用?。?！第五節(jié)膜分離高分子膜做過濾介質(zhì)的過濾，也稱膜過濾包括微濾、超濾、納濾、反滲透、透析等常用于酶分離純化的有超濾和透析1、超濾：超濾膜（2nm≤截留顆粒R≤0.2μm）截留分子質(zhì)量介于500~1000kD的大分子和膠體粒子。分離病毒、生物大分子，用于酶的分離純化、

濃縮、脫鹽和換液減小濾餅層的堆積，保證過濾速度的穩(wěn)定常采用切向流過濾，液體流動方向與過濾方向垂直小型切向流超濾的膜包及超濾濃縮示意圖采用超濾離心管實(shí)現(xiàn)濃縮和換液的示意圖不同孔徑的超濾膜具有不同的蛋白分離范圍截留分子量：被截留物質(zhì)的最小分子量選擇截留分子量為目的蛋白分子量的1/3的超濾膜2.透析小分子利用擴(kuò)散作用擴(kuò)散到膜外，大分子被截留在膜內(nèi)，從而使大、小分子分離的方法主要用于實(shí)驗(yàn)室水平的除鹽、有機(jī)溶劑及小分

子抑制劑等。第六節(jié)萃取分離利用各種組分在兩個互不相溶的液相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如有機(jī)溶劑萃取、超臨界萃取雜質(zhì)溶質(zhì)萃取劑LightphaseHeavyphase原溶劑1.雙水相萃取

利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而達(dá)到分離。2.6％PEG7.6％Dextran4.9％PEG1.8％Dextran1、雙水相含有一定濃度的兩種高聚物或高聚物和鹽或正負(fù)離子表面活性劑的水溶液形成的互不相溶有明顯界面的兩個水相。2、雙水相系統(tǒng)：（1）PEG－鹽（2）PEG－DEXTRAN（3）正/負(fù)離子表面活性劑3、雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)（1）平衡時間短（2）含水量高，適合于生物活性物質(zhì)的分離純化（3）設(shè)備簡單（4）操作簡便（5）易于放大2.反膠束萃取利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。1、膠束：表面活性劑在水溶液中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”，溶解非極性物質(zhì)水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”2、反膠束：表面活性劑在有機(jī)溶劑中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”，“水池”溶解極性物質(zhì)保護(hù)作用有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”3、反膠束萃取的原理兩相界面的表面活性劑在帶相反電荷蛋白質(zhì)的靜電引力下發(fā)生變性，變成包含蛋白質(zhì)的反膠束，分離反膠束后，置于水溶液中，反膠束解散，形成膠束，蛋白質(zhì)被釋放于水溶液中。有機(jī)相水相水相有機(jī)相水相有機(jī)相水相4、影響萃取的因素（1）水相pH

陽離子表面活性劑pH>pI

陰離子表面活性劑pH<pI（2）離子強(qiáng)度：I高，萃取率低第六節(jié)層析分離利用樣品中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)不同，使各組分從層析柱中先后流出，又稱色譜。AbsBio-Rad伯樂一、層析技術(shù)（一）凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的分子量不同而達(dá)到分離的層析技術(shù)。1、原理大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠微孔，從凝膠間隙中以較快的速度流出小分子物質(zhì)不斷地進(jìn)出微孔，向下移動速度變慢各組分按分子量由大到小順序先后流出層析柱3、操作平衡↓上樣↓洗脫上樣量：凝膠體積的10％左右

1）用裝柱時同樣的溶液洗脫2）洗脫液體積為凝膠體積的120％左右3）洗脫流出液分部收集4）不必再生（二）離子交換層析1、原理：離子交換劑可與帶電荷的酶結(jié)合對帶不同電荷蛋白的結(jié)合力不同在條件改變時，結(jié)合力弱的蛋白先被交換下來，結(jié)合力強(qiáng)的后被交換下來。2、離子交換劑：（1）構(gòu)成不溶性的具有三維空間的網(wǎng)絡(luò)骨架連接在骨架上的活性基團(tuán)，如－SO3H、－COOH（2）分類：活性基團(tuán)離子交換劑陽離子交換劑陰離子交換劑陽離子交換柱陰離子交換柱陽離子交換柱活性基團(tuán)：酸性基團(tuán)，如－SO3H、－PO3H2、－COOH等，可解離出H＋，與其他陽離子交換。溶液pH＜pI時，酶帶正電荷。CM－纖維素陽離子交換劑陰離子交換劑活性基團(tuán)：堿性基團(tuán)，如－NH2、－NHCH3、－N(CH3)2

，可解離出OH-，與其他陰離子交換。溶液pH＞pI時，酶帶負(fù)電荷DEAE－sephsdexA-25陰離子交換劑4、離子交換劑的選擇（1）根據(jù)待分離酶pI確定層析時酶液pH值

考慮酶的有效pH范圍、操作條件溫和NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost（2）判斷酶所帶電荷（3）選擇陽離子交換劑或陰離子交換劑

陽離子交換柱：CM-，SP陰離子交換柱：DEAE，QQ：載量大，DEAE：分辨率高5.層析步驟平衡↓上樣↓平衡除雜↓洗脫用初始緩沖液洗去未結(jié)合物質(zhì)常用梯度洗脫法，將酶按親和力由小到大的順序洗脫下來5.層析步驟平衡↓上樣↓平衡除雜↓洗脫初始緩沖液洗脫液，常用梯度洗脫法（提高鹽濃度或改變pH），將酶按親和力由小到大的順序洗脫下來初始緩沖液（低鹽溶液）初始緩沖液++++++-------anionexchangebeadEquilibrationSampleapplicationandwash-----------++++++----Elution----------------------------------++++++++++++--Regeneration-----------------------++++++SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------再生：高鹽除去結(jié)合牢固的蛋白，多次使用后才需要（三）疏水層析：

是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子（蛋白質(zhì)）發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的層析技術(shù)。

球形蛋白質(zhì)的疏水性殘基數(shù)是從外向內(nèi)逐步增加的。有些疏水氨基酸暴露在外，在蛋白質(zhì)表面形成疏水區(qū)域，稱為疏水補(bǔ)丁。溶菌酶的疏水和親水部件表面最疏水部分是深紅色,淺紅色的更少的疏水性。最親水部分顯示在深藍(lán)色的,更少的親水部分是淺藍(lán)色。在純水中，任何疏水效應(yīng)都太弱而不能導(dǎo)致配基和蛋白之間或蛋白自身的相互作用。鹽能夠增強(qiáng)疏水作用。A)疏水層析原理B)吸附：高鹽濃度

解析：低鹽濃度層析步驟平衡↓上樣↓平衡除雜↓洗脫Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionEquilibratethecolumnandadjustthesampletobindingconditionsHydrophobicligandGelmatrixWatermoleculesSampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.

Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroupsWashingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteinsElution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionTargetelutesConc.saltAbsElutionConc.saltAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteinsElutionAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteins（四）親和層析1、定義

利用生物分子與配基之間具有的專一性而可逆的親和力，使物質(zhì)分離的技術(shù)

如：酶與底物、抗原與抗體、酶與輔酶

配基：作固定相的一方，分子對的任一方，配基必須偶聯(lián)在不溶性母體上。母體：載體，葡聚糖凝膠、纖維素等親和層析劑：配基與母體偶聯(lián)母體活化：引入活潑基團(tuán)，與配基偶聯(lián)連接臂：克服空間位阻(小配基)親和層析劑：配基與母體偶聯(lián)2、原理酶液流經(jīng)親和層析柱時，酶分子與其配基分子結(jié)合留在柱內(nèi)，其他雜質(zhì)流出；再將酶洗脫下來，達(dá)到分離效果。3、特點(diǎn)：選擇性好、價(jià)格較貴4、親和層析方法（1）共價(jià)親和層析酶分子與層析劑配基形成可逆性的共價(jià)鍵，如－S－S－；再用半胱氨酸、巰基乙醇洗脫。如：純化牛乳巰基氧化酶、青霉素?；福?）金屬離子親和層析酶表面的某些氨基酸殘基可與金屬離子結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：可用不同的金屬離子結(jié)合到螯合載體上母體易再生（3）免疫親和層析

抗原和抗體的專一而可逆的親和力配基：抗原、抗體蛋白A、蛋白G(吸附IgG)（4）染料親和層析

一些有機(jī)染料，具有類似于NAD＋的結(jié)構(gòu)，對以核甘酸類物質(zhì)為輔酶的酶由一定的親和力。有機(jī)染料：蒽醌化合物、偶氮化合物5.層析步驟平衡↓上樣↓平衡除雜↓洗脫用初始緩沖液洗去未結(jié)合物質(zhì)改變緩沖液將結(jié)合的目標(biāo)酶洗下第七節(jié)電泳分離1、定義

帶電粒子在電場中向與其所帶電荷相反的電極移動。2、分離原理

方向：所帶電荷有關(guān)速度：主要與所帶電荷量、分子大小、分子構(gòu)象有關(guān)，還與電泳條件有關(guān)。（一）分類：支持體（1）紙電泳：濾紙（2）薄層電泳