2025年大學(xué)《分子科學(xué)與工程》專業(yè)題庫——酶工程與分子生物學(xué)結(jié)合考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（每小題2分，共20分。請將正確選項的代表字母填在題后的括號內(nèi)）1.在將編碼某種酶的基因克隆到表達(dá)載體中時，選擇合適的啟動子是確保酶高效表達(dá)的關(guān)鍵因素。以下哪種啟動子通常用于實現(xiàn)強(qiáng)啟動和組成型表達(dá)？A.Trp啟動子B.葡萄糖操縱子（pLac）C.熱休克蛋白基因啟動子（hsp）D.腺病毒早期啟動子2.限制性內(nèi)切核酸酶（RE）在分子克隆中扮演著重要角色。以下關(guān)于RE的描述哪項是正確的？A.它們特異性識別并切割宿主細(xì)胞的DNA，用于防御外源DNA。B.它們識別特定的DNA序列并切割磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的粘性末端或平末端可用于連接DNA片段。C.它們能夠直接催化DNA的復(fù)制。D.它們的作用是修飾DNA的堿基序列。3.PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是分子生物學(xué)中的一項核心技術(shù)。其能夠特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段依賴于：A.一種耐熱的DNA聚合酶。B.特異性引物與目標(biāo)DNA序列的互補(bǔ)結(jié)合。C.DNA雙鏈的變性、退火和延伸過程。D.目標(biāo)DNA片段自身的酶解活性。4.酶工程中，對酶進(jìn)行固定化的目的是：A.降低酶的催化活性。B.使酶能夠重復(fù)使用，易于從反應(yīng)體系中分離。C.增加酶的分子量，提高其在凝膠電泳中的遷移速度。D.增強(qiáng)酶的變構(gòu)效應(yīng)。5.基于分子生物學(xué)的原理，改造酶的熱穩(wěn)定性可以通過以下哪種策略實現(xiàn)？A.尋找自然界中已存在的熱穩(wěn)定性酶。B.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增酶的編碼基因。C.通過蛋白質(zhì)工程，對酶的氨基酸序列進(jìn)行定點突變，優(yōu)化其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。D.降低酶的表達(dá)水平。6.以下哪種技術(shù)通常用于大規(guī)模篩選能夠催化特定轉(zhuǎn)化的酶？A.DNA測序B.基因芯片雜交C.表型篩選（例如，在平板上觀察色素產(chǎn)生或透明圈）D.質(zhì)譜分析7.mRNA的半衰期是影響基因表達(dá)水平的一個重要因素。以下哪種分子機(jī)制可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性？A.DNA復(fù)制B.轉(zhuǎn)錄起始C.mRNA的降解（通過核酸酶或RNA干擾機(jī)制）D.蛋白質(zhì)翻譯8.在利用基因工程生產(chǎn)藥用蛋白時，常選擇哪種生物作為表達(dá)宿主？A.真菌（如酵母、霉菌）B.細(xì)菌（如大腸桿菌）C.離體植物細(xì)胞D.哺乳動物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）9.酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)是一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。以下哪種分子可以作為變構(gòu)效應(yīng)劑？A.引物RNAB.底物分子C.產(chǎn)物分子D.mRNA10.基因測序技術(shù)的發(fā)展極大地推動了酶工程的研究。以下哪種測序技術(shù)是目前主流的長讀長測序方法？A.Sanger測序法B.轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）C.基于宏基因組學(xué)的鳥槍法測序D.PacBio測序或OxfordNanopore測序二、填空題（每空2分，共20分。請將答案填在橫線上）1.分子克隆過程中，將目的基因片段插入到載體DNA中，通常需要使用______酶和______連接酶。2.真核生物的基因表達(dá)調(diào)控比原核生物更為復(fù)雜，除了啟動子外，______和______等遠(yuǎn)端調(diào)控元件也參與其中。3.酶的固定化方法主要包括______法、______法、吸附法和包埋法。4.通過蛋白質(zhì)工程改造酶時，常用的策略包括定點突變、______和______。5.限制性內(nèi)切核酸酶識別的DNA序列通常具有______對稱性。6.基因表達(dá)工程的核心目標(biāo)是根據(jù)需要，對基因的表達(dá)______、______和______進(jìn)行人為控制。7.PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)者是______和______。8.酶的活性中心通常包含一個或多個具有______功能的氨基酸殘基。9.基因芯片技術(shù)可以用于______和______等高通量分析。10.重組DNA技術(shù)是將______和______在體外進(jìn)行拼接重組，然后導(dǎo)入______中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)或整合表達(dá)的技術(shù)。三、簡答題（每小題5分，共20分）1.簡述PCR技術(shù)的基本原理及其關(guān)鍵步驟。2.比較酶的固定化方法和酶水溶液法在應(yīng)用中的主要區(qū)別。3.簡述基因工程生產(chǎn)藥用蛋白的主要流程。4.解釋什么是同源重組和異源重組，并簡述它們在基因工程中的應(yīng)用。四、論述題（每小題10分，共20分）1.論述蛋白質(zhì)工程在酶分子改造中的意義和基本流程。2.結(jié)合實例，論述酶工程與分子生物學(xué)結(jié)合在生物燃料生產(chǎn)或生物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。五、實驗設(shè)計/計算題（每小題10分，共20分）1.設(shè)計一個實驗方案，用于篩選能夠耐受高濃度鹽離子（如NaCl）的枯草桿菌蛋白酶變異體。簡要說明實驗思路、關(guān)鍵步驟和預(yù)期結(jié)果。2.假設(shè)你獲得了一種未知酶Km值為50mM，Vmax為100μmol/min/mL。請計算當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mM時，該酶的比活力（Vmax/[Vmax+Km]）是多少？并解釋該計算結(jié)果的實際意義。試卷答案一、選擇題1.C2.B3.B4.B5.C6.C7.C8.ABD9.C10.D二、填空題1.限制性內(nèi)切核酸酶，DNA連接酶2.增強(qiáng)子，沉默子3.物理吸附，化學(xué)交聯(lián)4.錯義突變，飽和突變5.二重旋轉(zhuǎn)對稱6.時間，地點，水平7.Mullis，Cairns8.催化9.基因表達(dá)譜分析，蛋白質(zhì)組學(xué)分析10.分子片段，載體，宿主細(xì)胞三、簡答題1.PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本原理是利用一對特異性引物，在嗜熱DNA聚合酶（如Taq酶）的作用下，按半保留復(fù)制的方式，在體外進(jìn)行DNA片段的快速擴(kuò)增。關(guān)鍵步驟包括：高溫變性（使DNA雙鏈解開），低溫退火（引物與互補(bǔ)鏈結(jié)合），中溫延伸（聚合酶合成新鏈）。通過這三大步驟的循環(huán)，目標(biāo)DNA片段數(shù)量呈指數(shù)級增加。2.酶的固定化是指將酶分子束縛在特定的載體上，使其成為水不溶性或與水不互溶的狀態(tài)，但酶的活性中心仍保持在水溶性環(huán)境中。與酶水溶液法相比，固定化酶的主要優(yōu)點包括：酶可以重復(fù)使用，降低了成本；反應(yīng)物更容易與酶接觸，傳質(zhì)阻力減??；酶與產(chǎn)物容易分離，簡化了產(chǎn)物純化過程；酶可能表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。缺點可能包括：固定化過程可能影響酶的活性；載體的存在可能限制酶的構(gòu)象變化，影響活性。3.基因工程生產(chǎn)藥用蛋白的主要流程通常包括：①目的基因的獲?。和ㄟ^PCR、基因克隆或合成等方法獲得編碼目標(biāo)藥用蛋白的基因。②表達(dá)載體的構(gòu)建：將目的基因插入到合適的表達(dá)載體（如質(zhì)粒、病毒載體）中，并包含必要的調(diào)控元件（如啟動子、核糖體結(jié)合位點）。③宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染：將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞（如細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞）中。④藥用蛋白的表達(dá)與誘導(dǎo)：通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缂尤胝T導(dǎo)劑）誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)目的蛋白。⑤藥用蛋白的分離純化：通過層析、沉淀等方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或裂解物中分離純化目標(biāo)藥用蛋白，并進(jìn)行質(zhì)量鑒定。4.同源重組是指利用帶有同源序列的DNA分子（如線性DNA分子）與宿主染色體DNA進(jìn)行交換的過程，這些同源序列通常位于要發(fā)生交換的位點附近。異源重組是指利用帶有非同源序列的DNA分子（如質(zhì)粒）與宿主染色體DNA進(jìn)行交換的過程。在基因工程中，同源重組可用于精確替換基因、插入基因或敲除基因，常通過負(fù)篩選（如抗生素抗性標(biāo)記的丟失）或正篩選（如報告基因的表達(dá)）進(jìn)行篩選。異源重組常用于將外源基因?qū)氲皆松铮ㄈ绱竽c桿菌）中，或用于某些酵母的轉(zhuǎn)化過程。四、論述題1.蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們對酶或蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識，通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，設(shè)計并改造蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，以獲得具有更優(yōu)良性能（如更高活性、更強(qiáng)的穩(wěn)定性、更適于工業(yè)生產(chǎn)的條件、新的功能等）的蛋白質(zhì)分子的技術(shù)。其意義在于能夠克服天然酶在應(yīng)用中的局限性，滿足工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的特定需求。基本流程包括：①確定改造目標(biāo)：根據(jù)應(yīng)用需求，確定需要提高的酶的性能指標(biāo)。②蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測與設(shè)計：利用計算機(jī)模擬和生物信息學(xué)方法預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，設(shè)計合適的氨基酸突變位點及突變類型（如錯義突變、沉默突變、取代突變等）。③基因突變：通過PCR定點突變、PCR誘變、寡核苷酸誘變等方法獲得編碼突變蛋白質(zhì)的基因。④變異體篩選：將突變基因轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中表達(dá)，通過體外酶活性測定或生物測定方法篩選出性能改善的酶變異體。⑤結(jié)構(gòu)與功能分析：對篩選到的優(yōu)良變異體進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定和功能表征，驗證改造效果。2.酶工程與分子生物學(xué)結(jié)合在生物燃料生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，通過蛋白質(zhì)工程改造纖維素酶，提高其活性、耐酸堿性和熱穩(wěn)定性，可以更高效地降解植物秸稈等生物質(zhì)中的纖維素，釋放出葡萄糖，為生物乙醇的生產(chǎn)提供關(guān)鍵原料。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，可以利用基因工程構(gòu)建高效表達(dá)纖維素降解酶系（包括內(nèi)切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶）的工程菌，或利用合成生物學(xué)設(shè)計更優(yōu)化的代謝通路，提高生物燃料的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。在生物修復(fù)領(lǐng)域，可以利用基因工程改造的酶（如降解石油烴的酶、降解農(nóng)藥的酶）或構(gòu)建能夠高效降解污染物的工程菌，用于環(huán)境中的污染物去除。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，使其能在惡劣的環(huán)境條件下（如高鹽、高溫、高pH）發(fā)揮作用，提高生物修復(fù)的效率。此外，通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等分子生物學(xué)手段，可以更全面地了解酶的功能和作用機(jī)制，為酶的發(fā)現(xiàn)和改造提供更堅實的理論基礎(chǔ)。五、實驗設(shè)計/計算題1.實驗方案設(shè)計：篩選耐受高濃度鹽離子（NaCl）的枯草桿菌蛋白酶變異體。實驗思路：利用定向進(jìn)化或隨機(jī)誘變產(chǎn)生枯草桿菌蛋白酶的突變體庫，通過在含有不同濃度NaCl的底物溶液中篩選能夠保持較高活性的酶變異體。關(guān)鍵步驟：①蛋白酶突變體庫構(gòu)建：采用PCR定點突變、易錯PCR或DNAShuffling等技術(shù)，對枯草桿菌蛋白酶基因的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變，獲得蛋白酶突變體庫。②突變體轉(zhuǎn)化：將構(gòu)建好的突變體庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或其他合適的宿主細(xì)胞中。③篩選：將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞接種在含有不同濃度（如0.5M,1.0M,1.5MNaCl）的酪蛋白平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，觀察并比較不同濃度平板上透明圈（水解酪蛋白區(qū)域）的大小。透明圈越大，說明該菌株產(chǎn)生的蛋白酶在該濃度NaCl下活性越高。④鑒定：挑取在較高濃度NaCl平板上表現(xiàn)出較大透明圈的菌株，提取其蛋白酶，測定其在不含NaCl和含不同濃度NaCl條件下的具體活性，進(jìn)一步驗證其耐鹽性。對具有優(yōu)良耐鹽性的蛋白酶進(jìn)行測序，分析其突變位點。預(yù)期結(jié)果：通過篩選，可以獲得能夠在較高濃度NaCl環(huán)境中仍保持較高活性的枯草桿菌蛋白酶變異體。2.計算與解釋：Vmax=100μmol/min/mLKm=50mM底物濃度[S]=20mM比活力(V/[Vmax+Km])=(Vmax/[Vmax+Km])*(Km/[S])將數(shù)值代入：(100/(100+50))*(50/20)=(100/150)*(50/20)