目錄TOC\o"1-3"\h\u303091.前言 v1.前言牦牛(YakRotavirus)是我國高原藏區(qū)特產(chǎn)畜種，也是“世界屋脊”著名的景觀牛種。它主要分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)，中國牦牛占世界總數(shù)的95%[1]。一般牦牛全身呈黑褐色，體側(cè)兩邊和胸、腹、尾毛密而長，四肢粗短。它能經(jīng)受零下30℃至40℃的嚴(yán)寒天氣，并可以在海拔3500米至5500米的高寒地區(qū)生長繁衍。牦牛在遺傳上是一個(gè)極為寶貴的基因庫[2]，它作為高原地區(qū)牧民的經(jīng)濟(jì)支柱，是牧民們重要生產(chǎn)、生活資料，直接關(guān)系著藏區(qū)牧業(yè)的增產(chǎn)、增收問題[3]。它的健康養(yǎng)殖更是成為了青藏高原地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)大力發(fā)展的主要因素[4]。犢牛腹瀉是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病，其臨床特征為：病犢牛常出現(xiàn)精神萎靡，食欲廢絕，體溫上升，呼吸短促，脫水及腹瀉等癥狀。臨床上引發(fā)犢牛腹瀉的病因非常復(fù)雜，包括感染性、非感染性的因素，非感染性因素主要有飼喂不當(dāng)、護(hù)理不當(dāng)或飼養(yǎng)環(huán)境惡劣等飼養(yǎng)管理方面的因素；感染性因素主要有病毒、細(xì)菌及寄生蟲等的感染。其中病毒是造成犢牛腹瀉最主要的病因之一，牛輪狀病毒(BRV,Bovinerotavirus)、牛冠狀病毒(BCoV,Bovinecoronavirus)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV,Bovineviraldiarrheavirus)是臨床上最常見的導(dǎo)致犢牛腹瀉的病毒[5]，其流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化非常相似，僅憑臨床診斷無法鑒別，而且這三種病毒混合感染的情況也很常見[6-8]，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測才能進(jìn)行確診[9]。BCoV是導(dǎo)致新生犢牛瀉肚、成年牛冬天瀉肚以及呼吸道疾病的重要病原。一般7日齡內(nèi)感染的多為犢牛，一至兩周內(nèi)常發(fā)生腹瀉，主要癥狀表現(xiàn)為稀水樣性腹瀉，極大影響了犢牛的生長性能；在寒冷冬日里成年牛最常發(fā)生水樣性腹瀉，發(fā)病率高、死亡率低[10]?；夹笕舾腥玖斯跔畈《?，則在病癥痊愈后540天內(nèi)仍會以糞便為傳染物向外界環(huán)境排放病毒[11]。BCoV流行于全球范圍，因此，養(yǎng)牛行業(yè)常常遭受不同程度的經(jīng)濟(jì)的損失[12]；BCoV是由牛病毒性腹瀉病病毒感染而導(dǎo)致的一種臨床類型多且復(fù)雜的疾病，臨床上主要以體溫升高、口腔黏膜等部位糜爛潰瘍、拉稀、持續(xù)性感染、免疫耐受與抑制、妊娠母畜流產(chǎn)、畸形胎或產(chǎn)死胎為主要特點(diǎn)的一種接觸性傳染病。自20世紀(jì)80年代以來，在我國牦牛群中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了BVDV,病死率在30%左右，血清陽性率在30%~42.4%之間，一直嚴(yán)重危害著我國牦牛群的成活率[13]；RV感染可引起多種幼畜和嬰兒的急性胃腸道傳染病，臨床上主要以嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征，BRV是世界公認(rèn)的引起犢牛急性腹瀉的主要病原之一，臨床上傳播迅速，并在世界范圍內(nèi)流行，給全球畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大危害[14-15]。據(jù)報(bào)道顯示在許多國家BRV的陽性率均很高，在英國陽性率為91.18%；在巴西陽性率為88%；在阿根廷陽性率為62.5%；在加拿大魁北克地區(qū)陽性率為74.3%[16-17]。1980年在福建的牧醫(yī)所研究證明了BRV存在于我國的牛群中[18]，在2010年，李鑫對我國BRV流行病學(xué)大規(guī)模的研究調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，BRV感染在我國牛群中也很常見，發(fā)現(xiàn)大部分地區(qū)BRV的陽性檢出率高達(dá)80%以上，而且呈現(xiàn)長期重復(fù)發(fā)生的狀態(tài)[19]。BRV不僅是引起犢牛腹瀉的主要病原之一，而且也是引起犢牦牛腹瀉的重要病原。1985年張敏等，從阿壩州瓦切牧場的牦牛腹瀉糞便樣品中檢測并分離出了BRV[20]，最早證實(shí)了BRV存在于牦牛體內(nèi)。2016年周芳，等在高原藏牧區(qū)進(jìn)行了牛輪狀病毒流行病學(xué)的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)牛輪狀病毒在四川、西藏、青海和云南的犢牦牛腹瀉樣本中的感染率分別為85.19％、60％、95％和90％[21]，說明了BRV嚴(yán)重危害著我國高原地區(qū)牦牛的健康生活，同時(shí)也影響著牧民們牦牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，嚴(yán)重阻礙著世界各地養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展[22-23]。因此，加強(qiáng)對病毒性腹瀉的及時(shí)監(jiān)測和防治是一項(xiàng)不可疏忽的重要任務(wù)。2021年11月份甘孜州稻城縣某牧民家爆發(fā)犢牦牛腹瀉，本研究采用PCR方法對牛腹瀉樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果報(bào)告如下。2.材料與方法2.1樣本采集腹瀉糞便棉拭子11份，2021年11月份采自甘孜州稻城縣某牧民家2-3月齡的犢牦牛，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱保存。該牧場共有犢牦牛28頭，患病犢牦牛11頭，出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、體溫升高，食欲廢絕和腹瀉等癥狀，糞便呈灰綠色水樣。2.2主要試劑及儀器表1主要試劑及儀器Premixtaq寶生物工程(大連)有限公司olTMReagent寶生物工程(大連)有限公司AMarker寶生物工程(大連)有限公司PrimescriptTM盒寶生物工程(大連)有限公司lView寶生物工程(大連)有限公司Eppendorf公司(德國)恒溫水浴鍋(DZKW-D-2)上海科升儀器有限公司(中國上海)高速冷凍離心機(jī)(TGL-16)蜀科儀器有限公司(中國四川)電泳儀(JY300C/ERS300)上海天能科技有限公司(中國上海)凝膠成像系統(tǒng)(VersaDov2000)上海天能科技有限公司(中國上海)PCR儀(TC-96/G/H﹝b﹞c)博日科技有限公司(中國杭州)計(jì)與合成參照文獻(xiàn)[24-26]中有關(guān)BRV、BCoV、物工程有限公司完成。引物信息TablePrimerInformationBVDV法合成引物，引物信息見表1，以上引物的合成全部由生工生GTATGAATTGGACATCACTCAGATGGCGVAACACCCAGATGGGCATCTACACTVCCCTTAGTAGGACTTCAGGCTGTRTYC2.3核酸提取與cDNA的合成2.3.1RNA提取將11份腹瀉糞便棉拭子與適量的PBS渦旋混勻，反復(fù)凍融3次，置于4℃離心機(jī)中10000rpm離心10min，取上清，按照Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說明書進(jìn)行RNA提取，步驟如下：①取400μl上清液至1.5mlEP管中，再加入750μl冰預(yù)冷的Trizol。②將樣品劇烈震蕩混合，在冰上靜置10-15min。③再加入200μl氯仿劇烈震蕩混合，使液體充分混勻呈乳白色狀態(tài)，冰上靜置5min，置于4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min。④將上層次相轉(zhuǎn)移到新的1.5mlEP管中，加入500μl等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置10min，置于4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min，小心的出去全部上清液。⑤用1ml75%DEPC冰乙醇洗滌沉淀和管壁，置于4℃離心機(jī)中12000rpm離心15min。⑥將RNA沉淀干燥，用15μlDEPC水溶解后，將其保存于-80℃?zhèn)溆谩?.4.2cDNA合成采用10μl體系：5×buffer4μL，Randomprimer2μL,PrimeScriptRNase1μl，ddH2O9μl，RNA4μl；反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃15min，85℃15s,16℃1min，合成cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?.4PCR檢測BRV采用2.4合成的3對引物對11份犢牦牛腹瀉樣本的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均采用25μL的反應(yīng)體系見表3，反應(yīng)條件見4—6。表3PCR反應(yīng)體系Table3PCRreactionsystemMasterMix2表4BRVPCR反應(yīng)條件Table4BRVPCRreactionconditionsBCoVPCR條件ableBCoVPCRreaction溫度(℃)表6BVDVPCR反應(yīng)條件擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)成像。3.結(jié)果電泳結(jié)果顯示：通過實(shí)驗(yàn)對11份犢牦牛腹瀉糞便棉拭子樣本中BRV、BCoV、BVDV的PCR檢測，見圖1~圖3。圖1中有8份樣本擴(kuò)增得到BRV特異性條帶，片段大小約為231bp；BCoV與BVDV僅有陽性對照擴(kuò)增出條帶，8份樣本中均未見特異條帶，結(jié)果見圖2、圖3。M:DNAMarkerⅡ;N:陰性對照；P：陽性對照；1~11：被檢樣本BRV擴(kuò)增產(chǎn)物；M:DNAMarkerII;N:negativecontrol;P:positivecontrol;1~11:BRVamplificationproductofthesampletobetested;圖1BRV的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1ElectrophoresisresultsofPCRproductsofBRVM：DNAMarkerII；N：陰性對照；P：陽性對照；1~11：被檢樣本BCoV擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNAMarkerII;N:negativecontrol;P:positivecontrol;1~11:sampletobetestedBCoVamplificationproduct圖2BCoV的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2ElectrophoresisresultsofPCRproductsofBCoVM：DNAMarkerII；P：陽性對照；1~11：被檢樣本BVDV擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNAMarkerII;P:positivecontrol;1~11:BVDVamplificationproductofthesampletobetested圖3BVDV的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.3ElectrophoresisresultsofPCRproductsofBVDV使用RT-PCR方法，11份臨床犢牦牛腹瀉樣本中，BRV的陽性檢出率為72.7%(8/11)，BCoV與BVDV均未檢出。結(jié)合臨床癥狀及流行情況，確診該牧場犢牦牛腹瀉主要由牛輪狀病毒(BRV)感染引起的。4.討論試驗(yàn)檢測結(jié)果中的犢牦牛腹瀉樣本只檢出了BRV，檢出率達(dá)72.7%，BCoV與BVDV均未檢出，再與臨床癥狀進(jìn)行結(jié)合分析后，可確診此牧場犢牦牛腹瀉主要是由BRV引起的，為該牧場牦牛腹瀉的防治提供了科學(xué)依據(jù)。研究顯示，牛輪狀病毒病在我國流行十分嚴(yán)重，2014年何美琳，等為調(diào)查川西北牦牛腹瀉病的流行情況,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對來源于川西北阿壩州8個(gè)縣的1070份牦牛血清中進(jìn)行了BVDV、BCoV、BRV的抗體檢測,其中BRV抗體陽性率達(dá)到94.4%[27]；2016年周芳，等對四川阿壩州14個(gè)牧場的88份犢牦牛腹瀉樣本用特異的PCR方法進(jìn)行了BRV的檢測，結(jié)果顯示BRV核酸陽性檢出率為98.86%[28]；2017年李凡，等用PCR方法對30份牛腹瀉樣本和30份牦牛腹瀉樣本的進(jìn)行BRV的檢測,其中對牛的BRV檢出率為33.33%,對牦牛的BRV檢出率為73.33%[29]；2018年澤旺塔，等對四川若爾蓋縣牦牛輪狀病毒感染情況使用ELISA技術(shù)對276份牦牛血清BRV、BCoV抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：BRV陽性率為99.2%。BRV感染呈全球廣泛分布，在許多國家BRV的陽性率均很高，在阿根廷陽性率為62.5%在加拿大(魁北克地區(qū))陽性率為74.3%；在巴西陽性率為88%；在英國陽性率為91.18%。2010年SwiatekDL，等在澳大利亞維多利亞州Gippsland地區(qū)的三個(gè)不同的農(nóng)場，從小牛中總共收集了100個(gè)糞便樣本，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒陽性樣本感染率為38.5％。這些數(shù)據(jù)共同說明了BRV在世界各地的牛和牦牛群中分布廣泛。BRV在嚴(yán)重危害著世界各地的養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牧民的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。BRV是引起犢牛腹瀉的最重要的病原，可感染各個(gè)年齡段的牛，且多發(fā)于1月齡以內(nèi)的犢牛，在全世界尤其是發(fā)展中國家犢牛中具有重大的發(fā)病率和死亡率[32]。以為稀水樣腹瀉為臨床特征，排出物里偶爾會含雜有血和黏液，嚴(yán)重的會持續(xù)脫水后死亡，若為繼發(fā)性感染，死亡率會迅速上升；該病四季均可發(fā)生，尤其在氣候多變季節(jié)初春及夏末秋初時(shí)最易頻發(fā)，危害病犢牦牛，臨床表現(xiàn)為體溫升高，食欲減退，急性腹瀉，糞便呈灰綠色水樣。部分病畜糞便中帶血，并有許多氣泡和腸粘膜等，是造成犢牦牛生長發(fā)育不良和死亡的最重要的疾病之一，給畜牧業(yè)發(fā)展和牧民養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[33]。此外，BRV常常成為誘發(fā)、并發(fā)或繼發(fā)其他一些腹瀉性疾病的病因，在臨床上出現(xiàn)混合感染情況很嚴(yán)重[34-36]，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展都有較大危害，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。因此，加強(qiáng)牛輪狀病毒病的防治至關(guān)重要?；寂５闹委煟阂皇菫榛夹筮M(jìn)行輸液糾正休克與肌體酸中毒的癥狀，同時(shí)補(bǔ)充能量和維生素；二是可用廣譜抗生素、磺胺類藥物和抗微生物制劑等，能預(yù)防繼發(fā)感染。三是喂服吸附劑與保護(hù)劑可起到腸胃調(diào)節(jié)作用。四是若發(fā)現(xiàn)感染BRV的病犢牛，則必須馬上清理消殺圈舍衛(wèi)生。BRV的預(yù)防：一是防重于治，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就要將病畜犢立即隔離，以防傳染給其他安全健康的犢牛；二是發(fā)現(xiàn)病死或死因不明的犢牛，必須按安全規(guī)定進(jìn)行無害化的處理，對污染的畜舍及周圍環(huán)境嚴(yán)格進(jìn)行消殺處置；三是犢牛哺乳前，母牛的兩對乳頭及時(shí)消毒清干，不能讓病毒通過母乳傳播給了小犢牛；四是初乳營養(yǎng)含量高且豐富，犢牛出生后，要及時(shí)給吃母牛的初乳，以確保犢牛獲得初乳中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；五是奶嘴、毛巾壺、桶、等犢牛哺乳用具要嚴(yán)格開水煮沸消毒；六是做好環(huán)境衛(wèi)生的保障，勤換牧地、勤遷帳篷、維持環(huán)境干燥、衛(wèi)生，清潔排除積糞和雜物，搞好消毒工作；七是加強(qiáng)妊娠母牛和犢牛的飼養(yǎng)管理。參考文獻(xiàn)[1]高文武,達(dá)久.甘孜州牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2018,34(01):42.[2]鐘金城,趙素君,陳智華,etal.牦牛品種的遺傳多樣性及其分類研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(2):389-397.[3]王康,滕建旭.青康牦牛價(jià)值再認(rèn)識[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(人文社科版),2003,24(4):147-148.[4]鐘金城,陳智華,趙素君,etal.牦牛生態(tài)類型的分類[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2006,26(7).[5]張坤.新疆北疆地區(qū)規(guī)?；膛鰻倥２《拘愿篂a相關(guān)病原的調(diào)查研究[D].石河子大學(xué),2016.[6]李然,湯承,岳華.一起奶牛腹瀉病的病原學(xué)診斷[J].四川畜牧獸醫(yī),2019(2):28-30.[7]馬吉云.一起牦牛病毒性腹瀉病原學(xué)診斷[J].中國畜禽種業(yè),2017(9).[8]李凡,阿繼,嚴(yán)州,etal.一起犢牦牛腹瀉病的病原學(xué)診斷[J].四川畜牧獸醫(yī),2017(2):29-31,共3頁.[9]馬吉云.一起牦牛病毒性腹瀉病原學(xué)診斷[J].中國畜禽種業(yè),2017(9).[10]張瑩鈺,張迎春,王青青,etal.新疆南疆牛冠狀病毒BCV-Aks-01株分離及基因型鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2018,v.54(02):2+14-16+20.[11]MadinSH,YorkCJ,MckercherDG.IsolationoftheInfectiousBovineRhinotracheitisVirus[J].Science,1956,124(3225):721-722.[12]CLARKMA.Bovinecoronavirus[J].BrVetJ,1993,149(1):51-70.[13]劉亞剛,殷中瓊,劉世貴,etal.牦牛病毒性腹瀉/粘膜病的防制研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,25(6):487-490.[14]BadaraccoA,GaraicoecheaL,RodríguezD,etal.BovinerotavirusstrainscirculatinginbeefanddairyherdsinArgentinafrom2004to2010.[J].VeterinaryMicrobiology,2012,158(3-4):0-0.[15]MinamifukudaF,NagaiM,TakaiH,etal.DetectionofBovineGroupARotavirusUsingRapidAntigenDetectionKits,RT-PCRandNext-GenerationDNASequencing[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2013,75(12):1651-1655.[16]MartinMNyaga,MathewDEsona,Khuzwayo，CJere,etal.Geneticdiversityofrotavirusgenomesegment6(encodingVP6)inPretoria,SouthAfrica[J].SpringerPlus,2014,3:179-183.[17]BritoWMEDD,MunfordV,Villa?aAM,etal.CharacterizationofmixedinfectionswithdifferentstrainsofbovinerotavirusinanoutbreakofdiarrheaindairyherdsinGoiás,Brazil[J].Braz.j.microbiol,2000,31(2):140-145.[18]吳城,金學(xué)浩,曾廣謐等.福建省牛流行性腹瀉病原—牛輪狀病毒的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1984,15(4):249-256.[19]李鑫,常繼濤,劉海軍,等.我國A群牛輪狀病毒感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,11(9):664-667.[20]ParkSH,SaifLJ,JeongC,etal.MolecularCharacterizationofNovelG5BovineRotavirusStrains[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(11):4101.[21]周芳,岳華,張斌,etal.牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,47(7):1465-1473.[22]EllemanTC,HoynePA,Dyall-SmithML,etal.Nucleotidesequenceofthegeneencodingtheserotype-specificglycoproteinofUKbovinerotavirus[J].NucleicAcidsResearch,1983,11(14):4689.[23]MiyazakiA,KugaK,SuzukiT,etal.GeneticdiversityofgroupArotavirusesassociatedwithrepeatedoutbreaksofdiarrheainafarrow-to-finishfarm:identificationofaporcinerotavirusstrainbearinganovelVP7genotype,G26[J].VeterinaryResearch,2011,42(20):1-10.[24]周芳,岳華,張斌,等.牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-