微生物檢驗技術(shù)操作手冊一、總則

微生物檢驗技術(shù)是現(xiàn)代分析檢測領(lǐng)域的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等多個行業(yè)。本手冊旨在規(guī)范微生物檢驗的操作流程，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過系統(tǒng)化的操作指導(dǎo)，幫助檢驗人員掌握標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗方法，提高工作效率。

二、檢驗前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗室應(yīng)保持潔凈，溫度控制在18℃~26℃，濕度控制在40%~60%。

2.空氣潔凈度應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，定期進(jìn)行滅菌處理。

3.操作臺面應(yīng)使用防靜電材料，并定期消毒。

（二）設(shè)備與器材

1.高壓滅菌鍋：溫度可達(dá)121℃，壓力0.15MPa，滅菌時間15分鐘~20分鐘。

2.超凈工作臺：空氣流速≥30L/min，過濾精度≥0.3μm。

3.酒精燈：用于手部和器材消毒。

4.顯微鏡：放大倍數(shù)可達(dá)1000×，分辨率≥0.2μm。

5.計數(shù)器：用于菌落計數(shù)，建議使用電子計數(shù)器。

（三）培養(yǎng)基與試劑

1.培養(yǎng)基：常用種類包括營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、血瓊脂等。

2.試劑：包括無菌生理鹽水、蛋白胨水、氯化鈉等。

3.儲存條件：培養(yǎng)基需冷藏保存（2℃~8℃），試劑需避光保存。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.食品類樣品：取中心部位，避免表面污染。

2.環(huán)境類樣品：使用無菌棉簽擦拭表面，收集菌液。

3.生物制品：使用無菌吸管吸取液體樣品。

（二）樣品處理

1.洗滌：將樣品置于無菌容器中，加入生理鹽水洗滌。

2.均質(zhì)：固體樣品需使用均質(zhì)器破碎，液體樣品需充分混勻。

3.稀釋：按10倍系列稀釋，制備梯度樣品。

四、培養(yǎng)與計數(shù)

（一）培養(yǎng)方法

1.平板劃線法：將樣品滴加至瓊脂表面，用接種環(huán)劃線分離。

2.傾注法：將樣品與培養(yǎng)基混合，倒入培養(yǎng)皿中。

3.涂布法：將樣品均勻涂布在瓊脂表面。

（二）菌落計數(shù)

1.平板計數(shù)法：選擇30℃~37℃恒溫培養(yǎng)48小時~72小時，計數(shù)菌落數(shù)。

2.菌落形成單位（CFU）計算：CFU=（樣品量×稀釋倍數(shù)）/皿面積。

3.控制誤差：每個樣品需計數(shù)3皿，取平均值。

五、結(jié)果分析與報告

（一）結(jié)果分析

1.菌落形態(tài)：觀察菌落大小、顏色、邊緣形態(tài)等特征。

2.革蘭染色：區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌。

3.生化實驗：檢測糖發(fā)酵、氧化酶等代謝特征。

（二）報告填寫

1.樣品信息：包括樣品名稱、采集日期、檢驗人員等。

2.檢驗結(jié)果：記錄菌落數(shù)、菌種鑒定結(jié)果等。

3.結(jié)論：判斷樣品是否符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

六、注意事項

（一）無菌操作

1.手部消毒：使用75%酒精擦拭手部。

2.器材滅菌：所有器材需高壓滅菌。

3.避免污染：操作過程中避免空氣流動。

（二）安全防護(hù)

1.個人防護(hù)：佩戴手套、口罩、實驗服。

2.廢物處理：廢棄培養(yǎng)基需高壓滅菌后處理。

3.緊急情況：如接觸有毒試劑，立即用大量水沖洗。

七、附錄

（一）培養(yǎng)基配方

1.營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10g、牛肉提取物5g、瓊脂15g，pH7.2~7.4。

2.麥康凱瓊脂：乳糖10g、瓊脂15g，pH7.2~7.4。

（二）常用稀釋液

1.無菌生理鹽水：0.9%氯化鈉溶液，冷藏保存。

2.蛋白胨水：蛋白胨10g、水1000mL，煮沸后冷卻。

繼續(xù)擴(kuò)寫以下文檔內(nèi)容：

六、注意事項

（一）無菌操作

1.手部消毒：操作前需徹底清洗雙手，并使用75%酒精或含氯消毒劑進(jìn)行消毒，確保手部無可見污垢和油脂。消毒后，佩戴無菌手套，避免手部直接接觸樣品和器材。

2.器材滅菌：所有接觸樣品的器材，如接種環(huán)、吸管、培養(yǎng)皿等，必須經(jīng)過高壓滅菌處理。滅菌步驟如下：

(1)將器材放入高壓滅菌鍋內(nèi)，確保無積水。

(2)加熱至121℃，壓力達(dá)到0.15MPa，保持15分鐘~20分鐘。

(3)滅菌后取出，置于無菌環(huán)境中冷卻備用。

3.環(huán)境控制：超凈工作臺在使用前需進(jìn)行紫外線照射消毒30分鐘，并開啟通風(fēng)系統(tǒng)，確?？諝饬魉佟?0L/min。操作過程中，避免人員走動，減少空氣擾動。

（二）安全防護(hù)

1.個人防護(hù)：除佩戴手套、口罩和實驗服外，還需佩戴護(hù)目鏡，防止飛濺物傷害眼睛。對于高風(fēng)險操作，如氣溶膠產(chǎn)生過程，建議佩戴防護(hù)面罩。

2.廢物處理：所有廢棄培養(yǎng)基、器材需經(jīng)過高壓滅菌處理后，方可丟棄。有機(jī)廢物應(yīng)使用專用容器收集，定期進(jìn)行處理。

3.緊急情況：如不慎接觸有毒試劑，立即用大量流動清水沖洗受污染部位，并尋求專業(yè)醫(yī)療幫助。如發(fā)生火災(zāi)，使用滅火器進(jìn)行滅火，避免使用水撲滅有機(jī)溶劑火災(zāi)。

七、附錄

（一）培養(yǎng)基配方

1.營養(yǎng)瓊脂：

-配方：蛋白胨10g、牛肉提取物5g、瓊脂15g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將蛋白胨和牛肉提取物溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)加入瓊脂，攪拌至完全融化。

(3)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(4)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：通用型培養(yǎng)基，適用于多種細(xì)菌培養(yǎng)。

2.麥康凱瓊脂：

-配方：乳糖10g、瓊脂15g、氯化鈉5g、十二烷基硫酸鈉0.3g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將乳糖、氯化鈉和十二烷基硫酸鈉溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)加入瓊脂，攪拌至完全融化。

(3)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(4)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：選擇性培養(yǎng)基，用于腸道菌群分離。

（二）常用稀釋液

1.無菌生理鹽水：

-配方：氯化鈉9g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將氯化鈉溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.4，分裝于滅菌容器中。

(3)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：用于樣品稀釋和洗滌。

2.蛋白胨水：

-配方：蛋白胨10g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將蛋白胨溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(3)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：用于樣品前處理和培養(yǎng)。

（三）菌種鑒定方法

1.革蘭染色：

-步驟：

(1)制備菌涂片，自然干燥。

(2)加熱固定，冷卻后滴加結(jié)晶紫染色1分鐘。

(3)洗去多余染液，加碘液媒染1分鐘。

(4)洗去多余染液，加95%酒精脫色30秒~1分鐘。

(5)洗去多余酒精，加復(fù)染劑沙弗寧染色1分鐘。

(6)洗去多余染液，鏡檢。

-結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

2.生化實驗：

-項目：糖發(fā)酵、氧化酶、尿素酶等。

-步驟：

(1)將菌種接種于相應(yīng)生化管中。

(2)37℃恒溫培養(yǎng)24小時~48小時。

(3)觀察結(jié)果，記錄陽性或陰性反應(yīng)。

-應(yīng)用：通過生化反應(yīng)譜進(jìn)行菌種鑒定。

一、總則

微生物檢驗技術(shù)是現(xiàn)代分析檢測領(lǐng)域的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等多個行業(yè)。本手冊旨在規(guī)范微生物檢驗的操作流程，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過系統(tǒng)化的操作指導(dǎo)，幫助檢驗人員掌握標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗方法，提高工作效率。

二、檢驗前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗室應(yīng)保持潔凈，溫度控制在18℃~26℃，濕度控制在40%~60%。

2.空氣潔凈度應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，定期進(jìn)行滅菌處理。

3.操作臺面應(yīng)使用防靜電材料，并定期消毒。

（二）設(shè)備與器材

1.高壓滅菌鍋：溫度可達(dá)121℃，壓力0.15MPa，滅菌時間15分鐘~20分鐘。

2.超凈工作臺：空氣流速≥30L/min，過濾精度≥0.3μm。

3.酒精燈：用于手部和器材消毒。

4.顯微鏡：放大倍數(shù)可達(dá)1000×，分辨率≥0.2μm。

5.計數(shù)器：用于菌落計數(shù)，建議使用電子計數(shù)器。

（三）培養(yǎng)基與試劑

1.培養(yǎng)基：常用種類包括營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、血瓊脂等。

2.試劑：包括無菌生理鹽水、蛋白胨水、氯化鈉等。

3.儲存條件：培養(yǎng)基需冷藏保存（2℃~8℃），試劑需避光保存。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.食品類樣品：取中心部位，避免表面污染。

2.環(huán)境類樣品：使用無菌棉簽擦拭表面，收集菌液。

3.生物制品：使用無菌吸管吸取液體樣品。

（二）樣品處理

1.洗滌：將樣品置于無菌容器中，加入生理鹽水洗滌。

2.均質(zhì)：固體樣品需使用均質(zhì)器破碎，液體樣品需充分混勻。

3.稀釋：按10倍系列稀釋，制備梯度樣品。

四、培養(yǎng)與計數(shù)

（一）培養(yǎng)方法

1.平板劃線法：將樣品滴加至瓊脂表面，用接種環(huán)劃線分離。

2.傾注法：將樣品與培養(yǎng)基混合，倒入培養(yǎng)皿中。

3.涂布法：將樣品均勻涂布在瓊脂表面。

（二）菌落計數(shù)

1.平板計數(shù)法：選擇30℃~37℃恒溫培養(yǎng)48小時~72小時，計數(shù)菌落數(shù)。

2.菌落形成單位（CFU）計算：CFU=（樣品量×稀釋倍數(shù)）/皿面積。

3.控制誤差：每個樣品需計數(shù)3皿，取平均值。

五、結(jié)果分析與報告

（一）結(jié)果分析

1.菌落形態(tài)：觀察菌落大小、顏色、邊緣形態(tài)等特征。

2.革蘭染色：區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌。

3.生化實驗：檢測糖發(fā)酵、氧化酶等代謝特征。

（二）報告填寫

1.樣品信息：包括樣品名稱、采集日期、檢驗人員等。

2.檢驗結(jié)果：記錄菌落數(shù)、菌種鑒定結(jié)果等。

3.結(jié)論：判斷樣品是否符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

六、注意事項

（一）無菌操作

1.手部消毒：使用75%酒精擦拭手部。

2.器材滅菌：所有器材需高壓滅菌。

3.避免污染：操作過程中避免空氣流動。

（二）安全防護(hù)

1.個人防護(hù)：佩戴手套、口罩、實驗服。

2.廢物處理：廢棄培養(yǎng)基需高壓滅菌后處理。

3.緊急情況：如接觸有毒試劑，立即用大量水沖洗。

七、附錄

（一）培養(yǎng)基配方

1.營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10g、牛肉提取物5g、瓊脂15g，pH7.2~7.4。

2.麥康凱瓊脂：乳糖10g、瓊脂15g，pH7.2~7.4。

（二）常用稀釋液

1.無菌生理鹽水：0.9%氯化鈉溶液，冷藏保存。

2.蛋白胨水：蛋白胨10g、水1000mL，煮沸后冷卻。

繼續(xù)擴(kuò)寫以下文檔內(nèi)容：

六、注意事項

（一）無菌操作

1.手部消毒：操作前需徹底清洗雙手，并使用75%酒精或含氯消毒劑進(jìn)行消毒，確保手部無可見污垢和油脂。消毒后，佩戴無菌手套，避免手部直接接觸樣品和器材。

2.器材滅菌：所有接觸樣品的器材，如接種環(huán)、吸管、培養(yǎng)皿等，必須經(jīng)過高壓滅菌處理。滅菌步驟如下：

(1)將器材放入高壓滅菌鍋內(nèi)，確保無積水。

(2)加熱至121℃，壓力達(dá)到0.15MPa，保持15分鐘~20分鐘。

(3)滅菌后取出，置于無菌環(huán)境中冷卻備用。

3.環(huán)境控制：超凈工作臺在使用前需進(jìn)行紫外線照射消毒30分鐘，并開啟通風(fēng)系統(tǒng)，確保空氣流速≥30L/min。操作過程中，避免人員走動，減少空氣擾動。

（二）安全防護(hù)

1.個人防護(hù)：除佩戴手套、口罩和實驗服外，還需佩戴護(hù)目鏡，防止飛濺物傷害眼睛。對于高風(fēng)險操作，如氣溶膠產(chǎn)生過程，建議佩戴防護(hù)面罩。

2.廢物處理：所有廢棄培養(yǎng)基、器材需經(jīng)過高壓滅菌處理后，方可丟棄。有機(jī)廢物應(yīng)使用專用容器收集，定期進(jìn)行處理。

3.緊急情況：如不慎接觸有毒試劑，立即用大量流動清水沖洗受污染部位，并尋求專業(yè)醫(yī)療幫助。如發(fā)生火災(zāi)，使用滅火器進(jìn)行滅火，避免使用水撲滅有機(jī)溶劑火災(zāi)。

七、附錄

（一）培養(yǎng)基配方

1.營養(yǎng)瓊脂：

-配方：蛋白胨10g、牛肉提取物5g、瓊脂15g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將蛋白胨和牛肉提取物溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)加入瓊脂，攪拌至完全融化。

(3)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(4)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：通用型培養(yǎng)基，適用于多種細(xì)菌培養(yǎng)。

2.麥康凱瓊脂：

-配方：乳糖10g、瓊脂15g、氯化鈉5g、十二烷基硫酸鈉0.3g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將乳糖、氯化鈉和十二烷基硫酸鈉溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)加入瓊脂，攪拌至完全融化。

(3)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(4)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：選擇性培養(yǎng)基，用于腸道菌群分離。

（二）常用稀釋液

1.無菌生理鹽水：

-配方：氯化鈉9g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將氯化鈉溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.4，分裝于滅菌容器中。

(3)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：用于樣品稀釋和洗滌。

2.蛋白胨水：

-配方：蛋白胨10g，加水1000mL。

-制作步驟：

(1)將蛋白胨溶解于水中，加熱至完全溶解。

(2)調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4，分裝于滅菌容器中。

(3)高壓滅菌121℃，15分鐘~20分鐘。

-應(yīng)用：用于樣品前處理和培養(yǎng)。

（三）菌種鑒定方法

1.革