ADDINCNKISM.UserStyle紫花地丁細(xì)菌性斑點病的病原菌鑒定摘要：紫花地丁細(xì)菌性斑點病是2019年進(jìn)行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)的一種病害，為了確定該病的病原菌，為病害防治和規(guī)范化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。通過病原菌的培養(yǎng)特性、煙草過敏性壞死反應(yīng)、生理生化測定和致病性實驗初步確定病原菌的種類。結(jié)果表明：病原菌在NA培養(yǎng)基上生長較慢，直徑2-3mm，圓形，透明，蠟狀，扁平，邊緣嚙齒狀，菌落產(chǎn)生黃綠色色素；革蘭氏染色反應(yīng)為陰性；具有煙草過敏性反應(yīng)；7%鹽濃度下可生長，41℃下可生長，可以利用葡萄糖、木糖和甘露糖，在PH為5.7和6.8的培養(yǎng)基上可以生長，代謝產(chǎn)生色氨酸酶、酪氨酸酶和過氧化氫酶，可以利用檸檬酸鹽，為好氧型細(xì)菌；致病性試驗表明具有致病性。由實驗可知zhdd為紫花地丁細(xì)菌性葉斑病的病原菌。關(guān)鍵詞：紫花地?。徊≡?；生理生化；致病性Abstract:Bacterialspotdiseaseofviolayedoensisisakindofdiseasefoundin2019.Inordertodeterminethepathogenofthedisease,andprovidesatheoreticalbasisfordiseasecontrolandstandardizedproduction.Throughtheculturecharacteristicsofpathogens,allergicnecrosisreaction,physiologicalandbiochemicaltestsandpathogenicityexperimentspreliminarydeterminethetypesofpathogens.TheresultsshowedthatthepathogengrewslowlyontheNAmedium,withadiameterof2-3mm,round,transparent,waxy,flat,margindentate,colonyproducingyellow-greenpigment;Gram'stainreactionwasnegative;hadtobaccoallergicreaction;couldgrowat7%saltconcentration,couldgrowat41℃,coulduseglucose,xyloseandmannose,couldgrowonmediumwithPHof5.7and6.8,Producetryptophanase,tyrosinaseandcatalasefrommetabolize,andcouldusecitrate,Isakindofaerobicbacteria;pathogenicitytestshowedpathogenicity.Accordingtotheexperiment,zhddwasthepathogenofbacterialleafspotofviolayedoensis.Keywords:Violayedoensis;Pathogen;PhysiologyandBiochemistry;Pathogenicity紫花地?。╒iolayedoensisMakino）是堇菜科（Violaceae）的干燥全草[1]。又稱地丁，明末清初，李中立ADDINCNKISM.Ref.{6768D0C083904fc4B029475F2151DC5B}《本草原始·草部下》地丁條云：“花開有紫、白二種。根直如釘，入藥用紫花者，故俗呼為紫花地丁”[2]。以全草入藥，性寒味微苦，有清熱解毒的功效[3]。目前，已從紫花地丁中分離得到70多種化合物，研究表明，紫花地丁在抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤方面有廣泛的作用[4]。所含黃酮苷類及有機(jī)酸對金色葡萄球菌、豬巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌等都有較強(qiáng)的抑菌作用[5]，素有“解毒草”之稱。主要分布在我國除青海、西藏以外的地方[6]。紫花地丁喜陽，在濕潤或寒冷陰郁的天氣都能生長，對土質(zhì)要求不高，有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，能自播繁殖[7]。紫花地丁花色艷麗，花期長[8]，效益好，繁殖能力強(qiáng)[9]，在園林綠地和景觀綠化中能發(fā)揮強(qiáng)大的作用[10]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)對紫花地丁的病害記載。通過本實驗，目的是確定致使紫花地丁發(fā)生細(xì)菌性斑點病的病原菌。1材料與方法1.1病害調(diào)查圖1圖1紫花地丁癥狀物1.2病原菌分離和純化[11]將實驗用具置于高壓蒸汽滅菌中以115℃的條件滅菌30min備用。選擇有病斑的葉片，剪取病斑后加入0.1%的升汞將病斑浸沒消毒2min，然后用滅菌水沖洗3次，再用玻璃棒將病斑搗碎，用接種環(huán)沾取組織液，用平板劃線的方法將其接種在NA培養(yǎng)基上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察菌落的生長情況，挑取分離得到的單菌落用平板劃線的方法接種在NA培養(yǎng)基上，放在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h進(jìn)行純化，之后在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3病原菌的形態(tài)鑒定將保存的細(xì)菌重新活化后接種在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，24h后對單菌落的形態(tài)、大小、顏色和質(zhì)地等進(jìn)行觀察。同時挑取活化的單菌落放在干凈的載玻片上，滴加滅菌水將細(xì)菌涂成薄層，使細(xì)菌固定在載玻片上，滴加結(jié)晶紫初染1min，用蒸餾水沖洗后滴加碘液媒染1min，用蒸餾水沖洗后，再用95％的酒精脫色30s，最后滴加番紅復(fù)染1min，晾干后放在油鏡下觀察其顏色及形態(tài)[12]。1.4煙草過敏性反應(yīng)采集煙草葉片插在三角瓶中，加入蒸餾水，放在25℃的光照培養(yǎng)箱中。將保存的細(xì)菌重新接種在NA培養(yǎng)基上活化24h后，加入適量的滅菌水配置成細(xì)菌懸浮液，吸取菌懸液注射在煙草葉片的細(xì)胞間，以無菌水為對照，置于25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2h觀察記錄一次發(fā)病情況，直至48h[13]。1.5生理生化鑒定方法[14-15]生理生化實驗主要有：耐鹽性實驗、糖醇發(fā)酵類實驗、生長PH的測定、吲哚實驗、檸檬酸鹽的利用實驗、明膠液化實驗、酪朊水解實驗、酪氨酸水解實驗、V-P測定實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、卵磷脂酶實驗、苯丙氨酸脫氨酶實驗、甲基紅實驗、厭氧實驗、生長溫度測定等試驗，實驗方法主要參照《植物病害研究方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》。1.6紫花地丁上致病性測定[16-17]選擇新鮮健康的紫花地丁植株，放在25℃的光照培養(yǎng)箱中備用。將菌種重新接種在NA培養(yǎng)基上活化24h后加入適當(dāng)?shù)臏缇渲贸杉?xì)菌懸浮液，選擇未感病的紫花地丁植株作供試材料。針刺接種：將昆蟲針在酒精燈上灼燒滅菌后沾取菌懸液在紫花地丁上以針刺的方法接種，對照沾取滅菌水針刺在紫花地丁的葉片上。噴霧接種：將菌懸液裝入噴壺中噴灑在紫花地丁的葉片上，對照噴灑滅菌水在葉片上。將處理和對照放在保溫保濕的環(huán)境中培養(yǎng)，48h后揭開箱子觀察記錄植株表現(xiàn)的癥狀。2結(jié)果與分析2.1病原細(xì)菌分離和純化經(jīng)過分離共獲得了1株細(xì)菌，記為zhdd。菌落菌落在培養(yǎng)基上生長較慢，直徑2-3mm，圓形，透明，蠟狀，扁平，邊緣嚙齒狀，菌落產(chǎn)生黃綠色色素。（如圖2）2.2病原菌的革蘭氏染色反應(yīng)將活化24h的單菌落用革蘭氏染色劑經(jīng)過初染、媒染、脫色和復(fù)染四個步驟后，放在油鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)zhdd為紅色桿狀的細(xì)菌，所以zhdd是革蘭氏陰性菌。（見圖3）圖2zhdd單菌落圖圖2zhdd單菌落圖圖3zhdd革蘭氏染色反應(yīng)圖3zhdd革蘭氏染色反應(yīng)圖2zhdd單菌落圖2.3煙草過敏性反應(yīng)將zhdd菌懸液接種在煙草葉片上，放在光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，在第6h即出現(xiàn)較小的過敏性壞死斑點，斑點呈褐色，并在之后的觀察中逐漸擴(kuò)大，對照的煙草沒有在葉片上出現(xiàn)任何斑點（如圖4）。圖4煙草過敏性壞死圖圖4煙草過敏性壞死圖2.4生理生化測定zhdd的各項生理生化測定結(jié)果如下。（如表1）耐鹽性實驗中，在鹽濃度為2％、5％和7％時為陽性，說明細(xì)菌可以在2％、5％和7％的鹽環(huán)境下生長；在10％的耐鹽性實驗中陰性，說明細(xì)菌不能在10％的鹽環(huán)境下生長。糖醇發(fā)酵類實驗均為陽性，說明細(xì)菌在進(jìn)行生命活動時可以利用葡萄糖、木糖和甘露糖。生長PH值測定在PH為5.7和6.8的培養(yǎng)基中均為陽性，說明細(xì)菌在PH為5.7和6.8的環(huán)境中可以正常生長。吲哚實驗為陽性說明細(xì)菌代謝產(chǎn)生色氨酸酶，可以分解蛋白胨中的色氨酸。檸檬酸鹽利用實驗為陽性說明細(xì)菌可以將檸檬酸鈉作為碳源被利用。酪氨酸水解實驗為陽性說明細(xì)菌在進(jìn)行生命活動時可以產(chǎn)生酪氨酸水解酶。V-P測定為陽性說明細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。接觸酶實驗為陽性說明細(xì)菌可以產(chǎn)生過氧化氫酶。淀粉水解為陰性說明細(xì)菌不能產(chǎn)生分解大分子淀粉的水解酶。卵磷脂酶實驗中，細(xì)菌不能正常生長說明細(xì)菌不能利用該培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)。苯丙氨酸脫氨酶實驗為陽性說明細(xì)菌可以分解氨基酸產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。甲基紅實驗為陽性說明細(xì)菌可以分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸。厭氧實驗為陽性說明中細(xì)菌僅能在培養(yǎng)基表面生長。生長溫度實驗為陽性說明細(xì)菌在41℃下可以進(jìn)行正常的生命活動。表1.紫花地丁生理生化表測定項目實驗組對照組耐鹽性實驗（2％）＋－耐鹽性實驗（5％）＋－耐鹽性實驗（7％）＋－耐鹽性實驗（10％）－－糖醇發(fā)酵類實驗（葡萄糖）＋－糖醇發(fā)酵類實驗（木糖）＋－糖醇發(fā)酵類實驗（甘露糖）＋－生長PH測定（5.7）＋－生長PH測定（6.8）＋－吲哚實驗＋－檸檬酸鹽利用實驗＋－酪朊水解實驗＋－酪氨酸水解實驗＋－V-P測定＋－接觸酶實驗＋－淀粉水解實驗－－卵磷脂酶實驗細(xì)菌不生長苯丙氨酸脫氨酶實驗＋－甲基紅實驗＋－厭氧實驗＋生長溫度測定（41℃）＋注：“＋”表示反應(yīng)為陽性，“－”表示反應(yīng)為陰性。卵磷脂酶實驗中細(xì)菌不能在培養(yǎng)基上生長。2.5紫花地丁上的致病性測定圖5.紫花地丁針刺處理圖將zhdd的菌懸液接種后圖5.紫花地丁針刺處理圖3結(jié)論與討論從紫花地丁的感病植株上經(jīng)過分離和純化共得到一種細(xì)菌，經(jīng)過細(xì)菌的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)zhdd是紅色桿狀的革蘭氏陰性菌。經(jīng)過zhdd的煙草過敏性壞死反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)煙草葉片上出現(xiàn)病斑，說明zhdd對煙草有致病性。將zhdd接種在新鮮健康的紫花地丁上，以針刺接種的紫花地丁在葉片上出現(xiàn)水漬狀淡褐色病斑，有發(fā)病的癥狀。實驗結(jié)果表明zhdd對紫花地丁有致病性。為了確定紫花地丁侵染性病害的病原物，應(yīng)該進(jìn)行完整的柯赫氏法則，即對致病性測定中以針刺處理的紫花地丁感病株再次進(jìn)行分離和純化，觀察其特征與原病原生物是否相同[18]。對于病原菌的鑒定除了形態(tài)學(xué)和生理生化測定以外，還需要進(jìn)行分子生物學(xué)的鑒定，例如建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的16S-rDNA基因的的直接測序法，是細(xì)菌分類鑒定的主要方法之一，可以通過比較細(xì)菌的16S-rDNA基因序列間的同源性，構(gòu)建細(xì)菌屬間和種間的系統(tǒng)發(fā)育樹來探索他們的進(jìn)化關(guān)系[19]。參考文獻(xiàn)：[1]中國藥典.一部[S].2015:337[2]周馳,張啟偉,常章富.紫花地丁的本草考證[J].中國中藥雜志,2010,35(22):3086-3088.[3]毛曉霞,苗光新,于海龍,等.紫花地丁的研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,27（03）:302-305.[4]李永生,何希瑞,楊燕,等.紫花地丁化學(xué)成分與藥理活性研究新進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(04):313-318.[5]張兵鋒.紫花地丁的研究進(jìn)展[J].宜春學(xué)院學(xué)報,2008(02):88-90.[6]孫彬,屈愛桃.紫花地丁研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2008(11):50-51.[7]許小靜.紫花地丁的栽培技術(shù)與推廣應(yīng)用[J].北京農(nóng)業(yè),2015(20):95-96.[16]程家玉,張晶.紫花地丁人工栽培豐產(chǎn)技術(shù)及推廣應(yīng)用[J].中國林副特產(chǎn)2007,(04):73-79.[9]丁百林.果園生草可選用紫花地丁[J].西北園藝(果樹),2013(03):51.[10]趙金鵬,張亞菲,張玲.野生紫花地丁的人工栽培技術(shù)研究及在高校校園利用價值評價[J].南方農(nóng)業(yè),2019,13(20):45-47.[11]余磊,秦西云,杜靜,等.云南煙草上1種新的細(xì)菌性病害病原鑒定[J].植物病理學(xué)報,2009,39(03):243-248.[12]嚴(yán)玉寧,何紅,葉藝俊,等.香蕉葉鞘腐敗病病原鑒定[J].植物病理學(xué)報,2011,41(02):124-130.[13]呂祝邦,李敏權(quán),惠娜娜,等.甘肅省定西市當(dāng)歸“水爛病”病原鑒定及致病性測[J].植物保護(hù),2013,39(02):45-49.[14]方中達(dá).植病研究方法（第三版）[S].中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.12

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