I

DB2102/T0083—2023

小新月菱形藻藻種提純復(fù)壯技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖用小新月菱形藻NitzschiaClosterium藻種（以下簡稱藻種）提純復(fù)壯的術(shù)語

和定義、水質(zhì)和設(shè)施設(shè)備條件、藻種培養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基的配制、消毒除菌、固體培養(yǎng)基藻種培養(yǎng)及保

存、細(xì)胞提純復(fù)壯及擴(kuò)繁等內(nèi)容。

本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用小新月菱形藻等低溫硅藻的一級藻種提純復(fù)壯。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB11607-1989漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

SC/T2047-2006水產(chǎn)養(yǎng)殖用海洋微藻保種操作技術(shù)規(guī)范

DB21/T2777-2017海洋浮游微藻分離和篩選技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

藻種細(xì)胞提純復(fù)壯purificationandrejuvenationofalgaecells

通過分離技術(shù)，將混雜或衰退藻種中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)以

恢復(fù)原藻種的典型性狀。

3.2

固體培養(yǎng)基solidmedium

在培養(yǎng)液中加入適宜凝固劑，滅菌處理后凝固制成平板或斜面，用于微藻藻種的分離、純化、復(fù)壯、

保存培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

3.3

藻種克隆algaecloning

由同一個藻種細(xì)胞分裂繁殖而形成的、具有相同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞系。

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DB2102/T0083—2023

4水質(zhì)和設(shè)施設(shè)備條件

4.1水質(zhì)條件

所用海水應(yīng)經(jīng)沉淀、過濾處理，水質(zhì)應(yīng)符合GB11607-1989的規(guī)定。

4.2設(shè)施設(shè)備

4.2.1清洗設(shè)備

水槽、試管刷和大瓶刷。

4.2.2消毒設(shè)備

紫外燈、烘箱、高壓滅菌鍋、電陶爐、煤氣或液化氣灶具。

4.2.3操作觀察設(shè)備

顯微鏡、超凈工作臺、電子天平、配制營養(yǎng)液所需化學(xué)試劑（分析純及以上等級）、量程為100μl

和1ml移液器及配套槍頭，用于培養(yǎng)的一次性無菌培養(yǎng)皿（直徑90mm～100mm）和20ml～40ml玻璃試

管（配有帶砂芯乳膠塞），試管架、20ml一次性無菌注射器及0.22μm孔徑無菌針筒式濾膜過濾器。

4.2.4培養(yǎng)保種設(shè)備

光照培養(yǎng)架、低溫展示柜、恒溫光照培養(yǎng)箱。

5藻種培養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基的配制

5.1營養(yǎng)液配制

5.1.1康威培養(yǎng)基（以下簡稱A液）、康威培養(yǎng)基—微量元素溶液（以下簡稱B液）和康威培養(yǎng)基—

硅酸鈉溶液的成分參照DB21/T2777-2017附錄A，康威營養(yǎng)液由A液和B液組成，具體如下：

a)配制A液時，將DB21/T2777-2017表A.1.1中試劑加入純水中，加熱至試劑完全溶解；

b)配制B液時，將DB21/T2777-2017表A.1.2中試劑加入純水中，滴加10%鹽酸搖勻，至試劑

完全溶解，液體澄清；

c)將B液全部倒入A液中，放置12h以上，即成為康威營養(yǎng)液。

5.1.2藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方見附錄A。

5.2固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配制

藻種固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配方見附錄B。

5.3藻種擴(kuò)繁用培養(yǎng)液配制

滅菌海水冷卻后，按照1000：1體積比分別加入滅菌的康威營養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸鈉溶液和尿

素溶液后搖勻。

5.4固體培養(yǎng)基配制

向100ml海水中加入0.8g～1g瓊脂粉，加熱至溶解制成瓊脂海水基質(zhì)，高壓滅菌后置超凈工作臺

中，于室溫下冷卻至45℃～55℃時按照1000：1體積比分別添加滅菌的康威營養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸

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鈉溶液、尿素溶液和抗生素溶液后搖勻，立即向一次性滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)倒入約20ml，使培養(yǎng)基鋪滿每個

培養(yǎng)皿底部，靜止放置至培養(yǎng)基凝固后，倒置于超凈臺中備用。

6消毒除菌

6.1藻種擴(kuò)繁用海水滅菌

按照SC/T2047-2006中5.1.1規(guī)定的微藻分離、保存用海水的消毒方法執(zhí)行。

6.2營養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基滅菌

康威營養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸鈉溶液以及瓊脂粉海水基質(zhì)應(yīng)采用121℃高壓蒸汽滅菌15min，尿

素溶液應(yīng)采用0.22μm孔徑無菌針筒式濾膜過濾器過濾除菌。

6.3器具滅菌

塑料器具應(yīng)采用121℃高壓蒸汽滅菌15min，滅菌后置于80℃恒溫箱烘干；玻璃器具應(yīng)用135℃恒溫

3h滅菌。

7固體培養(yǎng)上藻種培養(yǎng)與保存

7.1接種

7.1.1藻種活化

藻種（細(xì)胞濃度為8×106cell/ml～1.2×107cell/ml）按照1：1000比例接種藻種擴(kuò)繁用培養(yǎng)液，

環(huán)境溫度17℃～20℃，光照度3000Lux～6000Lux下培養(yǎng)2d。

7.1.2藻種的接種

用微量移液器向固體培養(yǎng)基上添加100μL滅菌海水，取活化藻種10μL～20μL放入固體培養(yǎng)基中，

使滅菌海水與藻種混合。

向固體培養(yǎng)基上加入4顆～6顆直徑4mm左右的玻璃珠，蓋好培養(yǎng)皿，水平搖晃培養(yǎng)皿，使玻璃珠在

培養(yǎng)基上隨機(jī)滾動，將藻種和海水均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。

2h～4h后，固體培養(yǎng)基上液體被基本吸收后，用封口膜纏繞培養(yǎng)皿側(cè)面，將培養(yǎng)皿上下結(jié)合部空

間封閉。

7.2藻種克隆的培養(yǎng)

適宜條件下（見7.1.1）培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的藻種細(xì)胞，25d～30d后，在固體培養(yǎng)基上長出1mm

以上的藻種克隆。

7.3藻種克隆的度夏保種

當(dāng)固體培養(yǎng)基上長出大于1mm的藻種克隆時，應(yīng)將培養(yǎng)皿放置于4℃～6℃透光低溫展示柜保存，保

存期可達(dá)5個月～17個月。

8細(xì)胞提純復(fù)壯及擴(kuò)繁

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8.1固體培養(yǎng)基上藻種細(xì)胞的提純復(fù)壯

秋季，室溫下降至20℃時，對固體培養(yǎng)基上藻種細(xì)胞進(jìn)行提純復(fù)壯篩選：

——將固體培養(yǎng)基置于顯微鏡下觀察各個藻種克隆，挑選細(xì)胞形狀飽滿、細(xì)胞數(shù)量多、色素均勻且

沒有細(xì)菌混雜的藻種克??；

——用滅菌牙簽將選擇好的藻種克隆挑起，放入盛有10ml擴(kuò)繁營養(yǎng)液的試管中，于適宜條件下（見

7.1.1）培養(yǎng)，同時進(jìn)行多個藻種克隆的篩選培養(yǎng)，一個藻種克隆培養(yǎng)一管，不同藻種克隆間

不應(yīng)相互混淆。

8.2提純復(fù)壯藻種的擴(kuò)繁

當(dāng)試管內(nèi)的藻細(xì)胞生長密度超過3×106cell/ml時，比較不同試管中克隆細(xì)胞的密度，挑選細(xì)胞密

度較大的克隆群體，倒入盛有400ml擴(kuò)繁營養(yǎng)液的500ml三角燒瓶中,適宜條件下（見7.1.1）擴(kuò)繁培養(yǎng)。

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AA

附錄A

（資料性）

藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方

A.1藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方見表A.1

表A.1藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方

成分用量

尿素3.0g

蒸餾水100ml

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BB

附錄B

（資料性）

藻種固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配方

B.1藻種固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配方

B.1.1藻種固體培養(yǎng)基用青鏈霉素溶液配方見表B.1，所用抗生素均為試劑級。

表B.1藻種固體培養(yǎng)基用青鏈霉素溶液配方

成分用量