ICS65.020.01

CCSB05

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T3279—2023

苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌鑒定方法

Identificationoffusariumacuminatumofalfalfarootrot

2023-12-29發(fā)布2024-01-29實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T3279—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)

鄉(xiāng)村振興研究中心。

本文件主要起草人：史志丹、孫紅霞、丁海君、房永雨、楊永青、郭呈宇、伊風(fēng)艷、燕夢嬌、郭晨、

孫林、劉思博、張英、劉亞東、李國強。

I

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苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌鑒定方法

1范圍

本文件規(guī)定了苜蓿銳頂鐮刀菌根腐病鑒定的主要儀器與用具、主要試劑與材料、實驗室檢測、結(jié)果

判定。

本文件適用于苜蓿銳頂鐮刀菌根腐病的室內(nèi)鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

銳頂鐮刀菌根腐病fusariumacuminatumrootrot

由銳頂鐮刀菌（Fusariumacuminatum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近會出現(xiàn)

褐色或暗褐色的壞死斑，根系毛根減少，部分葉子出現(xiàn)黃葉，發(fā)病嚴重時葉片枯黃，植株根部的中柱腐

爛霉變，并發(fā)生壞死，根莖出現(xiàn)中空，側(cè)根出現(xiàn)大量腐爛壞死，分枝減少。

4主要儀器與用具

光學(xué)顯微鏡、搖床、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高速冷凍離心機、PCR儀、培養(yǎng)皿、酒精燈、血球計數(shù)

板、解剖刀、接種針、移液器、槍頭、離心管。

5主要試劑與材料

試劑

5.1.1次氯酸鈉。

5.1.2無水乙醇。

5.1.3硫酸鏈霉素(500mg/mL)。

5.1.4真菌基因組提取試劑盒。

5.1.5PCRSuperMix。

5.1.6凝膠電泳試劑：瓊脂糖，TAE，LoadingBuffer，DL2000DNAMarker。

培養(yǎng)基

5.2.1水瓊脂培養(yǎng)基（WA:WaterAgar）：瓊脂粉15g，加蒸餾水定容至1000mL，121℃高壓濕熱

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滅菌20min。

5.2.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA:PotatoDextroseAgar）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂

粉15g，加蒸餾水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。

5.2.3馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB:PotatoDextroseBroth）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加

蒸餾水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。

5.2.4綠豆瓊脂培養(yǎng)基（MBA:MungBeanAgar）：綠豆粉60g，瓊脂粉15g，加蒸餾水定容至1000

mL，121℃高壓滅菌20min。

6實驗室檢測

病原菌的分離和純化

6.1.1病原菌的分離

從苜蓿田采集患有根腐病的典型病株。用水清洗樣品表面的砂礫和土壤，從根部病健交界部位切成

約0.5cm×0.5cm的小組織塊，用75%酒精和1%次氯酸鈉分別處理3min和5min，無菌水清洗5次。把表

面消毒的發(fā)病組織放在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，見附錄A中的圖A.1。

6.1.2病原菌的純化

待PDA培養(yǎng)基長出菌落后取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接3次后再進行單孢分離獲得純化菌株用于后續(xù)試驗，

見附錄A中的圖A.1。用30%滅菌甘油將分離鑒定后的菌株于-80℃保存，對不需長期保存的菌株及時滅

活處理。感染苜蓿根腐病的樣品保存于4℃冰箱中，以備復(fù)核。

菌落培養(yǎng)特性和病菌形態(tài)特征鑒定

6.2.1銳頂鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基生長形態(tài)

銳頂鐮刀菌在PDA平板上菌絲呈粉紅色絨毛狀，生長到后期，顏色逐漸加深變成桃紅色，菌絲有隔

且具分支，見附錄A的圖A.2。

6.2.2銳頂鐮刀菌分生孢子

銳頂鐮刀菌小型分生孢子數(shù)量較少，呈長橢圓形，0～1個分隔，大小為6.8μm～14.0μm×3.5μm～

4.9μm。大型分生孢子數(shù)量較多，彎刀型，中間較寬、較胖，兩端稍尖并稍彎曲，2～5個分隔，大小為

18.2μm～38.5μm×3.9μm～6.3μm，見附錄A中的圖A.3。

分子鑒定

6.3.1病原菌基因組DNA的提取

病原菌菌株在25℃下PDA平板上生長5～7d后，轉(zhuǎn)接至裝有50mL的PDB培養(yǎng)基靜置生長3d，離心

收集菌絲，液氮下研磨，使用真菌基因組提取試劑盒提取病原菌DNA后進行分子生物學(xué)鑒定。

6.3.2PCR檢測鑒定

6.3.2.1引物

采用rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTG

ATATGC-3')和RPB2基因通用引物fRPB2-7Cf(5'-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3')和fRPB2-11aR(5'-G

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CRTGGATCTTRTCRTCSACC-3'）以及鐮刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5'-ATGCARGGYATYGGHCARC

THGT-3')和Fusphoo-r(5'-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3')進行PCR擴增。

6.3.2.2PCR結(jié)果

PCR獲得ITS、RPB2、PHO序列大小分別為530bp左右和850bp左右，以及為500bp左右的目的片段，

見附錄A中的圖A.4。送至測序公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫比對。

6.3.2.3聚類分析

聚類分析結(jié)果表明，以ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的三線鐮刀菌

(JX989827.1)、燕麥鐮刀菌（KX058547.1）、銳頂鐮刀菌（MT557673.1）聚為同一類，見附錄A中的圖

A.5。以fRPB2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銳頂鐮刀菌(HM068335.1)聚為同一類，

見附錄A中的圖A.6。以PHO序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銳頂鐮刀菌(KJ200247.1)

聚于同一類，見附錄A中的圖A.7。

致病性測定

6.4.1分生孢子懸浮液制備

選取形態(tài)特征與F.acuminatum形態(tài)特征相符且PCR檢測鑒定陽性的分離菌株，在綠豆培養(yǎng)基上培養(yǎng)

獲得分生孢子，用無菌水配置成濃度為106個/mL分生孢子懸浮液。

6.4.2病原菌回接

消毒后的苜蓿種子播種于滅菌營養(yǎng)土中，播種40d后，用分生孢子液接種的大米接種苜蓿根部。采

用針刺法接種苜蓿根部，在傷口處接種10粒左右大米，期間要保持土壤濕潤。在接種后14d～20d。對

接種發(fā)病的苜蓿根部再做病原菌分離、培養(yǎng)，觀察是否與F.acuminatum的形態(tài)特征一致，并對分離菌

進行PCR檢測。

7結(jié)果判定

符合銳頂鐮刀菌根腐病為害癥狀，菌落培養(yǎng)特性和病菌形態(tài)學(xué)特征與銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）

相符，PCR擴增鑒定為F.acuminatum，且苜蓿致病性測試的分離物，鑒定定為F.acuminatum。

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A

A

附錄A

（資料性）

苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程

苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程見圖A.1~圖A.7。

取樣清洗分離涂板

搖菌鏡檢再次分離

提取測序比對

圖A.1苜蓿根腐病病原菌的分離純化

AB

注：A:銳頂鐮刀菌在PDA平板正面，B：銳頂鐮刀菌在PDA平板背面。

圖A.2PDA培養(yǎng)基銳頂鐮刀菌生長形態(tài)

4

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ABC

注：A:小型分生孢子B:大型分生孢子C:菌絲。

圖A.3銳頂鐮刀菌孢子與菌絲形態(tài)

A

750bp

500bp

B

1000b

750bp

C

500bp

250bp

注：A:ITS引物PCR電泳圖，M為DL2000DNA，2泳道為CK,13-18泳道為檢測菌株，

B:RBP2引物PCR電泳圖，M為DL2000DNA，21泳道為CK,2-20泳道為檢測菌株，

C:PHO引物PC