ICS65.020.30CCSB4312TechnicalregulationsforeIDB12/T1148—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委提出并歸口。本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。DB12/T1148—20222綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了綿羊胚胎移植技術(shù)中實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備、供體羊沖胚、檢胚及胚胎質(zhì)量鑒定、受體羊胚胎移植等技術(shù)要求。本文件適用于綿羊胚胎移植。2規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T816肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)DB12/T137肉用綿羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1胚胎移植embryotransfer將一頭母畜（供體）的受精卵取出，移植到另一頭母畜（受體）體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育至分娩產(chǎn)仔。3.2供體羊donorsheep提供胚胎的母羊。3.3受體羊receptorsheep接受胚胎的母羊。4實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備4.1試劑、藥品參見附錄A、附錄B4.2設(shè)、耗材參見附錄C。4.3胚胎室要求4.3.1地面進(jìn)行硬化、防滑處理，門窗密封、嚴(yán)緊、無塵。4.3.2室內(nèi)頂部安裝紫外線燈。DB12/T1148—202234.3.3室內(nèi)環(huán)境溫度保持在20℃~25℃,避免陽光直射。5供體羊沖胚5.1供體羊選擇5.1.1供體羊譜系清楚、遺傳穩(wěn)定，品種優(yōu)良、生產(chǎn)性能好；5.1.2體質(zhì)健壯，年齡在1歲～4歲；5.2供體羊飼養(yǎng)管理保持穩(wěn)定的飼養(yǎng)環(huán)境，避免應(yīng)激，飼養(yǎng)符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。5.3同期發(fā)情在母羊發(fā)情周期的任意一天放置孕酮栓，具體參見附錄D。5.4超數(shù)排卵母羊放置孕酮栓后第10天開始注射促卵泡素（FSH2次/天，連續(xù)4天，具體見附錄D。5.5發(fā)情鑒定取出陰道栓后每隔8小時(shí)用公羊試情1次，以母羊站立接受公羊爬跨為母羊發(fā)情標(biāo)準(zhǔn)。5.6人工授精5.6.1母羊判定發(fā)情后8小時(shí)進(jìn)行人工輸精，輸精兩次，間隔8小時(shí)～12小時(shí)。5.6.2輸精量0.2ml/只.次～0.4ml/只.次，每次輸精有效精子數(shù)不少于3.0×107。5.7胚胎收集5.7.1胚胎收集時(shí)間，參見附錄D。5.7.2術(shù)前準(zhǔn)備供體羊在手術(shù)前12小時(shí)空腹、禁水。5.7.3供體羊手術(shù)5.7.3.1乳房前，腹部備皮，范圍20cm×20cm。備皮后用5%碘酊棉球消毒，再用75%酒精棉球脫碘。5.7.3.2供體羊仰臥保定于手術(shù)床上，肌肉注射麻醉，麻醉后,使手術(shù)床與地面成45℃。5.7.3.3在乳房前2cm～3cm，腹中線側(cè)面做5cm的縱向切口，依次切開皮膚、肌肉和腹膜。5.7.3.4從切口處取出子宮角，記錄卵巢黃體的數(shù)量。5.7.4沖胚5.7.4.1在子宮角大彎處用止血鉗尖扎孔，將沖胚管插入，用注射器充氣使沖卵管的氣囊封閉一側(cè)子宮角，沖卵管的另一端接90㎜平皿。5.7.4.2沖卵針從子宮角末端向子宮角大彎方向刺入，使沖卵針、子宮角和沖卵管形成通路。5.7.4.3用注射器吸30ml沖胚液注入沖卵針沖洗子宮角，將液體經(jīng)過沖卵管回收至90㎜培養(yǎng)皿中。DB12/T1148—202245.7.5創(chuàng)口縫合5.7.5.1沖胚完成后，將子宮送回腹腔。5.7.5.2縫合創(chuàng)口，肌肉腹膜連續(xù)縫合、皮膚結(jié)節(jié)縫合，皮膚前創(chuàng)口撒消炎粉。5.7.5.3縫合完成后進(jìn)行創(chuàng)面整理，碘酊消毒，注射抗生素和解麻藥物，解除保定。6檢胚及胚胎質(zhì)量鑒定6.1檢胚6.1.1在35mm的培養(yǎng)皿中注入胚胎保存液，放在恒溫臺(tái)上預(yù)熱。6.1.2將收集到的沖胚液移至實(shí)體顯微鏡下，檢出胚胎，移入35mm的培養(yǎng)皿中。6.1.3每個(gè)平皿在顯微鏡下重復(fù)檢查3次，檢出平皿中所有胚胎。6.2胚胎質(zhì)量鑒定6.2.1胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量鑒定，參見附錄E。6.2.2鑒定后的胚胎做好記錄，包括羊號(hào)、胚胎發(fā)育階段、質(zhì)量等信息，見附錄F。6.3胚胎裝管6.3.1在體視顯微鏡下，將鑒定后的胚胎裝入胚胎移植槍中，準(zhǔn)備移植。6.3.2胚胎裝入移植槍按照三段液滴兩段空氣，胚胎液滴位于移植槍的中間段。7受體羊胚胎移植7.1受體羊選擇有正常的發(fā)情周期，無繁殖機(jī)能疾病，年齡在1胎以上的母羊。7.2受體羊飼養(yǎng)管理受體羊組群加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，避免應(yīng)激，飼養(yǎng)符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。7.3同期發(fā)情受體羊同期發(fā)情方法，見附錄D。7.4受體羊移植7.4.1受體羊在移植前12小時(shí)空腹，禁水。7.4.2術(shù)部備皮同步驟5.7.2，7.4.3受體羊黃體觀察：a)手術(shù)法：參考供體羊手術(shù)5.7.2，取出子宮和卵巢，觀察黃體數(shù)量和顏色，進(jìn)行記錄；b)腹腔內(nèi)窺鏡法：在受體羊乳房前2cm～3cm腹中線兩側(cè)做各做一個(gè)創(chuàng)口，通過腹腔內(nèi)窺鏡觀察黃體數(shù)量、大小和顏色，并取出有黃體測(cè)的子宮角，進(jìn)行記錄。7.4.4在子宮角細(xì)段扎孔，將裝有胚胎的移植槍通過該孔導(dǎo)入子宮角，推出胚胎，將子宮角送回腹腔7.4.5縫合創(chuàng)口，創(chuàng)口撒消炎粉，碘酊消毒，注射抗生素和解麻藥物，解除保定。7.4.6受體移植記錄包括受體羊號(hào)、移植時(shí)間、移植胚胎數(shù)和胚胎登記等信息，見附錄G。DB12/T1148—202257.4.7移植胚胎后的受體羊，避免應(yīng)激反應(yīng)，飼養(yǎng)管理符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。DB12/T1148—2022（資料性）同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材見同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材見表A.1。1表A1同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材2促卵泡素（FSH）3孕馬血清促性腺激素（PMSG）4促黃體素釋放激素（LH）566DB12/T1148—2022常規(guī)耗材見表B.1。常規(guī)耗材見表B.1。1表B1常規(guī)耗材23456790mm培養(yǎng)皿835mm培養(yǎng)皿975%酒精7DB12/T1148—2022（資料性）胚胎移植設(shè)備見表胚胎移植設(shè)備見表C.1。1表C1胚胎移植設(shè)備2345678DB12/T1148—2022（資料性）綿羊胚胎移植方案見表D.1。綿羊胚胎移植方案見表D.1。表D1綿羊胚胎移植方案肌注FSH肌注FSH肌注FSH肌注FSH，撤去孕酮栓撤去孕酮栓，肌注PMSG肌注PMSG，人工輸精9DB12/T1148—2022胚胎鑒定E.1胚胎的發(fā)育階段鑒定：a)桑椹胚：5天～6天，只能觀察到球狀細(xì)胞團(tuán)，分不清分裂球，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)卵黃腔大部分；b)致密桑椹胚：6天～7天，細(xì)胞團(tuán)變小，占卵黃腔的60%-70%；c)早期囊胚：7天～8天，細(xì)胞團(tuán)一部分出現(xiàn)光亮胚胞腔，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)70%-80%，難以分清內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層；d)囊胚：7天～8天，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層界限清晰，胚腔明顯，細(xì)胞充滿卵黃腔；e)擴(kuò)張囊胚：8天～9天，囊胚腔明顯擴(kuò)大，體積增大到原來的1.5倍，與透明帶無間隙，透明帶變??；f)孵化胚：9天～11天，胚胞腔繼續(xù)擴(kuò)張，致使透明帶破裂，卵細(xì)胞脫出；g)凡在6推薦～8天回收的16細(xì)胞以下的胚胎均列為非正常發(fā)育胚胎，不宜使用。E.2胚胎質(zhì)量鑒定：b)B級(jí)：輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，可見到少量附著細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞