免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病相關(guān)性的重要手段。本規(guī)范旨在為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和質(zhì)量控制要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.**試劑與耗材**

-試劑：確保所有試劑符合實(shí)驗(yàn)要求，如磷酸鹽緩沖液（PBS）、抗體、酶標(biāo)底物等，需檢查生產(chǎn)日期和效期。

-耗材：使用無菌、無熱原的實(shí)驗(yàn)耗材，如培養(yǎng)皿、移液管、吸頭等，并定期消毒。

2.**儀器設(shè)備**

-檢查并校準(zhǔn)關(guān)鍵設(shè)備，如酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、離心機(jī)等，確保其處于最佳工作狀態(tài)。

-實(shí)驗(yàn)前需清潔并預(yù)熱相關(guān)設(shè)備，如細(xì)胞培養(yǎng)箱需預(yù)熱至37℃。

3.**樣品處理**

-生物樣品（如血液、組織）需在采集后盡快處理，避免長(zhǎng)時(shí)間保存導(dǎo)致活性變化。

-樣品需進(jìn)行無菌處理，如細(xì)胞培養(yǎng)液需過濾除菌。

（二）實(shí)驗(yàn)操作流程

1.**細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)**

(1)細(xì)胞接種：

-用PBS清洗細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至適宜范圍（如1×10^5/mL）。

-將細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)液（如DMEM或RPMI-1640）。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：

-將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液（如每2-3天一次）。

-觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如形態(tài)、貼壁情況等。

2.**ELISA實(shí)驗(yàn)**

(1)固定：

-將包被抗體或樣品固定于酶標(biāo)板，4℃過夜。

-用PBS洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘。

(2)結(jié)合：

-加入生物素化抗體或酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

-用PBS洗滌酶標(biāo)板3次。

(3)顯色：

-加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘。

-用終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（如450nm）。

3.**流式細(xì)胞術(shù)**

(1)細(xì)胞染色：

-用PBS清洗細(xì)胞，加入適量流式抗體（如CD3、CD4），4℃孵育30分鐘。

-用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于流式固定液。

(2)數(shù)據(jù)采集：

-將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀，設(shè)置合適的參數(shù)（如細(xì)胞數(shù)、熒光通道）。

-采集數(shù)據(jù)并保存原始文件。

(3)數(shù)據(jù)分析：

-使用FlowJo等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

（三）質(zhì)量控制

1.**陰性對(duì)照**

-每個(gè)實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（如未加抗體、未包被板等），以排除背景干擾。

2.**重復(fù)實(shí)驗(yàn)**

-關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行至少三次重復(fù)，確保結(jié)果的可重復(fù)性。

3.**結(jié)果驗(yàn)證**

-對(duì)異常結(jié)果進(jìn)行二次驗(yàn)證，如更換試劑或優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

二、實(shí)驗(yàn)安全與衛(wèi)生

（一）個(gè)人防護(hù)

1.佩戴實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡等防護(hù)用品。

2.避免直接接觸有毒有害試劑，如需操作需佩戴防化手套。

（二）實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生

1.定期清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和設(shè)備，避免交叉污染。

2.廢棄物需分類處理，如化學(xué)廢液需委托專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

（三）生物安全

1.操作生物樣品時(shí)需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免氣溶膠傳播。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需徹底消毒實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

三、實(shí)驗(yàn)記錄與報(bào)告

（一）實(shí)驗(yàn)記錄

1.詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件、試劑批號(hào)、操作步驟、觀察結(jié)果等信息。

2.使用電子表格或?qū)嶒?yàn)記錄本進(jìn)行記錄，確保數(shù)據(jù)可追溯。

（二）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.報(bào)告應(yīng)包含實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法、結(jié)果、討論等部分。

2.圖表需清晰標(biāo)注，數(shù)據(jù)需準(zhǔn)確表達(dá)。

**一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述**

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病相關(guān)性的重要手段。本規(guī)范旨在為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和質(zhì)量控制要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。通過遵循本規(guī)范，可以最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)效率，并為結(jié)果的比較和分析奠定基礎(chǔ)。

**(一)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

1.**試劑與耗材**

***試劑：**

***緩沖液：**磷酸鹽緩沖液（PBS）是最常用的緩沖液，用于細(xì)胞洗滌、抗體稀釋等。配制時(shí)需使用高純度試劑，并調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1。其他常用緩沖液如Tris緩沖液、Hank's平衡鹽溶液（HBSS）等，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。所有緩沖液均需過濾除菌（通常使用0.22μm濾膜）。

***抗體：**抗體是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心試劑，包括單克隆抗體（mAb）和多克隆抗體（pAb）。需根據(jù)目標(biāo)抗原、物種來源、應(yīng)用類型（如流式、ELISA、免疫組化）選擇合適的抗體。使用前需檢查抗體的儲(chǔ)存條件（通常是-20℃或-80℃），并按說明書進(jìn)行稀釋。建議使用預(yù)驗(yàn)證的抗體以提高實(shí)驗(yàn)成功率。

***酶標(biāo)底物：**常用的酶標(biāo)底物有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）、ABTS（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)）等，用于ELISA等檢測(cè)。需根據(jù)酶的種類（如HRP、TPO）選擇合適的底物。使用時(shí)需注意避光操作，并控制反應(yīng)時(shí)間以避免假陽性。

***固定劑：**常用的細(xì)胞固定劑有4%多聚甲醛、甲醇等，用于細(xì)胞固定以增強(qiáng)抗體結(jié)合。固定條件（如固定時(shí)間、溫度）需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化。

***封閉劑：**封閉劑（如牛血清白蛋白BSA、脫脂奶粉）用于封閉未結(jié)合的位點(diǎn)，減少非特異性結(jié)合。封閉條件（如封閉時(shí)間、溫度、濃度）需優(yōu)化。

***其他試劑：**如細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶、DNALadder、引物等，均需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇和使用。

***耗材：**

***培養(yǎng)皿/板：**常用的有96孔酶標(biāo)板、24孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、細(xì)胞爬片等。需選擇無菌、無熱原、表面適合細(xì)胞貼壁或包被的材料（如聚苯乙烯）。

***移液器：**移液器是精確移取液體的關(guān)鍵工具。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的量程和精度。使用前需用70%乙醇或去離子水潤(rùn)洗3次，然后用待移取的液體潤(rùn)洗3次。

***吸頭：**吸頭需與移液器匹配，并選擇合適材質(zhì)（如聚丙烯）。使用一次性吸頭可避免交叉污染。

***離心管/瓶：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯）、規(guī)格和開口類型（如尖底、圓底）。需確保離心管無裂痕、無污染。

***其他耗材：**如槍頭、培養(yǎng)箱蓋、封口膜、冰盒、試管架等，均需確保清潔、無菌。

2.**儀器設(shè)備**

***基本設(shè)備：**

***離心機(jī)：**用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白等。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的轉(zhuǎn)速和離心力。使用前需檢查轉(zhuǎn)子是否平衡，并按照操作規(guī)程進(jìn)行離心。

***培養(yǎng)箱：**用于細(xì)胞培養(yǎng)。常用有二氧化碳培養(yǎng)箱（提供37℃、5%CO2環(huán)境）和水浴鍋（提供恒溫環(huán)境）。需定期校準(zhǔn)溫度和CO2濃度。

***冰箱：**用于儲(chǔ)存試劑和樣品。常用有普通冰箱（4℃）和超低溫冰箱（-20℃、-80℃）。需定期檢查溫度記錄儀，確保溫度穩(wěn)定。

***移液器：**如上所述，是精確移取液體的關(guān)鍵工具。

***顯微鏡：**用于觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫組化結(jié)果等。常用有倒置顯微鏡和正置顯微鏡。

***專業(yè)設(shè)備：**

***酶標(biāo)儀：**用于ELISA等實(shí)驗(yàn)中測(cè)定吸光度。需定期校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

***流式細(xì)胞儀：**用于細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗原檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期分析等。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的熒光通道和參數(shù)。使用前需用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器。

***凝膠成像系統(tǒng)：**用于電泳后蛋白條帶的成像和分析。需選擇合適的光源和曝光時(shí)間，確保圖像清晰。

***PCR儀：**用于DNA擴(kuò)增。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的退火溫度、循環(huán)數(shù)等參數(shù)。使用前需用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照檢查儀器的擴(kuò)增效率。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)器：**用于細(xì)胞計(jì)數(shù)?？墒謩?dòng)或自動(dòng)計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確性。

3.**樣品處理**

***生物樣品采集：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的生物樣品，如血液、組織、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。采集時(shí)需遵循無菌操作原則，避免污染。

***血液樣品處理：**靜脈血采集后，根據(jù)需要加入抗凝劑（如EDTA、肝素）或促凝劑（如檸檬酸鈉）。分離血漿或白細(xì)胞后，需盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或儲(chǔ)存于-80℃。

***組織樣品處理：**

***固定：**立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間通常為24-48小時(shí)。

***脫水：**將組織依次放入梯度乙醇溶液（如70%、80%、90%、95%、100%）中脫水。

***透明：**將組織放入二甲苯中透明。

***包埋：**將組織包埋于石蠟中。

***切片：**將石蠟切片于顯微鏡切片機(jī)上切片，厚度通常為4-5μm。

***細(xì)胞培養(yǎng)上清處理：**收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞碎片，上清液可保存于-80℃。

***樣品儲(chǔ)存：**不同樣品需儲(chǔ)存于不同的溫度，如細(xì)胞、血漿、蛋白等通常保存于-80℃，DNA、RNA通常保存于-20℃或-80℃。需定期檢查樣品質(zhì)量，如細(xì)胞活力、蛋白濃度等。

**(二)實(shí)驗(yàn)操作流程**

1.**細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)**

***細(xì)胞復(fù)蘇：**

*(1)將凍存管放入37℃水浴中快速解凍。

*(2)立即加入適量預(yù)溫的細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。

*(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至適宜范圍（如1×10^5/mL）。

*(4)接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)液。

***細(xì)胞傳代：**

*(1)用PBS或培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基。

*(2)加入適量胰蛋白酶或EDTA消化液，置于37℃消化（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間，通常5-15分鐘）。

*(3)在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或瓶壁，細(xì)胞即可被吹散。

*(4)加入適量培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，重懸細(xì)胞。

*(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。

***細(xì)胞凍存：**

*(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10^6/mL-1×10^7/mL。

*(2)加入冷凍液（如含10%DMSO和90%培養(yǎng)基的混合液），重懸細(xì)胞。

*(3)將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，每管1mL。

*(4)置于-80℃凍存盒中，緩慢冷凍（如每10分鐘降低5℃，直至-80℃）。

*(5)凍存后可短期保存于-20℃，長(zhǎng)期保存需置于-80℃。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)：**常用方法有血球計(jì)數(shù)板法和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法。需使用合適的計(jì)數(shù)液（如臺(tái)盼藍(lán)染液）區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

2.**ELISA實(shí)驗(yàn)**

***間接ELISA（檢測(cè)抗體）：**

*(1)**包被：**將包被抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**用洗滌液（如PBS-T）洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，吸水紙吸干。

*(3)**封閉：**加入封閉液，37℃孵育1小時(shí)。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加樣：**加入待測(cè)樣品（如血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清），37℃孵育1小時(shí)。

*(6)**洗滌：**同上。

*(7)**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(8)**洗滌：**同上。

*(9)**顯色：**加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘。

*(10)**終止：**加入終止液（如2MH2SO4），終止反應(yīng)。

*(11)**檢測(cè)：**用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（如450nm），設(shè)空白孔調(diào)零。

***雙抗體夾心ELISA（檢測(cè)抗原）：**

*(1)**包被：**將捕獲抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**同上。

*(3)**封閉：**同上。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加樣品：**加入待測(cè)樣品，37℃孵育1小時(shí)。

*(6)**洗滌：**同上。

*(7)**加檢測(cè)抗體：**加入檢測(cè)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(8)**洗滌：**同上。

*(9)**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(10)**洗滌：**同上。

*(11)**顯色：**同上。

*(12)**終止：**同上。

*(13)**檢測(cè)：**同上。

***競(jìng)爭(zhēng)ELISA（檢測(cè)小分子抗原）：**

*(1)**包被：**將捕獲抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**同上。

*(3)**封閉：**同上。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和酶標(biāo)抗體：**將待測(cè)樣品和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別與酶標(biāo)抗體混合，加入酶標(biāo)板孔中。

*(6)**孵育：**37℃孵育1小時(shí)。

*(7)**洗滌：**同上。

*(8)**顯色：**同上。

*(9)**終止：**同上。

*(10)**檢測(cè)：**同上。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值越低，說明樣品中目標(biāo)抗原含量越高。

3.**流式細(xì)胞術(shù)**

***細(xì)胞制備：**

*(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞來源，如外周血、組織切片等。

*(2)對(duì)于外周血，需用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞。

*(3)對(duì)于組織，需進(jìn)行組織處理（如固定、脫水、包埋、切片），然后用胰蛋白酶消化或機(jī)械法解離獲得單細(xì)胞懸液。

***細(xì)胞染色：**

*(1)用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于染色液中（如含0.5%-1%BSA的PBS）。

*(2)加入適量表面抗體或胞內(nèi)抗體，4℃孵育30分鐘（表面抗體）或37℃孵育1小時(shí)（胞內(nèi)抗體）。

*(3)用PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于流式固定液中（如多聚甲醛）。

***數(shù)據(jù)采集：**

*(1)將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管中，加入適量流式染料（如PI用于細(xì)胞周期分析）。

*(2)設(shè)置合適的參數(shù)，如細(xì)胞數(shù)、熒光通道、閾值等。

*(3)采集數(shù)據(jù)并保存原始文件（如FCS文件）。

***數(shù)據(jù)分析：**

*(1)使用FlowJo等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

*(2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置門控，去除背景噪聲和死細(xì)胞。

*(3)分析細(xì)胞群的分布、比例、細(xì)胞大小、顆粒度等參數(shù)。

*(4)繪制圖表，如直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖等，展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

**(三)質(zhì)量控制**

1.**陰性對(duì)照**

*每個(gè)實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照，以排除背景干擾和假陽性結(jié)果。

***間接ELISA的陰性對(duì)照：**不加樣品或加入陰性對(duì)照樣品（如正常血清）的孔。

***流式細(xì)胞術(shù)的陰性對(duì)照：**不加抗體或加入同型對(duì)照抗體的孔。

***其他實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型設(shè)置，如不加酶標(biāo)抗體、不加底物等。

*陰性對(duì)照的OD值或熒光強(qiáng)度應(yīng)盡可能低，且不應(yīng)明顯高于背景水平。

2.**重復(fù)實(shí)驗(yàn)**

*關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行至少三次重復(fù)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

*對(duì)于重復(fù)實(shí)驗(yàn)，需計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異性。

*如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異較大，需分析原因并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

3.**結(jié)果驗(yàn)證**

*對(duì)于異常結(jié)果，需進(jìn)行二次驗(yàn)證，以排除實(shí)驗(yàn)誤差或操作失誤。

*二次驗(yàn)證可采用不同的實(shí)驗(yàn)方法或試劑，或由不同的實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行操作。

*如果二次驗(yàn)證的結(jié)果仍然與預(yù)期不符，需進(jìn)一步分析原因，并考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

**二、實(shí)驗(yàn)安全與衛(wèi)生**

**(一)個(gè)人防護(hù)**

1.**實(shí)驗(yàn)服：**佩戴實(shí)驗(yàn)服，避免皮膚直接接觸化學(xué)試劑和生物樣品。實(shí)驗(yàn)服應(yīng)定期清洗，避免交叉污染。

2.**手套：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的手套，如一次性手套、乳膠手套、丁腈手套等。手套需定期更換，避免破損和污染。

3.**護(hù)目鏡：**操作有刺激性或易濺射的試劑時(shí)，需佩戴護(hù)目鏡，保護(hù)眼睛免受傷害。

4.**口罩：**操作有氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需佩戴醫(yī)用口罩或防毒面具，避免吸入有害物質(zhì)。

5.**其他防護(hù)：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可能還需要佩戴防護(hù)圍裙、防護(hù)靴等。

**(二)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生**

1.**清潔：**定期清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、設(shè)備、地面等，避免污染和交叉感染。

***清潔程序：**

*(1)用干凈的抹布擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和設(shè)備。

*(2)使用合適的清潔劑（如中性洗滌劑、酒精）清潔表面。

*(3)用清水沖洗干凈，然后用干凈的抹布擦干。

2.**消毒：**定期對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行消毒，殺滅潛在的微生物。

***消毒方法：**

*(1)使用70%-75%乙醇擦拭表面。

*(2)使用含氯消毒劑（如次氯酸鈉）溶液浸泡器械。

*(3)使用紫外線燈照射消毒。

3.**廢棄物處理：**廢棄物需分類處理，避免環(huán)境污染和交叉感染。

***廢棄物分類：**

*(1)**化學(xué)廢棄物：**如廢液、廢試劑等，需委托專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

*(2)**生物廢棄物：**如培養(yǎng)皿、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)上清等，需高壓滅菌后丟棄。

*(3)**其他廢棄物：**如實(shí)驗(yàn)服、手套等，需根據(jù)材質(zhì)進(jìn)行分類處理。

**(三)生物安全**

1.**生物安全柜：**操作有生物安全風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免氣溶膠傳播。

***生物安全柜操作：**

*(1)開啟生物安全柜，等待通風(fēng)穩(wěn)定。

*(2)將實(shí)驗(yàn)用品放置于工作臺(tái)面上。

*(3)操作時(shí)避免快速移動(dòng)物品，避免產(chǎn)生氣溶膠。

*(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，關(guān)閉生物安全柜，進(jìn)行清潔和消毒。

2.**高壓滅菌：**所有接觸生物樣品的器械和耗材均需高壓滅菌，殺滅潛在的微生物。

***高壓滅菌參數(shù)：**通常為121℃、15psi、15分鐘。

3.**實(shí)驗(yàn)結(jié)束后：**實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需徹底消毒實(shí)驗(yàn)區(qū)域，并對(duì)所有接觸生物樣品的器械和耗材進(jìn)行清洗和消毒。

**三、實(shí)驗(yàn)記錄與報(bào)告**

**(一)實(shí)驗(yàn)記錄**

1.**記錄內(nèi)容：**詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件、試劑批號(hào)、操作步驟、觀察結(jié)果等信息。

2.**記錄方式：**使用電子表格或?qū)嶒?yàn)記錄本進(jìn)行記錄，確保數(shù)據(jù)可追溯。

3.**記錄要求：**

*(1)記錄應(yīng)清晰、準(zhǔn)確、完整。

*(2)記錄應(yīng)及時(shí)，避免遺忘或遺漏。

*(3)記錄應(yīng)便于查閱和分析。

4.**記錄示例：**

***實(shí)驗(yàn)名稱：**細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

***實(shí)驗(yàn)日期：**2023年10月26日

***實(shí)驗(yàn)者：**張三

***細(xì)胞類型：**人肝癌細(xì)胞（HepG2）

***培養(yǎng)基：**DMEM+10%FBS+1%P/S

***接種密度：**1×10^5/mL

***培養(yǎng)條件：**37℃、5%CO2

***觀察結(jié)果：**細(xì)胞貼壁良好，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無明顯污染。

**(二)實(shí)驗(yàn)報(bào)告**

1.**報(bào)告結(jié)構(gòu)：**報(bào)告應(yīng)包含實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒎椒?、結(jié)果、討論、結(jié)論等部分。

2.**報(bào)告內(nèi)容：**

***實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?*簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)的目的和意義。

***方法：**詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)方法，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作步驟、試劑和耗材等。

***結(jié)果：**以圖表、文字等形式展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

***討論：**對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和解釋，與已有文獻(xiàn)進(jìn)行比較，并討論實(shí)驗(yàn)的局限性和改進(jìn)方向。

***結(jié)論：**總結(jié)實(shí)驗(yàn)的主要發(fā)現(xiàn)，并回答實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶岢龅膯栴}。

3.**報(bào)告要求：**

*(1)報(bào)告應(yīng)邏輯清晰、條理分明。

*(2)報(bào)告應(yīng)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、圖表清晰。

*(3)報(bào)告應(yīng)語言簡(jiǎn)潔、表達(dá)準(zhǔn)確。

4.**報(bào)告示例：**

***實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?*檢測(cè)人肝癌細(xì)胞（HepG2）中CD44的表達(dá)水平。

***方法：**采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD44的表達(dá)水平。細(xì)胞制備、細(xì)胞染色、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析按照流式細(xì)胞術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

***結(jié)果：**流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中CD44的表達(dá)水平為XX%。（附圖表）

***討論：**與文獻(xiàn)報(bào)道一致，HepG2細(xì)胞中CD44表達(dá)水平較高。CD44可能參與肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

***結(jié)論：**本研究成功建立了檢測(cè)HepG2細(xì)胞中CD44表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)方法，并發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中CD44表達(dá)水平較高。

一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病相關(guān)性的重要手段。本規(guī)范旨在為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和質(zhì)量控制要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.**試劑與耗材**

-試劑：確保所有試劑符合實(shí)驗(yàn)要求，如磷酸鹽緩沖液（PBS）、抗體、酶標(biāo)底物等，需檢查生產(chǎn)日期和效期。

-耗材：使用無菌、無熱原的實(shí)驗(yàn)耗材，如培養(yǎng)皿、移液管、吸頭等，并定期消毒。

2.**儀器設(shè)備**

-檢查并校準(zhǔn)關(guān)鍵設(shè)備，如酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、離心機(jī)等，確保其處于最佳工作狀態(tài)。

-實(shí)驗(yàn)前需清潔并預(yù)熱相關(guān)設(shè)備，如細(xì)胞培養(yǎng)箱需預(yù)熱至37℃。

3.**樣品處理**

-生物樣品（如血液、組織）需在采集后盡快處理，避免長(zhǎng)時(shí)間保存導(dǎo)致活性變化。

-樣品需進(jìn)行無菌處理，如細(xì)胞培養(yǎng)液需過濾除菌。

（二）實(shí)驗(yàn)操作流程

1.**細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)**

(1)細(xì)胞接種：

-用PBS清洗細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至適宜范圍（如1×10^5/mL）。

-將細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)液（如DMEM或RPMI-1640）。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：

-將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液（如每2-3天一次）。

-觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如形態(tài)、貼壁情況等。

2.**ELISA實(shí)驗(yàn)**

(1)固定：

-將包被抗體或樣品固定于酶標(biāo)板，4℃過夜。

-用PBS洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘。

(2)結(jié)合：

-加入生物素化抗體或酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

-用PBS洗滌酶標(biāo)板3次。

(3)顯色：

-加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘。

-用終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（如450nm）。

3.**流式細(xì)胞術(shù)**

(1)細(xì)胞染色：

-用PBS清洗細(xì)胞，加入適量流式抗體（如CD3、CD4），4℃孵育30分鐘。

-用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于流式固定液。

(2)數(shù)據(jù)采集：

-將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀，設(shè)置合適的參數(shù)（如細(xì)胞數(shù)、熒光通道）。

-采集數(shù)據(jù)并保存原始文件。

(3)數(shù)據(jù)分析：

-使用FlowJo等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

（三）質(zhì)量控制

1.**陰性對(duì)照**

-每個(gè)實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（如未加抗體、未包被板等），以排除背景干擾。

2.**重復(fù)實(shí)驗(yàn)**

-關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行至少三次重復(fù)，確保結(jié)果的可重復(fù)性。

3.**結(jié)果驗(yàn)證**

-對(duì)異常結(jié)果進(jìn)行二次驗(yàn)證，如更換試劑或優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

二、實(shí)驗(yàn)安全與衛(wèi)生

（一）個(gè)人防護(hù)

1.佩戴實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡等防護(hù)用品。

2.避免直接接觸有毒有害試劑，如需操作需佩戴防化手套。

（二）實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生

1.定期清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和設(shè)備，避免交叉污染。

2.廢棄物需分類處理，如化學(xué)廢液需委托專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

（三）生物安全

1.操作生物樣品時(shí)需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免氣溶膠傳播。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需徹底消毒實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

三、實(shí)驗(yàn)記錄與報(bào)告

（一）實(shí)驗(yàn)記錄

1.詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件、試劑批號(hào)、操作步驟、觀察結(jié)果等信息。

2.使用電子表格或?qū)嶒?yàn)記錄本進(jìn)行記錄，確保數(shù)據(jù)可追溯。

（二）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.報(bào)告應(yīng)包含實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法、結(jié)果、討論等部分。

2.圖表需清晰標(biāo)注，數(shù)據(jù)需準(zhǔn)確表達(dá)。

**一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述**

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病相關(guān)性的重要手段。本規(guī)范旨在為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和質(zhì)量控制要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。通過遵循本規(guī)范，可以最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)效率，并為結(jié)果的比較和分析奠定基礎(chǔ)。

**(一)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

1.**試劑與耗材**

***試劑：**

***緩沖液：**磷酸鹽緩沖液（PBS）是最常用的緩沖液，用于細(xì)胞洗滌、抗體稀釋等。配制時(shí)需使用高純度試劑，并調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1。其他常用緩沖液如Tris緩沖液、Hank's平衡鹽溶液（HBSS）等，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。所有緩沖液均需過濾除菌（通常使用0.22μm濾膜）。

***抗體：**抗體是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心試劑，包括單克隆抗體（mAb）和多克隆抗體（pAb）。需根據(jù)目標(biāo)抗原、物種來源、應(yīng)用類型（如流式、ELISA、免疫組化）選擇合適的抗體。使用前需檢查抗體的儲(chǔ)存條件（通常是-20℃或-80℃），并按說明書進(jìn)行稀釋。建議使用預(yù)驗(yàn)證的抗體以提高實(shí)驗(yàn)成功率。

***酶標(biāo)底物：**常用的酶標(biāo)底物有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）、ABTS（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)）等，用于ELISA等檢測(cè)。需根據(jù)酶的種類（如HRP、TPO）選擇合適的底物。使用時(shí)需注意避光操作，并控制反應(yīng)時(shí)間以避免假陽性。

***固定劑：**常用的細(xì)胞固定劑有4%多聚甲醛、甲醇等，用于細(xì)胞固定以增強(qiáng)抗體結(jié)合。固定條件（如固定時(shí)間、溫度）需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化。

***封閉劑：**封閉劑（如牛血清白蛋白BSA、脫脂奶粉）用于封閉未結(jié)合的位點(diǎn)，減少非特異性結(jié)合。封閉條件（如封閉時(shí)間、溫度、濃度）需優(yōu)化。

***其他試劑：**如細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶、DNALadder、引物等，均需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇和使用。

***耗材：**

***培養(yǎng)皿/板：**常用的有96孔酶標(biāo)板、24孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、細(xì)胞爬片等。需選擇無菌、無熱原、表面適合細(xì)胞貼壁或包被的材料（如聚苯乙烯）。

***移液器：**移液器是精確移取液體的關(guān)鍵工具。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的量程和精度。使用前需用70%乙醇或去離子水潤(rùn)洗3次，然后用待移取的液體潤(rùn)洗3次。

***吸頭：**吸頭需與移液器匹配，并選擇合適材質(zhì)（如聚丙烯）。使用一次性吸頭可避免交叉污染。

***離心管/瓶：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯）、規(guī)格和開口類型（如尖底、圓底）。需確保離心管無裂痕、無污染。

***其他耗材：**如槍頭、培養(yǎng)箱蓋、封口膜、冰盒、試管架等，均需確保清潔、無菌。

2.**儀器設(shè)備**

***基本設(shè)備：**

***離心機(jī)：**用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白等。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的轉(zhuǎn)速和離心力。使用前需檢查轉(zhuǎn)子是否平衡，并按照操作規(guī)程進(jìn)行離心。

***培養(yǎng)箱：**用于細(xì)胞培養(yǎng)。常用有二氧化碳培養(yǎng)箱（提供37℃、5%CO2環(huán)境）和水浴鍋（提供恒溫環(huán)境）。需定期校準(zhǔn)溫度和CO2濃度。

***冰箱：**用于儲(chǔ)存試劑和樣品。常用有普通冰箱（4℃）和超低溫冰箱（-20℃、-80℃）。需定期檢查溫度記錄儀，確保溫度穩(wěn)定。

***移液器：**如上所述，是精確移取液體的關(guān)鍵工具。

***顯微鏡：**用于觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫組化結(jié)果等。常用有倒置顯微鏡和正置顯微鏡。

***專業(yè)設(shè)備：**

***酶標(biāo)儀：**用于ELISA等實(shí)驗(yàn)中測(cè)定吸光度。需定期校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

***流式細(xì)胞儀：**用于細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗原檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期分析等。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的熒光通道和參數(shù)。使用前需用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器。

***凝膠成像系統(tǒng)：**用于電泳后蛋白條帶的成像和分析。需選擇合適的光源和曝光時(shí)間，確保圖像清晰。

***PCR儀：**用于DNA擴(kuò)增。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的退火溫度、循環(huán)數(shù)等參數(shù)。使用前需用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照檢查儀器的擴(kuò)增效率。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)器：**用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。可手動(dòng)或自動(dòng)計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確性。

3.**樣品處理**

***生物樣品采集：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的生物樣品，如血液、組織、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。采集時(shí)需遵循無菌操作原則，避免污染。

***血液樣品處理：**靜脈血采集后，根據(jù)需要加入抗凝劑（如EDTA、肝素）或促凝劑（如檸檬酸鈉）。分離血漿或白細(xì)胞后，需盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或儲(chǔ)存于-80℃。

***組織樣品處理：**

***固定：**立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間通常為24-48小時(shí)。

***脫水：**將組織依次放入梯度乙醇溶液（如70%、80%、90%、95%、100%）中脫水。

***透明：**將組織放入二甲苯中透明。

***包埋：**將組織包埋于石蠟中。

***切片：**將石蠟切片于顯微鏡切片機(jī)上切片，厚度通常為4-5μm。

***細(xì)胞培養(yǎng)上清處理：**收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞碎片，上清液可保存于-80℃。

***樣品儲(chǔ)存：**不同樣品需儲(chǔ)存于不同的溫度，如細(xì)胞、血漿、蛋白等通常保存于-80℃，DNA、RNA通常保存于-20℃或-80℃。需定期檢查樣品質(zhì)量，如細(xì)胞活力、蛋白濃度等。

**(二)實(shí)驗(yàn)操作流程**

1.**細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)**

***細(xì)胞復(fù)蘇：**

*(1)將凍存管放入37℃水浴中快速解凍。

*(2)立即加入適量預(yù)溫的細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。

*(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至適宜范圍（如1×10^5/mL）。

*(4)接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)液。

***細(xì)胞傳代：**

*(1)用PBS或培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基。

*(2)加入適量胰蛋白酶或EDTA消化液，置于37℃消化（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間，通常5-15分鐘）。

*(3)在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或瓶壁，細(xì)胞即可被吹散。

*(4)加入適量培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，重懸細(xì)胞。

*(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。

***細(xì)胞凍存：**

*(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10^6/mL-1×10^7/mL。

*(2)加入冷凍液（如含10%DMSO和90%培養(yǎng)基的混合液），重懸細(xì)胞。

*(3)將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，每管1mL。

*(4)置于-80℃凍存盒中，緩慢冷凍（如每10分鐘降低5℃，直至-80℃）。

*(5)凍存后可短期保存于-20℃，長(zhǎng)期保存需置于-80℃。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)：**常用方法有血球計(jì)數(shù)板法和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法。需使用合適的計(jì)數(shù)液（如臺(tái)盼藍(lán)染液）區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

2.**ELISA實(shí)驗(yàn)**

***間接ELISA（檢測(cè)抗體）：**

*(1)**包被：**將包被抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**用洗滌液（如PBS-T）洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，吸水紙吸干。

*(3)**封閉：**加入封閉液，37℃孵育1小時(shí)。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加樣：**加入待測(cè)樣品（如血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清），37℃孵育1小時(shí)。

*(6)**洗滌：**同上。

*(7)**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(8)**洗滌：**同上。

*(9)**顯色：**加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘。

*(10)**終止：**加入終止液（如2MH2SO4），終止反應(yīng)。

*(11)**檢測(cè)：**用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（如450nm），設(shè)空白孔調(diào)零。

***雙抗體夾心ELISA（檢測(cè)抗原）：**

*(1)**包被：**將捕獲抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**同上。

*(3)**封閉：**同上。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加樣品：**加入待測(cè)樣品，37℃孵育1小時(shí)。

*(6)**洗滌：**同上。

*(7)**加檢測(cè)抗體：**加入檢測(cè)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(8)**洗滌：**同上。

*(9)**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1小時(shí)。

*(10)**洗滌：**同上。

*(11)**顯色：**同上。

*(12)**終止：**同上。

*(13)**檢測(cè)：**同上。

***競(jìng)爭(zhēng)ELISA（檢測(cè)小分子抗原）：**

*(1)**包被：**將捕獲抗體稀釋于封閉液，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

*(2)**洗滌：**同上。

*(3)**封閉：**同上。

*(4)**洗滌：**同上。

*(5)**加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和酶標(biāo)抗體：**將待測(cè)樣品和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別與酶標(biāo)抗體混合，加入酶標(biāo)板孔中。

*(6)**孵育：**37℃孵育1小時(shí)。

*(7)**洗滌：**同上。

*(8)**顯色：**同上。

*(9)**終止：**同上。

*(10)**檢測(cè)：**同上。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值越低，說明樣品中目標(biāo)抗原含量越高。

3.**流式細(xì)胞術(shù)**

***細(xì)胞制備：**

*(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞來源，如外周血、組織切片等。

*(2)對(duì)于外周血，需用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞。

*(3)對(duì)于組織，需進(jìn)行組織處理（如固定、脫水、包埋、切片），然后用胰蛋白酶消化或機(jī)械法解離獲得單細(xì)胞懸液。

***細(xì)胞染色：**

*(1)用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于染色液中（如含0.5%-1%BSA的PBS）。

*(2)加入適量表面抗體或胞內(nèi)抗體，4℃孵育30分鐘（表面抗體）或37℃孵育1小時(shí)（胞內(nèi)抗體）。

*(3)用PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于流式固定液中（如多聚甲醛）。

***數(shù)據(jù)采集：**

*(1)將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管中，加入適量流式染料（如PI用于細(xì)胞周期分析）。

*(2)設(shè)置合適的參數(shù)，如細(xì)胞數(shù)、熒光通道、閾值等。

*(3)采集數(shù)據(jù)并保存原始文件（如FCS文件）。

***數(shù)據(jù)分析：**

*(1)使用FlowJo等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

*(2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置門控，去除背景噪聲和死細(xì)胞。

*(3)分析細(xì)胞群的分布、比例、細(xì)胞大小、顆粒度等參數(shù)。

*(4)繪制圖表，如直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖等，展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

**(三)質(zhì)量控制**

1.**陰性對(duì)照**

*每個(gè)實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照，以排除背景干擾和假陽性結(jié)果。

***間接ELISA的陰性對(duì)照：**不加樣品或加入陰性對(duì)照樣品（如正常血清）的孔。

***流式細(xì)胞術(shù)的陰性對(duì)照：**不加抗體或加入同型對(duì)照抗體的孔。

***其他實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型設(shè)置，如不加酶標(biāo)抗體、不加底物等。

*陰性對(duì)照的OD值或熒光強(qiáng)度應(yīng)盡可能低，且不應(yīng)明顯高于背景水平。

2.**重復(fù)實(shí)驗(yàn)**

*關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行至少三次重復(fù)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

*對(duì)于重復(fù)實(shí)驗(yàn)，需計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異性。

*如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異較大，需分析原因并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

3.**結(jié)果驗(yàn)證**

*對(duì)于異常結(jié)果，需進(jìn)行二次驗(yàn)證，以排除實(shí)驗(yàn)誤差或操作失誤。

*二次驗(yàn)證可采用不同的實(shí)驗(yàn)方法或試劑，或由不同的實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行操作。

*如果二次驗(yàn)證的結(jié)果仍然與預(yù)期不符，需進(jìn)一步分析原因，并考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

**二、實(shí)驗(yàn)安全與衛(wèi)生**

**(一)個(gè)人防護(hù)**

1.**實(shí)驗(yàn)服：**佩戴實(shí)驗(yàn)服，避免皮膚直接接觸化學(xué)試劑和生物樣品。實(shí)驗(yàn)服應(yīng)定期清洗，避免交叉污染。

2.**手套：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的手套，如一次性手套、乳膠手套、丁腈手套等。手套需定期更換，避免破損和污染。

3.**護(hù)目鏡：**操作有刺激性或易濺射的試劑時(shí)，需佩戴護(hù)目鏡，保護(hù)眼睛免受傷害。

4.**口罩：**操作有氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需佩戴醫(yī)用口罩或防毒面具，避免吸入有害物質(zhì)。

5.**其他防護(hù)：**根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可能還需要佩戴防護(hù)圍裙、防護(hù)靴等。

**(二)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生**

1.**清潔：**定期清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、設(shè)備、地面等，避免污染和交叉感染。

***清潔程序：**

*(1)用干凈的抹布擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和設(shè)備。

*(2)使用合適的清潔