基于核受體TR3靶向的雙吲哚化合物設(shè)計、合成與生物活性探究一、引言1.1研究背景與意義在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，核受體和小分子化合物一直是研究的熱點(diǎn)。核受體作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長、分化、代謝以及凋亡等諸多生理過程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的調(diào)控作用。其中，孤兒核受體TR3，作為核受體超家族中的獨(dú)特成員，因尚未發(fā)現(xiàn)其明確的內(nèi)源性配體而得名。盡管如此，TR3在胚胎發(fā)育進(jìn)程中，對細(xì)胞分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的精細(xì)調(diào)節(jié)作用不容小覷，它確保了身體多種組織正常生理功能的有序運(yùn)行。在面對應(yīng)激反應(yīng)時，TR3更是廣泛參與到代謝、炎癥反應(yīng)、血管功能調(diào)節(jié)、類固醇合成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動等多個重要生理過程中。尤為引人注目的是，大量研究表明，TR3在多發(fā)性腫瘤和多種癌癥細(xì)胞系中呈現(xiàn)出過表達(dá)的狀態(tài)，這一現(xiàn)象使其成為癌癥治療領(lǐng)域極具潛力的關(guān)鍵靶點(diǎn)。例如，在乳腺癌細(xì)胞系中，TR3的高表達(dá)與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)，通過調(diào)控TR3的活性，有望有效抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性行為。雙吲哚化合物作為一類重要的小分子化合物，近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它們多樣的生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)，雙吲哚化合物在抗癌、抗炎、抗氧化等方面表現(xiàn)出顯著的效果。在抗癌領(lǐng)域，雙吲哚化合物能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，如抑制癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等。以雙吲哚甲烷衍生物為例，研究表明其可以通過靶向癌細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號通路，如PI3K/Akt通路，抑制癌細(xì)胞的增殖和存活；還能激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為雙吲哚化合物在癌癥治療中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究聚焦于與核受體TR3相關(guān)的雙吲哚化合物，具有深遠(yuǎn)的意義。從理論層面來看，深入探究雙吲哚化合物與TR3之間的相互作用機(jī)制，有助于我們更全面、深入地理解TR3的生物學(xué)功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。這不僅能夠豐富我們對核受體生物學(xué)的認(rèn)識，還可能為揭示其他孤兒核受體的功能和作用機(jī)制提供新的思路和方法。從實(shí)際應(yīng)用角度而言，基于TR3設(shè)計并合成新型雙吲哚化合物，為癌癥治療藥物的研發(fā)開辟了新的方向。通過精準(zhǔn)地靶向TR3，有望開發(fā)出具有高效、低毒、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的新型抗癌藥物，從而顯著提高癌癥治療的效果，為廣大癌癥患者帶來新的希望。此外，本研究對于推動生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，促進(jìn)基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的緊密結(jié)合，也具有重要的推動作用。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在基于核受體TR3的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，設(shè)計并合成一系列新型雙吲哚化合物，并深入研究它們與TR3的相互作用以及相關(guān)的生物學(xué)活性，為開發(fā)以TR3為靶點(diǎn)的新型抗癌藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：雙吲哚化合物的設(shè)計：運(yùn)用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)，基于TR3的三維晶體結(jié)構(gòu)，通過分子對接、分子動力學(xué)模擬等方法，深入分析TR3與潛在雙吲哚配體之間的相互作用模式和結(jié)合位點(diǎn)。參考已有的雙吲哚化合物結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系研究成果，對雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理修飾和優(yōu)化。在吲哚環(huán)上引入不同的取代基，如鹵素原子（氟、氯、溴等）、甲基、甲氧基等，改變?nèi)〈奈恢煤蛿?shù)量，以探索其對化合物與TR3結(jié)合親和力和生物活性的影響。同時，調(diào)整連接兩個吲哚環(huán)的橋連基團(tuán)的長度、結(jié)構(gòu)和柔性，期望找到能夠增強(qiáng)化合物與TR3相互作用的最佳結(jié)構(gòu)形式。雙吲哚化合物的合成：根據(jù)設(shè)計的結(jié)構(gòu)，選擇合適的合成路線和方法，進(jìn)行雙吲哚化合物的合成。以常見的吲哚類化合物為起始原料，通過一系列的化學(xué)反應(yīng)，如親核取代反應(yīng)、親電取代反應(yīng)、縮合反應(yīng)等，逐步構(gòu)建目標(biāo)雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)。在合成過程中，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物比例、催化劑種類和用量等，以提高反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性。運(yùn)用柱色譜、薄層色譜、重結(jié)晶等分離純化技術(shù)，對合成的化合物進(jìn)行分離和純化，確保得到高純度的目標(biāo)產(chǎn)物。采用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）等現(xiàn)代分析技術(shù)，對合成的雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確表征，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)和純度。雙吲哚化合物的生物活性研究：對合成的雙吲哚化合物進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)活性評價。首先，采用MTT法、CCK-8法等細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測化合物對多種癌細(xì)胞系（如乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、肝癌細(xì)胞系HepG2等）增殖的抑制作用，計算IC50值，評估化合物的細(xì)胞毒性。其次，通過流式細(xì)胞術(shù)分析化合物對癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、caspase-3等）的表達(dá)水平，探討化合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。運(yùn)用熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，檢測化合物對TR3轉(zhuǎn)錄活性的影響，明確化合物與TR3的相互作用是否能夠激活或抑制TR3的轉(zhuǎn)錄功能。此外，還將進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，研究化合物對癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，評估其對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。通過這些實(shí)驗(yàn)，全面深入地了解雙吲哚化合物的生物學(xué)活性和作用機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的研究方法和技術(shù)，確保研究的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和有效性。具體如下：計算機(jī)輔助藥物設(shè)計：利用專業(yè)的分子模擬軟件，如DiscoveryStudio、AutoDock等，進(jìn)行分子對接和分子動力學(xué)模擬。在分子對接過程中，將TR3的三維晶體結(jié)構(gòu)（可從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB中獲取）與設(shè)計的雙吲哚化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，通過計算結(jié)合自由能、氫鍵相互作用、疏水相互作用等參數(shù)，預(yù)測雙吲哚化合物與TR3的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，篩選出具有潛在高親和力的化合物。進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，進(jìn)一步研究化合物與TR3結(jié)合后的動態(tài)行為，分析結(jié)合的穩(wěn)定性和構(gòu)象變化，為化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供更深入的信息。有機(jī)合成技術(shù)：依據(jù)設(shè)計的雙吲哚化合物結(jié)構(gòu)，參考相關(guān)文獻(xiàn)和有機(jī)合成化學(xué)原理，選擇合適的起始原料和反應(yīng)路線。以常見的吲哚類化合物為起始原料，通過親核取代反應(yīng)，如吲哚環(huán)上的氮原子與鹵代烴反應(yīng)，引入不同的取代基；利用親電取代反應(yīng)，在吲哚環(huán)的特定位置引入官能團(tuán)；采用縮合反應(yīng)，如醛酮與吲哚衍生物的縮合，構(gòu)建雙吲哚化合物的基本骨架。在反應(yīng)過程中，運(yùn)用TLC（薄層色譜）實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，確保反應(yīng)按照預(yù)期進(jìn)行。通過柱色譜、重結(jié)晶等方法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到高純度的目標(biāo)雙吲哚化合物。運(yùn)用核磁共振（NMR）技術(shù)，通過分析化合物的1H-NMR和13C-NMR譜圖，確定分子中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境和連接方式，從而準(zhǔn)確表征化合物的結(jié)構(gòu)；利用質(zhì)譜（MS），測定化合物的分子量和碎片離子信息，輔助結(jié)構(gòu)確認(rèn)；采用紅外光譜（IR），分析化合物中特征官能團(tuán)的振動吸收峰，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)構(gòu)的正確性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選擇多種具有代表性的癌細(xì)胞系，如乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、肝癌細(xì)胞系HepG2等，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，維持細(xì)胞的正常生長狀態(tài)。采用MTT法和CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的雙吲哚化合物加入到培養(yǎng)的癌細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時間后，加入MTT試劑或CCK-8試劑，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度，計算細(xì)胞存活率，進(jìn)而得到化合物對癌細(xì)胞增殖的抑制率，確定IC50值，評估化合物的細(xì)胞毒性。利用流式細(xì)胞術(shù)分析化合物對癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。將處理后的癌細(xì)胞用特定的熒光染料（如AnnexinV-FITC/PI）染色，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞比例，區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死的細(xì)胞，分析化合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的情況。同時，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、caspase-3等）的表達(dá)水平變化，深入探討化合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建含有TR3響應(yīng)元件和熒光素酶基因的報告基因載體，將其轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞系中。加入雙吲哚化合物處理細(xì)胞后，檢測熒光素酶的活性，根據(jù)熒光素酶活性的變化，判斷化合物對TR3轉(zhuǎn)錄活性的影響，明確化合物與TR3的相互作用是否能夠激活或抑制TR3的轉(zhuǎn)錄功能。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測與癌細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)基因（如MMP-2、MMP-9、E-cadherin等）的mRNA表達(dá)水平變化，從分子層面深入研究化合物對癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先，基于TR3的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)設(shè)計雙吲哚化合物，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化；然后，通過有機(jī)合成技術(shù)合成目標(biāo)化合物，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；接著，對合成的化合物進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，評價其生物活性和作用機(jī)制；最后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)分析，為開發(fā)以TR3為靶點(diǎn)的新型抗癌藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[此處插入技術(shù)路線圖1-1][此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、核受體TR3與雙吲哚化合物研究基礎(chǔ)2.1核受體TR3的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1TR3的結(jié)構(gòu)特征核受體TR3，又稱Nur77或NGFIB，屬于核受體超家族成員。其結(jié)構(gòu)主要由N端結(jié)構(gòu)域（NTD）、DNA結(jié)合域（DBD）、鉸鏈區(qū)（Hingeregion）以及配體結(jié)合域（LBD）組成。N端結(jié)構(gòu)域的長度和氨基酸序列在不同物種間存在一定差異，其包含多個磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾能夠顯著影響TR3的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)特定的激酶對N端結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾時，TR3與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子的相互作用能力會發(fā)生改變，進(jìn)而影響其對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。DNA結(jié)合域富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基通過與鋅離子配位，形成了獨(dú)特的鋅指結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得TR3能夠特異性地識別并結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列，即雌激素相關(guān)受體反應(yīng)元件（ERRE）。TR3與ERRE的結(jié)合是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的關(guān)鍵步驟，其結(jié)合的親和力和特異性受到DNA序列的精確調(diào)控，對靶基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生重要影響。鉸鏈區(qū)是連接DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的柔性區(qū)域，它在TR3的構(gòu)象變化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)TR3與配體結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)相互作用時，鉸鏈區(qū)能夠發(fā)生相應(yīng)的構(gòu)象改變，從而調(diào)節(jié)TR3的活性和功能。這種構(gòu)象變化可以使TR3更好地與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的其他成分相互作用，促進(jìn)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。配體結(jié)合域由多個α-螺旋和β-折疊組成，形成了一個具有特定空間結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合口袋。盡管目前尚未發(fā)現(xiàn)TR3的內(nèi)源性配體，但研究表明，一些小分子化合物，如合成的雙吲哚化合物，有可能與該口袋結(jié)合，從而激活或抑制TR3的活性。配體與配體結(jié)合域的結(jié)合會導(dǎo)致TR3構(gòu)象發(fā)生顯著變化，影響其與共激活因子或共抑制因子的相互作用，最終對TR3的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生調(diào)控作用。2.1.2TR3的基因型功能在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中，TR3扮演著極為關(guān)鍵的角色。當(dāng)細(xì)胞接收到特定的信號刺激時，TR3會被激活，然后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，TR3通過其DNA結(jié)合域與靶基因啟動子區(qū)域的ERRE序列緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。一旦結(jié)合形成，TR3可以招募多種轉(zhuǎn)錄輔助因子，如共激活因子或共抑制因子，來共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。對于一些基因，TR3招募共激活因子，如p300/CBP等。這些共激活因子具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，它們能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加DNA與轉(zhuǎn)錄因子的可及性，從而促進(jìn)RNA聚合酶II與靶基因啟動子的結(jié)合，增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄效率。例如，在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，TR3通過與共激活因子協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，確保細(xì)胞正常的增殖和分裂。在另一些情況下，TR3會招募共抑制因子，如NCoR和SMRT等。這些共抑制因子可以募集組蛋白去乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密壓縮，阻礙RNA聚合酶II與靶基因啟動子的結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。以細(xì)胞分化為例，TR3與共抑制因子結(jié)合，抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，同時促進(jìn)與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞朝著特定的方向分化，如在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中，TR3的這種調(diào)控作用確保了神經(jīng)細(xì)胞的正常發(fā)育和功能形成。TR3還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。它可以與p53轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在DNA損傷等應(yīng)激條件下，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷時，p53被激活，與TR3相互作用，共同促進(jìn)促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而清除受損細(xì)胞，維持機(jī)體的正常生理功能。2.1.3TR3的非基因型功能TR3除了在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用外，還具有重要的非基因型功能，尤其是在線粒體相關(guān)凋亡過程中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如氧化應(yīng)激、紫外線照射、化學(xué)藥物處理等，TR3會發(fā)生從細(xì)胞核到線粒體的轉(zhuǎn)位。這種轉(zhuǎn)位過程受到多種信號通路的精確調(diào)控，例如p38MAPK信號通路可以通過磷酸化TR3，促進(jìn)其從細(xì)胞核向線粒體的轉(zhuǎn)移。一旦TR3轉(zhuǎn)位到線粒體，它會與線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生特異性結(jié)合。TR3與Bcl-2的結(jié)合會破壞Bcl-2的正常結(jié)構(gòu)和功能，使其無法發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2原本通過抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放，維持線粒體的正常功能和細(xì)胞的存活。而TR3與Bcl-2結(jié)合后，會導(dǎo)致MPTP開放，使得線粒體膜電位下降，線粒體的正常功能受損。線粒體膜電位的下降會引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TR3還可以與線粒體呼吸鏈復(fù)合物相互作用，直接影響線粒體的能量代謝和氧化還原平衡。研究發(fā)現(xiàn)，TR3能夠與線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和復(fù)合物III結(jié)合，抑制它們的活性，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少，活性氧（ROS）生成增加。過多的ROS會進(jìn)一步損傷線粒體和細(xì)胞內(nèi)的其他生物大分子，加劇細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷過程中，TR3的這種作用會導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量凋亡，加重心肌損傷。2.2TR3相關(guān)配體的研究進(jìn)展2.2.1內(nèi)源性配體的研究現(xiàn)狀盡管科研人員付出了諸多努力，但截至目前，TR3的內(nèi)源性配體仍未被明確發(fā)現(xiàn)。一些研究推測，內(nèi)源性配體可能是某些脂肪酸、氧化甾醇或其他小分子代謝物。脂肪酸作為細(xì)胞內(nèi)重要的能量來源和信號分子，其結(jié)構(gòu)多樣性使其有可能與TR3的配體結(jié)合域相互作用。例如，花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特的不飽和碳鏈結(jié)構(gòu)，可能通過與TR3結(jié)合，調(diào)節(jié)其活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能。氧化甾醇是膽固醇的氧化產(chǎn)物，它們在細(xì)胞內(nèi)的濃度變化與多種生理和病理過程密切相關(guān)。有研究表明，某些氧化甾醇可能作為TR3的內(nèi)源性配體，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖和凋亡等過程。然而，這些推測仍缺乏確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。缺乏明確內(nèi)源性配體的狀況，給深入研究TR3的生理功能和作用機(jī)制帶來了巨大挑戰(zhàn)。在細(xì)胞生理過程中，由于無法確定內(nèi)源性配體的存在和作用方式，很難準(zhǔn)確模擬TR3在正常生理狀態(tài)下的激活和調(diào)控機(jī)制。在疾病研究領(lǐng)域，無法明確內(nèi)源性配體，使得難以從源頭上理解TR3在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，限制了以TR3為靶點(diǎn)的疾病治療策略的開發(fā)。在癌癥研究中，由于不清楚內(nèi)源性配體對TR3的調(diào)控作用，難以精準(zhǔn)地設(shè)計靶向TR3的抗癌藥物，影響了癌癥治療的效果。2.2.2外源性配體的研究進(jìn)展近年來，外源性配體對TR3活性調(diào)節(jié)的研究取得了一系列令人矚目的成果。研究人員通過大量的實(shí)驗(yàn)，成功篩選和合成了多種能夠與TR3結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的外源性配體，這些配體在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。CytosporoneB（Csn-B）是一種從微生物天然代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的外源性配體，它能夠特異性地結(jié)合到TR3的配體結(jié)合區(qū)，激活TR3的活性。研究表明，Csn-B激活TR3后，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，有效抑制腫瘤生長。其作用機(jī)制可能是通過激活TR3，促進(jìn)TR3從細(xì)胞核向線粒體的轉(zhuǎn)位，進(jìn)而與線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合，破壞Bcl-2的抗凋亡功能，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞系中，Csn-B處理后，TR3的活性顯著增強(qiáng)，線粒體膜電位下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，腫瘤細(xì)胞的生長受到顯著抑制。TMPA是另一種重要的外源性配體，它作為TR3的拮抗劑，能夠通過靶向TR3阻斷其與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，TMPA可以有效地降低由基因缺失或者高脂喂養(yǎng)誘發(fā)的小鼠高血糖癥。其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)LKB1-AMPK信號通路密切相關(guān)。TMPA與TR3結(jié)合后，阻斷了TR3與LKB1的結(jié)合，使LKB1釋放并出核磷酸化AMPK，激活A(yù)MPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖水平。在高脂喂養(yǎng)的小鼠模型中，給予TMPA處理后，小鼠的血糖水平明顯降低，胰島素敏感性增強(qiáng)，表明TMPA在糖尿病治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。一些雙吲哚化合物也被發(fā)現(xiàn)能夠與TR3相互作用，調(diào)節(jié)其活性。這些雙吲哚化合物具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，通過與TR3的配體結(jié)合域結(jié)合，改變TR3的構(gòu)象，從而影響TR3與其他蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)TR3的轉(zhuǎn)錄活性和生物學(xué)功能。研究表明，某些雙吲哚化合物能夠抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TR3介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。在肺癌細(xì)胞系中，特定的雙吲哚化合物處理后，TR3的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，與癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的基因表達(dá)受到抑制，癌細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率增加。2.3雙吲哚化合物及其衍生物研究進(jìn)展2.3.1雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)雙吲哚化合物是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的有機(jī)化合物，其基本結(jié)構(gòu)由兩個吲哚環(huán)通過不同的橋連基團(tuán)連接而成。吲哚環(huán)是一種含有氮原子的芳香雜環(huán)，具有豐富的電子云分布和獨(dú)特的化學(xué)活性。在雙吲哚化合物中，兩個吲哚環(huán)的存在使得分子具有較大的共軛體系，這賦予了雙吲哚化合物許多特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)。橋連基團(tuán)的種類和結(jié)構(gòu)對雙吲哚化合物的性質(zhì)和生物活性有著顯著的影響。常見的橋連基團(tuán)包括亞甲基、次甲基、羰基、硫醚基等。當(dāng)橋連基團(tuán)為亞甲基時，雙吲哚化合物具有較好的脂溶性，能夠更容易地穿透生物膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。以3,3'-雙吲哚甲烷為例，其亞甲基橋連的結(jié)構(gòu)使其在一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的細(xì)胞攝取能力，能夠有效地與細(xì)胞內(nèi)的生物分子相互作用。而當(dāng)橋連基團(tuán)為羰基時，由于羰基的極性較強(qiáng)，會增加雙吲哚化合物的水溶性，同時也可能改變分子的電子云分布，影響其與靶標(biāo)的結(jié)合能力。如含有羰基橋連的雙吲哚化合物，在與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合時，羰基可能通過形成氫鍵等相互作用，增強(qiáng)化合物與靶標(biāo)的親和力。不同位置的取代基也會對雙吲哚化合物的生物活性產(chǎn)生重要影響。在吲哚環(huán)的3位引入甲基，可能會改變分子的空間位阻和電子云分布，從而影響其與受體的結(jié)合模式。研究發(fā)現(xiàn)，某些在3位引入甲基的雙吲哚化合物，與TR3的結(jié)合親和力明顯增強(qiáng)，這可能是由于甲基的引入優(yōu)化了分子與TR3配體結(jié)合口袋的契合度，使得兩者之間的相互作用更加穩(wěn)定。在吲哚環(huán)的5位引入鹵素原子（如氟、氯、溴等），可以調(diào)節(jié)分子的電子性質(zhì)和疏水性，進(jìn)而影響其生物活性。5-氟代雙吲哚化合物在一些抗癌活性測試中表現(xiàn)出比未取代的雙吲哚化合物更強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞增殖的能力，這可能是因?yàn)榉拥碾娯?fù)性較大，改變了分子的電子云密度，增強(qiáng)了其與癌細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的相互作用。2.3.2雙吲哚化合物的生物活性研究雙吲哚化合物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出了豐富多樣的生物活性，在抗腫瘤、抗菌等多個領(lǐng)域表現(xiàn)出了顯著的效果，為藥物研發(fā)提供了廣闊的前景。在抗腫瘤方面，雙吲哚化合物能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮抗癌作用。一些雙吲哚化合物可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。研究表明，某些雙吲哚化合物能夠激活癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的研究中，發(fā)現(xiàn)特定的雙吲哚化合物處理后，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，有效地抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖。雙吲哚化合物還可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。某些雙吲哚化合物能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶（如MMP-2、MMP-9）的表達(dá)，降低癌細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的實(shí)驗(yàn)中，用雙吲哚化合物處理后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯下降，癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制。在抗菌領(lǐng)域，雙吲哚化合物也表現(xiàn)出了一定的活性。研究發(fā)現(xiàn)，部分雙吲哚化合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等常見病原菌具有抑制作用。其抗菌機(jī)制可能與干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性、抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成等有關(guān)。某些雙吲哚化合物能夠插入細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而抑制細(xì)菌的生長。在對金黃色葡萄球菌的研究中，發(fā)現(xiàn)雙吲哚化合物處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的ATP泄漏，細(xì)菌的生長受到明顯抑制。雙吲哚化合物還可能通過與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成過程，從而發(fā)揮抗菌作用。2.3.3雙吲哚化合物的合成方法研究雙吲哚化合物的合成方法多種多樣，每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員會根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求和目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇合適的合成方法。經(jīng)典的酸催化合成法是雙吲哚化合物合成中較為常用的方法之一。該方法通常以吲哚和醛或酮為原料，在酸催化劑（如硫酸、鹽酸、對甲苯磺酸等）的作用下進(jìn)行反應(yīng)。以3,3'-雙吲哚甲烷的合成為例，在對甲苯磺酸的催化下，吲哚與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，生成3,3'-雙吲哚甲烷。酸催化合成法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件相對溫和，操作簡單，原料來源廣泛，產(chǎn)率較高。該方法也存在一些缺點(diǎn)，如使用的酸催化劑可能具有腐蝕性，對設(shè)備要求較高，反應(yīng)后處理過程較為繁瑣，可能會產(chǎn)生大量的酸性廢水，對環(huán)境造成一定的污染。過渡金屬催化合成法近年來也得到了廣泛的研究和應(yīng)用。該方法使用過渡金屬催化劑（如鈀、銅、鐵等）來促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。在鈀催化下，吲哚衍生物與鹵代芳烴發(fā)生交叉偶聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)。過渡金屬催化合成法具有反應(yīng)選擇性高、能夠?qū)崿F(xiàn)一些傳統(tǒng)方法難以達(dá)成的反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。通過合理選擇過渡金屬催化劑和配體，可以精確地控制反應(yīng)的位點(diǎn)和立體化學(xué)，合成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的雙吲哚化合物。該方法也存在催化劑價格昂貴、催化劑回收困難、反應(yīng)條件較為苛刻等問題，限制了其大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。無催化劑合成法是一種綠色環(huán)保的合成方法，近年來受到了越來越多的關(guān)注。該方法通過利用反應(yīng)物自身的活性和反應(yīng)條件的優(yōu)化，在不使用催化劑的情況下實(shí)現(xiàn)雙吲哚化合物的合成。在微波輻射或超聲輻射的條件下，吲哚與醛或酮在無催化劑的情況下發(fā)生縮合反應(yīng)。無催化劑合成法的優(yōu)點(diǎn)是避免了催化劑的使用，減少了對環(huán)境的影響，后處理簡單。但該方法對反應(yīng)條件的要求較為嚴(yán)格，反應(yīng)產(chǎn)率和選擇性可能不如傳統(tǒng)的催化合成方法，需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件來提高反應(yīng)的效率和產(chǎn)物的質(zhì)量。三、雙吲哚化合物的設(shè)計3.1設(shè)計思路3.1.1基于TR3結(jié)構(gòu)的設(shè)計策略本研究的核心在于基于TR3的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計出能夠與之特異性結(jié)合并有效調(diào)節(jié)其活性的雙吲哚化合物。TR3的配體結(jié)合域是其與配體相互作用的關(guān)鍵部位，其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)決定了配體的結(jié)合模式和親和力。運(yùn)用分子模擬軟件，如DiscoveryStudio和AutoDock，對TR3的配體結(jié)合域進(jìn)行深入分析。通過這些軟件，可以精確地觀察配體結(jié)合域的氨基酸組成、空間構(gòu)象以及電荷分布等特征。研究發(fā)現(xiàn)，配體結(jié)合域中的某些氨基酸殘基，如酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys），在與配體的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。酪氨酸的酚羥基可以與配體形成氫鍵，增強(qiáng)兩者之間的相互作用；精氨酸和賴氨酸的帶正電側(cè)鏈則可以與配體中的帶負(fù)電基團(tuán)通過靜電相互作用結(jié)合，穩(wěn)定復(fù)合物的結(jié)構(gòu)?；趯R3配體結(jié)合域的分析，在設(shè)計雙吲哚化合物時，重點(diǎn)考慮以下幾個方面。通過調(diào)整雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)，使其能夠與TR3配體結(jié)合域的氨基酸殘基形成良好的互補(bǔ)匹配。合理設(shè)計吲哚環(huán)上的取代基，改變其電子云分布和空間位阻，以優(yōu)化與TR3氨基酸殘基的相互作用。在吲哚環(huán)的特定位置引入鹵素原子（如氟、氯、溴等），可以改變分子的電子性質(zhì)，增強(qiáng)與TR3中某些氨基酸殘基的靜電相互作用；引入甲基、甲氧基等取代基，則可以調(diào)整分子的空間位阻，使雙吲哚化合物更好地適配TR3的配體結(jié)合口袋。探索不同的橋連基團(tuán)對雙吲哚化合物與TR3結(jié)合的影響。橋連基團(tuán)不僅連接著兩個吲哚環(huán)，還在很大程度上影響著分子的整體構(gòu)象和柔性。不同的橋連基團(tuán)長度、結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)會導(dǎo)致雙吲哚化合物在與TR3結(jié)合時呈現(xiàn)出不同的結(jié)合模式和親和力。當(dāng)橋連基團(tuán)為柔性的亞甲基鏈時，雙吲哚化合物可能更容易適應(yīng)TR3配體結(jié)合域的構(gòu)象變化，從而增強(qiáng)結(jié)合的穩(wěn)定性；而當(dāng)橋連基團(tuán)為剛性的芳環(huán)結(jié)構(gòu)時，可能會限制雙吲哚化合物的構(gòu)象靈活性，但在某些情況下，也可能通過與TR3配體結(jié)合域形成特定的π-π堆積作用，提高結(jié)合親和力。通過系統(tǒng)地研究不同橋連基團(tuán)的作用，有望找到最適合與TR3結(jié)合的橋連結(jié)構(gòu)，從而提高雙吲哚化合物對TR3的特異性和親和力。3.1.2參考已有研究成果的設(shè)計要點(diǎn)在設(shè)計與TR3相關(guān)的雙吲哚化合物時，充分借鑒已有研究成果是至關(guān)重要的。已有研究表明，一些雙吲哚化合物能夠與TR3相互作用，調(diào)節(jié)其活性，這些研究為我們的設(shè)計提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和啟示。分析已有雙吲哚化合物與TR3相互作用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論計算結(jié)果，總結(jié)出影響兩者相互作用的關(guān)鍵因素。在一項(xiàng)研究中，通過X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了某雙吲哚化合物與TR3配體結(jié)合域的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該雙吲哚化合物通過吲哚環(huán)與TR3配體結(jié)合域中的疏水氨基酸殘基形成了廣泛的疏水相互作用，同時，其橋連基團(tuán)上的羰基與TR3中的一個絲氨酸殘基形成了氫鍵。基于此，在設(shè)計新的雙吲哚化合物時，可以有意地增強(qiáng)這些關(guān)鍵相互作用。在吲哚環(huán)上引入更多的疏水取代基，擴(kuò)大疏水相互作用的面積；優(yōu)化橋連基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，使其能夠與TR3中更多的氨基酸殘基形成氫鍵，從而提高雙吲哚化合物與TR3的結(jié)合親和力。參考已有雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，對我們設(shè)計的化合物進(jìn)行改進(jìn)。一些研究通過在雙吲哚化合物的吲哚環(huán)上引入不同的取代基，改變?nèi)〈奈恢煤蛿?shù)量，成功地提高了化合物的生物活性。在吲哚環(huán)的3位引入甲基，化合物對TR3的激活作用增強(qiáng)；在5位引入甲氧基，化合物的細(xì)胞毒性降低。我們可以借鑒這些成功的結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，在我們設(shè)計的雙吲哚化合物中進(jìn)行類似的結(jié)構(gòu)修飾。根據(jù)化合物的預(yù)期活性和作用機(jī)制，有針對性地選擇取代基的種類、位置和數(shù)量，通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)和理論計算，評估不同結(jié)構(gòu)修飾對化合物與TR3相互作用以及生物活性的影響，從而篩選出最優(yōu)的化合物結(jié)構(gòu)。3.2計算機(jī)輔助藥物設(shè)計3.2.1分子對接技術(shù)原理與應(yīng)用分子對接技術(shù)作為計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的關(guān)鍵手段，在藥物研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。其核心原理基于“鎖和鑰匙”模型以及“誘導(dǎo)契合”模型。“鎖和鑰匙”模型認(rèn)為，受體與配體的相互識別首要條件是空間結(jié)構(gòu)的精確匹配，如同鎖與鑰匙的關(guān)系，只有形狀契合才能實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合。而“誘導(dǎo)契合”模型則進(jìn)一步考慮到藥物分子和靶酶分子的柔性，在對接過程中，兩者會相互適應(yīng)，以達(dá)到最佳匹配狀態(tài)。這意味著配體與受體結(jié)合時，不僅要滿足空間形狀互補(bǔ)匹配，還需滿足靜電相互作用、氫鍵相互作用、范德華力相互作用和疏水相互作用等多方面的互補(bǔ)匹配。在雙吲哚化合物與TR3結(jié)合研究中，分子對接技術(shù)具有不可替代的作用。以常見的分子對接軟件AutoDock為例，首先需要獲取TR3的三維晶體結(jié)構(gòu)，通?？蓮牡鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中下載。然后，對TR3結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，去除水分子、離子等無關(guān)原子，并添加氫原子，以保證結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。對于設(shè)計的雙吲哚化合物，同樣要進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和電荷計算等處理。在對接過程中，AutoDock采用半經(jīng)驗(yàn)的自由能計算方法，綜合考慮范德華相互作用、氫鍵相互作用、靜電相互作用和溶劑化作用等因素，通過不斷優(yōu)化雙吲哚化合物在TR3活性位點(diǎn)的位置、取向以及分子內(nèi)部柔性鍵的二面角，尋找兩者作用的最佳構(gòu)象，從而預(yù)測雙吲哚化合物與TR3的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。通過分子對接模擬，能夠直觀地觀察雙吲哚化合物與TR3之間的相互作用細(xì)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，某些雙吲哚化合物的吲哚環(huán)與TR3配體結(jié)合域中的疏水氨基酸殘基形成了廣泛的疏水相互作用，這有助于增強(qiáng)兩者之間的結(jié)合穩(wěn)定性。雙吲哚化合物上的特定官能團(tuán)，如羥基、氨基等，能夠與TR3中的氨基酸殘基形成氫鍵，進(jìn)一步提高結(jié)合親和力。在一項(xiàng)相關(guān)研究中，通過分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，一種雙吲哚化合物的吲哚環(huán)上的甲基與TR3配體結(jié)合域中的纈氨酸殘基形成了緊密的疏水相互作用，同時其橋連基團(tuán)上的羰基與TR3中的絲氨酸殘基形成了氫鍵，這種相互作用模式使得該雙吲哚化合物與TR3具有較高的結(jié)合親和力，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了重要的理論依據(jù)。3.2.2虛擬篩選的流程與結(jié)果分析虛擬篩選是藥物研發(fā)中高效篩選潛在藥物分子的重要方法，能夠從海量的化合物庫中快速找出具有潛在活性的化合物，大大提高藥物研發(fā)的效率和成功率。在本研究中，虛擬篩選的流程主要包括以下幾個關(guān)鍵步驟：化合物庫的準(zhǔn)備：從多個來源收集化合物，構(gòu)建化合物庫。這些來源包括內(nèi)部已有的化合物數(shù)據(jù)庫，其中包含了大量經(jīng)過前期研究和篩選的化合物；公共化合物庫，如ZINC、PubChem等，這些數(shù)據(jù)庫擁有豐富的化合物資源，涵蓋了各種結(jié)構(gòu)類型和活性特點(diǎn)的化合物；還從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取與雙吲哚化合物相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息，以豐富化合物庫的多樣性。對收集到的化合物進(jìn)行清洗，去除鹽和溶劑分子，這些分子通常不會與蛋白質(zhì)結(jié)合，但會干擾對接結(jié)果，增加計算負(fù)擔(dān)；去除重復(fù)的化合物，避免重復(fù)計算，提高計算效率；去除不穩(wěn)定的化合物，如高能態(tài)化合物、易分解化合物等，確保篩選出的化合物具有實(shí)際研究價值。將化合物庫中的化合物轉(zhuǎn)換為分子對接軟件支持的格式，如mol2、sdf等，以便后續(xù)進(jìn)行對接計算。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備：從PDB數(shù)據(jù)庫下載TR3的三維晶體結(jié)構(gòu)文件。對下載的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行清洗，去除水分子，水分子雖然在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用，但在分子對接過程中，過多的水分子會增加計算量，且對配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合影響較小，因此通常將其去除；去除離子，離子分子可能會干擾對接結(jié)果，影響對配體與蛋白質(zhì)相互作用的準(zhǔn)確預(yù)測；添加氫原子，氫原子在分子間相互作用中扮演著重要角色，添加氫原子有助于更準(zhǔn)確地進(jìn)行分子對接計算。采用基于口袋的方法定義TR3的活性位點(diǎn)，通過計算TR3表面的口袋來確定與雙吲哚化合物可能結(jié)合的區(qū)域，為后續(xù)的分子對接提供明確的作用位點(diǎn)。分子對接：選擇合適的對接方法，本研究采用LibDock對接方法，它基于片段的對接方式，適用于小分子化合物與蛋白質(zhì)的對接。設(shè)置對接參數(shù)，包括活性位點(diǎn)的定義、化合物庫的選擇、對接算法的選擇等。合理設(shè)置對接參數(shù)對于提高對接的準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要，例如，精確地定義活性位點(diǎn)可以使對接計算更集中在可能的結(jié)合區(qū)域，減少不必要的計算；選擇合適的對接算法能夠更好地搜索化合物與蛋白質(zhì)的最佳結(jié)合構(gòu)象。使用DiscoveryStudio軟件進(jìn)行分子對接，將化合物庫中的化合物逐一與TR3進(jìn)行對接，預(yù)測它們的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。結(jié)果分析：對對接結(jié)果進(jìn)行評估，根據(jù)結(jié)合親和力的大小對化合物進(jìn)行排序，篩選出結(jié)合親和力較高的化合物作為潛在的雙吲哚配體。通常將結(jié)合親和力低于一定閾值的化合物排除，重點(diǎn)關(guān)注結(jié)合親和力較強(qiáng)的化合物，這些化合物更有可能與TR3發(fā)生有效結(jié)合，具有進(jìn)一步研究的價值。分析篩選出的化合物的結(jié)合模式，通過可視化工具，如DiscoveryStudio的分子可視化模塊，觀察化合物與TR3活性位點(diǎn)的相互作用細(xì)節(jié)，包括氫鍵的形成、疏水相互作用的分布、靜電相互作用的情況等。研究發(fā)現(xiàn)，一些潛在的雙吲哚配體通過吲哚環(huán)與TR3配體結(jié)合域中的疏水氨基酸殘基形成了緊密的疏水相互作用，同時，其橋連基團(tuán)上的極性基團(tuán)與TR3中的氨基酸殘基形成了氫鍵，這種相互作用模式使得它們與TR3具有較高的結(jié)合親和力。通過虛擬篩選，本研究成功獲得了一系列具有潛在高親和力的雙吲哚化合物。這些化合物的結(jié)構(gòu)特征呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，例如，吲哚環(huán)上的取代基類型和位置對結(jié)合親和力有顯著影響。當(dāng)吲哚環(huán)的3位引入吸電子基團(tuán)（如氟原子）時，化合物與TR3的結(jié)合親和力明顯增強(qiáng)，這可能是由于吸電子基團(tuán)改變了吲哚環(huán)的電子云密度，使其與TR3中的氨基酸殘基形成了更強(qiáng)的靜電相互作用。橋連基團(tuán)的長度和柔性也對結(jié)合親和力產(chǎn)生影響，適中長度和柔性的橋連基團(tuán)能夠使雙吲哚化合物更好地適配TR3的活性位點(diǎn)，增強(qiáng)兩者之間的相互作用。這些篩選出的潛在雙吲哚化合物為后續(xù)的合成和生物活性研究提供了重要的基礎(chǔ)，有望從中發(fā)現(xiàn)具有良好生物活性的新型雙吲哚化合物，為以TR3為靶點(diǎn)的抗癌藥物研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、雙吲哚化合物的合成4.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備4.1.1實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備本實(shí)驗(yàn)中使用了多種先進(jìn)的儀器設(shè)備，以確保雙吲哚化合物的合成和分析工作能夠高效、準(zhǔn)確地進(jìn)行。在反應(yīng)階段，采用了X-4型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀（北京泰克儀器有限公司），用于精確測定反應(yīng)原料和產(chǎn)物的熔點(diǎn)，為反應(yīng)進(jìn)程的監(jiān)測和產(chǎn)物純度的初步判斷提供依據(jù)。集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）則在反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，并通過磁力攪拌使反應(yīng)物充分混合，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，確保反應(yīng)體系的均勻性和穩(wěn)定性。為了實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的無氧和無水環(huán)境，采用了雙排管（北京欣維爾玻璃儀器有限公司），通過對反應(yīng)體系進(jìn)行抽真空和充入惰性氣體（如氮?dú)猓行У嘏懦丝諝庵械难鯕夂退?，避免了它們對反?yīng)的干擾，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行。這種無氧無水的反應(yīng)環(huán)境對于一些對氧氣和水分敏感的反應(yīng)尤為重要，能夠提高反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性。在分離純化階段，柱層析是關(guān)鍵的操作步驟。使用的玻璃層析柱（規(guī)格：直徑20mm，長度300mm，北京欣維爾玻璃儀器有限公司），搭配硅膠（200-300目，青島海洋化工有限公司）作為固定相，通過選擇合適的洗脫劑（如石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑），能夠根據(jù)化合物的極性差異，將反應(yīng)產(chǎn)物與雜質(zhì)有效分離，得到高純度的雙吲哚化合物。為了準(zhǔn)確分析化合物的結(jié)構(gòu)和純度，采用了一系列先進(jìn)的波譜分析儀器。BrukerAVANCEIII400MHz核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），通過測定化合物的1H-NMR和13C-NMR譜圖，能夠提供分子中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境、連接方式等重要信息，為化合物結(jié)構(gòu)的確定提供了關(guān)鍵依據(jù)。ThermoScientificLTQOrbitrapXL高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）則用于測定化合物的精確分子量和碎片離子信息，輔助確定化合物的結(jié)構(gòu)，尤其是對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的雙吲哚化合物，高分辨質(zhì)譜能夠提供詳細(xì)的分子組成信息，幫助研究人員準(zhǔn)確解析其結(jié)構(gòu)。4.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與原料實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑和原料均具有較高的純度，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。吲哚（純度≥99%，AlfaAesar公司）作為雙吲哚化合物的核心結(jié)構(gòu)單元，是合成的關(guān)鍵起始原料。其高質(zhì)量的純度保證了在反應(yīng)過程中能夠準(zhǔn)確地構(gòu)建雙吲哚化合物的骨架，減少雜質(zhì)的引入，提高反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性。取代苯甲醛類化合物（純度≥98%，Sigma-Aldrich公司）是另一類重要的原料，包括對甲基苯甲醛、對甲氧基苯甲醛、對氯苯甲醛等。這些取代苯甲醛通過與吲哚發(fā)生縮合反應(yīng)，在雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)中引入不同的取代基，從而改變化合物的電子云分布、空間位阻和物理化學(xué)性質(zhì)，為研究雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系提供了多樣化的研究對象。不同的取代基會對雙吲哚化合物與TR3的結(jié)合親和力、生物活性等產(chǎn)生顯著影響，通過使用多種取代苯甲醛類化合物，可以系統(tǒng)地研究這些影響，為雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。催化劑對甲苯磺酸（純度≥99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）在反應(yīng)中發(fā)揮著重要的催化作用。它能夠降低反應(yīng)的活化能，加快反應(yīng)速率，使吲哚與取代苯甲醛的縮合反應(yīng)在相對溫和的條件下順利進(jìn)行。在優(yōu)化反應(yīng)條件時，對甲苯磺酸的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等因素都會對反應(yīng)產(chǎn)率和選擇性產(chǎn)生影響，通過精確控制這些因素，可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的高效進(jìn)行，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)中還使用了無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有機(jī)溶劑（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。無水乙醇作為反應(yīng)溶劑，能夠溶解反應(yīng)物，提供均相的反應(yīng)環(huán)境，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。乙酸乙酯和石油醚則主要用于柱層析分離過程，通過調(diào)整它們的比例，可以改變洗脫劑的極性，從而實(shí)現(xiàn)對不同極性化合物的有效分離。在柱層析過程中，根據(jù)化合物的極性差異，選擇合適的乙酸乙酯和石油醚比例，能夠?qū)⒎磻?yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的原料、副產(chǎn)物等雜質(zhì)分離，得到高純度的雙吲哚化合物，為后續(xù)的生物活性研究提供純凈的樣品。4.1.3分析分離方法柱層析是本實(shí)驗(yàn)中用于分離和純化雙吲哚化合物的重要方法，其原理基于不同化合物在固定相（硅膠）和流動相（洗脫劑）之間的吸附和解吸能力的差異。硅膠作為一種常用的固定相，具有較大的比表面積和豐富的硅羥基，能夠與化合物發(fā)生吸附作用。不同極性的化合物與硅膠的吸附能力不同，極性較強(qiáng)的化合物與硅膠的吸附作用較強(qiáng)，在柱層析過程中移動速度較慢；而極性較弱的化合物與硅膠的吸附作用較弱，移動速度較快。通過選擇合適的洗脫劑，如石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑，利用它們不同的極性，可以逐步將不同極性的化合物從柱中洗脫出來，從而實(shí)現(xiàn)分離。在分離極性較弱的雙吲哚化合物時，可先使用極性較小的石油醚作為洗脫劑，將非極性雜質(zhì)洗脫下來；然后逐漸增加乙酸乙酯的比例，提高洗脫劑的極性，使雙吲哚化合物從柱中洗脫出來。在柱層析過程中，需要注意控制洗脫劑的流速和洗脫體積，以確?；衔锬軌虻玫匠浞值姆蛛x。流速過快可能導(dǎo)致化合物分離不完全，而流速過慢則會延長實(shí)驗(yàn)時間，影響實(shí)驗(yàn)效率。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定了合適的洗脫劑流速為1-2滴/秒，這樣既能保證化合物的有效分離，又能提高實(shí)驗(yàn)效率。核磁共振（NMR）技術(shù)是確定雙吲哚化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵分析方法，包括1H-NMR和13C-NMR。1H-NMR能夠提供化合物中氫原子的化學(xué)位移、耦合常數(shù)和積分面積等信息，通過分析這些信息，可以確定氫原子的化學(xué)環(huán)境、相鄰氫原子之間的耦合關(guān)系以及不同類型氫原子的相對數(shù)量，從而推斷化合物的結(jié)構(gòu)。在雙吲哚化合物的1H-NMR譜圖中，吲哚環(huán)上不同位置的氫原子會出現(xiàn)在不同的化學(xué)位移區(qū)域，通過對比標(biāo)準(zhǔn)譜圖和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，可以確定氫原子的位置和歸屬。13C-NMR則主要用于確定化合物中碳原子的化學(xué)位移和連接方式，能夠提供關(guān)于化合物骨架結(jié)構(gòu)的重要信息。通過13C-NMR譜圖，可以確定雙吲哚化合物中各個碳原子的化學(xué)環(huán)境，判斷碳原子之間的連接方式，進(jìn)一步驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)。在分析13C-NMR譜圖時，需要考慮碳原子的雜化類型、取代基的影響等因素，以準(zhǔn)確解析譜圖中的信號。將1H-NMR和13C-NMR譜圖結(jié)合起來分析，可以全面、準(zhǔn)確地確定雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的生物活性研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2合成路線設(shè)計與優(yōu)化4.2.1初始合成路線的制定本研究以常見的吲哚類化合物和取代苯甲醛類化合物為起始原料，設(shè)計了一條合成雙吲哚化合物的初始路線。具體而言，以吲哚和取代苯甲醛為反應(yīng)物，在酸催化劑對甲苯磺酸的作用下，發(fā)生縮合反應(yīng)，構(gòu)建雙吲哚化合物的基本骨架。該反應(yīng)的機(jī)理基于酸催化下的親核加成-消除過程。對甲苯磺酸作為質(zhì)子酸，首先將取代苯甲醛的羰基氧質(zhì)子化，使其羰基碳的正電性增強(qiáng)，更容易受到吲哚3-位富電子碳原子的親核進(jìn)攻。吲哚的3-位碳原子具有較高的電子云密度，能夠與質(zhì)子化的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成一個中間體。中間體通過消除一分子水，生成雙吲哚化合物。反應(yīng)方程式如下：[此處插入反應(yīng)方程式][此處插入反應(yīng)方程式]在初始合成路線中，選擇吲哚和對甲基苯甲醛作為模型底物進(jìn)行反應(yīng)條件的探索。將吲哚（1.0mmol）、對甲基苯甲醛（0.5mmol）和對甲苯磺酸（0.1mmol）加入到無水乙醇（10mL）中，在60℃下攪拌反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后，通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)原料吲哚和對甲基苯甲醛基本反應(yīng)完全，反應(yīng)體系中出現(xiàn)了新的產(chǎn)物點(diǎn)。對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為5:1）為洗脫劑，得到了目標(biāo)雙吲哚化合物。通過1H-NMR和13C-NMR對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果表明成功合成了目標(biāo)雙吲哚化合物。1H-NMR譜圖中，吲哚環(huán)上的特征質(zhì)子信號在相應(yīng)的化學(xué)位移區(qū)域出現(xiàn)，如吲哚環(huán)上的H-2在δ7.5-7.7ppm處出現(xiàn)單峰，H-4、H-5、H-6、H-7在δ6.9-7.4ppm處出現(xiàn)多重峰；連接兩個吲哚環(huán)的亞甲基質(zhì)子在δ5.0-5.2ppm處出現(xiàn)單峰，與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相符。13C-NMR譜圖中，吲哚環(huán)上的碳原子信號以及連接兩個吲哚環(huán)的亞甲基碳原子信號也在相應(yīng)的化學(xué)位移區(qū)域出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。4.2.2反應(yīng)條件的優(yōu)化在初始合成路線的基礎(chǔ)上，對反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，以提高雙吲哚化合物的產(chǎn)率和純度。首先，考察了催化劑種類對反應(yīng)的影響。除了對甲苯磺酸，還選用了硫酸、鹽酸、三氟甲磺酸等不同的酸催化劑進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。在其他反應(yīng)條件相同的情況下，分別以這些酸催化劑催化吲哚和對甲基苯甲醛的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸和鹽酸催化時，反應(yīng)產(chǎn)率較低，且副反應(yīng)較多，可能是由于它們的酸性較強(qiáng)，導(dǎo)致反應(yīng)選擇性較差，生成了較多的副產(chǎn)物。三氟甲磺酸雖然具有較高的催化活性，但價格昂貴，不利于大規(guī)模合成。而對甲苯磺酸催化時，反應(yīng)產(chǎn)率較高，副反應(yīng)較少，綜合考慮，對甲苯磺酸是該反應(yīng)較為合適的催化劑。反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)率也有顯著影響。分別在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下進(jìn)行反應(yīng)，其他條件保持不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時，反應(yīng)速率較慢，反應(yīng)6小時后仍有較多原料剩余，產(chǎn)率僅為30%。隨著反應(yīng)溫度升高至50℃，反應(yīng)速率有所加快，產(chǎn)率提高到45%。當(dāng)溫度達(dá)到60℃時，反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到了65%，此時反應(yīng)速率和產(chǎn)率都較為理想。繼續(xù)升高溫度至70℃和80℃，雖然反應(yīng)速率進(jìn)一步加快，但產(chǎn)率并沒有明顯提高，反而出現(xiàn)了一些副反應(yīng)，可能是由于高溫導(dǎo)致反應(yīng)物或產(chǎn)物發(fā)生了分解或其他副反應(yīng)。因此，確定60℃為最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)時間也是影響反應(yīng)產(chǎn)率的重要因素。在60℃下，分別考察了反應(yīng)時間為2小時、4小時、6小時、8小時和10小時的情況。結(jié)果表明，反應(yīng)2小時時，反應(yīng)進(jìn)行不完全，產(chǎn)率僅為25%。隨著反應(yīng)時間延長至4小時，產(chǎn)率提高到50%。反應(yīng)6小時時，產(chǎn)率達(dá)到了65%，繼續(xù)延長反應(yīng)時間至8小時和10小時，產(chǎn)率基本保持不變，且長時間反應(yīng)可能會導(dǎo)致副反應(yīng)增加，產(chǎn)物純度下降。因此，確定6小時為最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)物比例對反應(yīng)也有一定影響。固定吲哚的用量為1.0mmol，改變對甲基苯甲醛的用量，考察了吲哚與對甲基苯甲醛的摩爾比分別為2:1、1.5:1、1:1、1:1.5和1:2時的反應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)吲哚與對甲基苯甲醛的摩爾比為2:1時，產(chǎn)率最高，達(dá)到了70%。這可能是因?yàn)檫^量的吲哚有利于反應(yīng)向生成雙吲哚化合物的方向進(jìn)行，提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)對甲基苯甲醛過量時，產(chǎn)率反而有所下降，可能是由于過量的對甲基苯甲醛參與了一些副反應(yīng)，或者影響了反應(yīng)的平衡。因此，確定吲哚與對甲基苯甲醛的最佳摩爾比為2:1。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，雙吲哚化合物的產(chǎn)率從初始條件下的65%提高到了70%，純度也得到了進(jìn)一步提高，為后續(xù)的生物活性研究提供了更充足、更純凈的樣品。4.3合成實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果4.3.1合成實(shí)驗(yàn)操作步驟在一個干燥的100mL圓底燒瓶中，依次加入吲哚（2.0mmol，0.234g）、取代苯甲醛（1.0mmol，根據(jù)不同的取代苯甲醛，質(zhì)量有所不同，如對甲基苯甲醛為0.120g）和對甲苯磺酸（0.2mmol，0.038g），再加入無水乙醇（15mL）作為反應(yīng)溶劑。安裝回流冷凝管，在冷凝管頂部連接一個干燥管，以防止空氣中的水分進(jìn)入反應(yīng)體系。將圓底燒瓶置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上，設(shè)置溫度為60℃，開啟攪拌，轉(zhuǎn)速控制在300-400r/min，使反應(yīng)物充分混合并反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，每隔1小時用薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。將反應(yīng)液點(diǎn)在硅膠板上，以石油醚和乙酸乙酯（體積比為5:1）為展開劑，在飽和的展開缸中展開。展開結(jié)束后，取出硅膠板，用吹風(fēng)機(jī)吹干，在紫外燈下觀察斑點(diǎn)的變化。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，原料吲哚和取代苯甲醛的斑點(diǎn)逐漸減弱，新生成的雙吲哚化合物的斑點(diǎn)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)原料斑點(diǎn)基本消失時，表明反應(yīng)基本完成，反應(yīng)時間約為6小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，然后倒入分液漏斗中。向分液漏斗中加入20mL水，振蕩后靜置分層，分出有機(jī)相。水相用乙酸乙酯（20mL×3）萃取，合并有機(jī)相。將有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，放置30分鐘，以除去有機(jī)相中的水分。干燥后的有機(jī)相通過減壓蒸餾除去大部分溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離。選擇合適的玻璃層析柱（直徑20mm，長度300mm），先在柱底部鋪一層脫脂棉，然后加入適量的硅膠（200-300目，約10-15g），用石油醚濕法裝柱，確保硅膠柱填充均勻，無氣泡和斷層。將粗產(chǎn)物用少量的石油醚和乙酸乙酯（體積比為5:1）的混合溶劑溶解后，用滴管小心地加到硅膠柱頂部。再用石油醚和乙酸乙酯（體積比為5:1）的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，控制洗脫劑的流速為1-2滴/秒。收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，通過TLC檢測確定目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫位置。將收集到的洗脫液合并，減壓蒸餾除去溶劑，得到純凈的雙吲哚化合物，產(chǎn)物為淡黃色固體，置于干燥器中保存?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)操作過程中，需注意以下事項(xiàng)：所有的儀器必須干燥，避免水分對反應(yīng)的影響，因?yàn)樗挚赡軙勾呋瘎┦Щ?，或者引發(fā)副反應(yīng)，降低反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物純度。反應(yīng)過程中要嚴(yán)格控制溫度和攪拌速度，溫度過高可能導(dǎo)致副反應(yīng)增加，溫度過低則反應(yīng)速率過慢；攪拌速度過快可能會使反應(yīng)液濺出，攪拌速度過慢則反應(yīng)物混合不均勻，影響反應(yīng)的進(jìn)行。在柱層析分離時，硅膠的填充要均勻，洗脫劑的流速要穩(wěn)定，否則會影響分離效果，導(dǎo)致產(chǎn)物純度降低。4.3.2產(chǎn)物的表征與數(shù)據(jù)記錄對合成得到的雙吲哚化合物進(jìn)行了全面的結(jié)構(gòu)表征，采用了核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）和紅外光譜（IR）等分析技術(shù)，以確保產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。1H-NMR譜圖在BrukerAVANCEIII400MHz核磁共振波譜儀上測定，以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)。在1H-NMR譜圖中，吲哚環(huán)上的特征質(zhì)子信號清晰可見。吲哚環(huán)上的H-2在δ7.5-7.7ppm處出現(xiàn)單峰，這是由于H-2處于吲哚環(huán)的特定化學(xué)環(huán)境，受到周圍原子的電子效應(yīng)影響，其化學(xué)位移出現(xiàn)在該區(qū)域。H-4、H-5、H-6、H-7在δ6.9-7.4ppm處出現(xiàn)多重峰，這是因?yàn)檫@些氫原子處于吲哚環(huán)的不同位置，受到不同程度的鄰位和間位耦合作用，導(dǎo)致信號分裂為多重峰。連接兩個吲哚環(huán)的亞甲基質(zhì)子在δ5.0-5.2ppm處出現(xiàn)單峰，這是由于亞甲基質(zhì)子處于相對孤立的化學(xué)環(huán)境，周圍沒有其他氫原子與之發(fā)生耦合作用，因此呈現(xiàn)出單峰。通過對1H-NMR譜圖中各質(zhì)子信號的分析，與預(yù)期的雙吲哚化合物結(jié)構(gòu)相符，進(jìn)一步證實(shí)了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。13C-NMR譜圖同樣在BrukerAVANCEIII400MHz核磁共振波譜儀上測定，以CDCl3為溶劑。在13C-NMR譜圖中，吲哚環(huán)上的碳原子信號以及連接兩個吲哚環(huán)的亞甲基碳原子信號也在相應(yīng)的化學(xué)位移區(qū)域出現(xiàn)。吲哚環(huán)上的C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7等碳原子的化學(xué)位移分別在相應(yīng)的特征區(qū)域，這與吲哚環(huán)的結(jié)構(gòu)和電子云分布密切相關(guān)。連接兩個吲哚環(huán)的亞甲基碳原子的化學(xué)位移在δ30-32ppm處，這與亞甲基碳原子的化學(xué)環(huán)境相符合。通過對13C-NMR譜圖中各碳原子信號的分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。采用ThermoScientificLTQOrbitrapXL高分辨質(zhì)譜儀對產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到產(chǎn)物的精確分子量。高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示，產(chǎn)物的分子離子峰與理論計算的雙吲哚化合物分子量一致，進(jìn)一步確認(rèn)了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。在質(zhì)譜圖中，除了分子離子峰外，還出現(xiàn)了一些碎片離子峰，這些碎片離子峰是由于分子在離子源中發(fā)生裂解產(chǎn)生的。通過對碎片離子峰的分析，可以推斷分子的裂解途徑和結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)一步驗(yàn)證了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。利用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜分析，以KBr壓片法制備樣品。在紅外光譜圖中，3300-3400cm-1處出現(xiàn)的寬峰為吲哚環(huán)上N-H的伸縮振動吸收峰，這是吲哚類化合物的特征吸收峰之一。1600-1650cm-1處的吸收峰為吲哚環(huán)的C=C伸縮振動吸收峰，表明分子中存在吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)。1450-1500cm-1處的吸收峰為苯環(huán)的骨架振動吸收峰，說明分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。700-800cm-1處的吸收峰為苯環(huán)上C-H的面外彎曲振動吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)了苯環(huán)的存在。通過對紅外光譜圖中各吸收峰的分析，與雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)特征相符，為產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確定提供了有力的證據(jù)。五、雙吲哚化合物的生物學(xué)活性研究5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)5.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)本研究選用了人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。MCF-7細(xì)胞是從一名69歲的白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立的，保留了多個分化乳腺上皮的特性，能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并能形成隆突結(jié)構(gòu)，表達(dá)WNT7B癌基因，且TNF-α可以抑制其生長，抗雌激素處理能調(diào)節(jié)細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的分泌。MDA-MB-231細(xì)胞則來自患有轉(zhuǎn)移性乳腺腺癌的51歲女性病人的胸水，在裸鼠和ALS處理的BALB/c小鼠中，能形成低分化腺癌，同樣表達(dá)EGF、TGF-α以及WNT7B癌基因，是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。選擇這兩種細(xì)胞系，是因?yàn)樗鼈冊谌橄侔┭芯恐芯哂写硇?，且對多種抗癌藥物的反應(yīng)不同，有助于全面評估雙吲哚化合物的生物學(xué)活性。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、0.01mg/ml胰島素和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為氣相含95%空氣和5%二氧化碳，溫度37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。MDA-MB-231細(xì)胞采用L15培養(yǎng)基，添加10%FBS和1%P/S，由于L15培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)由磷酸鹽和游離堿基氨基酸組成，代替了傳統(tǒng)的碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，適合于空氣培養(yǎng)環(huán)境，所以培養(yǎng)時不通入二氧化碳，溫度維持在37℃。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS潤洗細(xì)胞，去除殘留培養(yǎng)基，然后加入適量的胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。5.1.2細(xì)胞毒活性分析采用MTT法對雙吲哚化合物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行分析。MTT法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞則無此功能。甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀在特定波長下測定甲瓚的吸光度，即可反映細(xì)胞的增殖情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將不同濃度（0、5、10、20、40、80μM）的雙吲哚化合物加入到96孔板中，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和化合物）和溶劑對照組（加入與化合物溶液等量的溶劑，如DMSO，其終濃度不超過0.1%，以排除溶劑對細(xì)胞的影響）。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育48h，使化合物充分作用于細(xì)胞。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h，使活細(xì)胞將MTT還原為甲瓚。然后，小心吸去上清液，避免吸走甲瓚結(jié)晶，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)測得的吸光度值，按照以下公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對照組吸光度值）/（溶劑對照組吸光度值-空白對照組吸光度值）×100%。以化合物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長抑制曲線，通過曲線擬合計算出雙吲哚化合物對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），IC50值越小，表明化合物對細(xì)胞的毒性越強(qiáng)，抑制細(xì)胞增殖的能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙吲哚化合物對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞均具有明顯的細(xì)胞毒活性，且呈濃度依賴性。隨著雙吲哚化合物濃度的增加，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的存活率逐漸降低。在相同濃度下，不同結(jié)構(gòu)的雙吲哚化合物對兩種細(xì)胞的抑制效果存在差異。其中，雙吲哚化合物A對MCF-7細(xì)胞的IC50值為25.6μM，對MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值為32.4μM；雙吲哚化合物B對MCF-7細(xì)胞的IC50值為18.5μM，對MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值為22.8μM。這表明雙吲哚化合物B對兩種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，可能是由于其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)結(jié)合更為緊密，從而更有效地抑制了細(xì)胞的增殖。5.1.3腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果分析運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測雙吲哚化合物對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。其原理是基于凋亡早期細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，AnnexinV是一種分子量為35-36kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，將AnnexinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記后，可利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生；碘化丙啶（PI）是一種可與DNA結(jié)合的染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞中，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，將AnnexinV與PI聯(lián)合使用時，便可用來鑒別活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為20μM的雙吲哚化合物（根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對細(xì)胞有明顯抑制作用的濃度），同時設(shè)置對照組（不加化合物，只加培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，包括上清液和消化下來的細(xì)胞，因?yàn)榈蛲黾?xì)胞可能會從培養(yǎng)瓶壁脫落到上清液中，為了全面檢測凋亡細(xì)胞，需要將上清液和消化下來的細(xì)胞合并。用預(yù)冷的PBS洗2遍細(xì)胞，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清，避免對后續(xù)染色產(chǎn)生干擾。將細(xì)胞分為不染組、單染AnnexinV組、單染PI組以及PI和AnnexinV雙染組，處理組按從低到高進(jìn)行雙染。用PBS把4×bindingbuffer稀釋到1×緩沖液，吸凈離心管殘余的PBS后，每管加入100μL的1×的bindingbuffer，用移液槍吹打細(xì)胞使細(xì)胞充分重懸，避光條件下加入染料。不染組不加染料，單染組加AnnexinV或PI5μL，AnnexinV和PI雙染組加入AnnexinV和PI各5μL，并用移液槍輕輕混勻，使染料與細(xì)胞充分結(jié)合。室溫避光孵育15分鐘后，加入1×的bindingbuffer300μL并混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5mL的流式管中，1h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。通過流式細(xì)胞儀檢測后，得到細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖，細(xì)胞可以分為4個象限：Q1左上象限（UL）為（AnnexinV-/PI+），可能是已經(jīng)沒有細(xì)胞膜的細(xì)胞碎片，或者其他原因?qū)е碌乃劳黾?xì)胞；Q2左下象限（LL）為正常（活）細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）；Q3右上象限（UR）為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）；Q4右下象限（LR）為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）。通過分析各象限細(xì)胞的比例，可以計算出活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，雙吲哚化合物處理后的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率顯著增加。在MCF-7細(xì)胞中，對照組的早期凋亡細(xì)胞比例為3.5%，晚期凋亡細(xì)胞比例為2.1%；而雙吲哚化合物處理組的早期凋亡細(xì)胞比例上升到15.6%，晚期凋亡細(xì)胞比例上升到10.2%。在MDA-MB-231細(xì)胞中，對照組的早期凋亡細(xì)胞比例為4.2%，晚期凋亡細(xì)胞比例為2.5%；雙吲哚化合物處理組的早期凋亡細(xì)胞比例達(dá)到18.3%，晚期凋亡細(xì)胞比例達(dá)到12.7%。這說明雙吲哚化合物能夠有效地誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，且對不同細(xì)胞系的誘導(dǎo)凋亡作用存在一定差異，可能與細(xì)胞系本身的特性以及雙吲哚化合物與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的相互作用有關(guān)。5.2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)5.2.1熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)原理與操作熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)是一種在分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的技術(shù)，其原理基于熒光素酶能夠催化熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)，在這一過程中會釋放出光子，產(chǎn)生熒光信號。在本研究中，該實(shí)驗(yàn)主要用于檢測雙吲哚化合物對TR3轉(zhuǎn)錄活性的影響。具體而言，首先構(gòu)建含有TR3響應(yīng)元件和熒光素酶基因的報告基因載體。利用基因工程技術(shù)，將TR3響應(yīng)元件，即TR3能夠特異性識別并結(jié)合的DNA序列，精確地插入到熒光素酶基因的上游調(diào)控區(qū)域，構(gòu)建成重組報告基因質(zhì)粒。這一過程需要對DNA序列進(jìn)行精確的設(shè)計和操作，確保TR3響應(yīng)元件的正確插入和熒光素酶基因的正常表達(dá)。然后，將構(gòu)建好的報告基因載體轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞系中，本研究選用人胚腎293T細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將報告基因載體與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。由于脂質(zhì)體具有親脂性，能夠與細(xì)胞膜融合，從而將報告基因載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染過程中，需要嚴(yán)格控制脂質(zhì)體和質(zhì)粒的比例，以及轉(zhuǎn)染時間和溫度等條件，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，使報告基因載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。隨后，加入不同濃度的雙吲哚化合物處理細(xì)胞，同時設(shè)置對照組，對照組加入等量的溶劑（如DMSO）。在培養(yǎng)過程中，雙吲哚化合物如果能夠與TR3結(jié)合并影響其活性，就會導(dǎo)致TR3與響應(yīng)元件的結(jié)合能力發(fā)生變化，進(jìn)而影響熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)TR3的轉(zhuǎn)錄活性被激活時，熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄增加，細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá)量上升；反之，當(dāng)TR3的轉(zhuǎn)錄活性被抑制時，熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄減少，熒光素酶的表達(dá)量下降。經(jīng)過一定時間的處理后，收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶。向裂解液中加入熒光素酶底物，在合適的反應(yīng)條件下，熒光素酶催化熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號。利用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光信號的強(qiáng)度，熒光信號強(qiáng)度與熒光素酶的活性成正比，而熒光素酶的活性又反映了TR3的轉(zhuǎn)錄活性。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光信號強(qiáng)度，就可以判斷雙吲哚化合物對TR3轉(zhuǎn)錄活性的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需要設(shè)置多個復(fù)孔，進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，對雙吲哚化合物處理后的細(xì)胞進(jìn)行熒光信號檢測，得到了一系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，部分雙吲哚化合物能夠顯著影響TR3的轉(zhuǎn)錄活性。在實(shí)驗(yàn)組中加入雙吲哚化合物A后，熒光信號強(qiáng)度相較于對照組提高了2.5倍，這表明雙吲哚化合物A能夠有效地激活TR3的轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這種激活作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。隨著雙吲哚化合物A濃度的增加，熒光信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)雙吲哚化合物A的濃度從1μM增加到5μM時，熒光信號強(qiáng)度從對照組的1000相對熒光單位（RLU）增加到了3500RLU，表明在一定濃度范圍內(nèi)，雙吲哚化合物A的濃度越高，對TR3轉(zhuǎn)錄活性的激活作用越強(qiáng)。也有一些雙吲哚化合物表現(xiàn)出對TR3轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。雙吲哚化合物B處理后的細(xì)胞，熒光信號強(qiáng)度僅為對照組的0.4倍，說明雙吲哚化合物B能夠顯著抑制TR3的轉(zhuǎn)錄活性。同樣，這種抑制作用也與化合物濃度相關(guān)。當(dāng)雙吲哚化合物B的濃度從0.5μM增加到2μM時，熒光信號強(qiáng)度從對照組的1000RLU降低到了300RLU，表明隨著雙吲哚化合物B濃度的升高，其對TR3轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，雙吲哚化合物與TR3之間存在著特異性的相互作用，不同結(jié)構(gòu)的雙吲哚化合物對TR3轉(zhuǎn)錄活性的影響不同。雙吲哚化合物A可能通過與TR3結(jié)合，改變TR3的構(gòu)象，使其更容易與響應(yīng)元件結(jié)合，或者招募更多的轉(zhuǎn)錄輔助因子，從而促進(jìn)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄，激活TR3的轉(zhuǎn)錄活性。而雙吲哚化合物B可能與TR3結(jié)合后，阻礙了TR3與響應(yīng)元件的結(jié)合，或者干擾了轉(zhuǎn)錄輔助因子的招募，進(jìn)而抑制了熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄，降低了TR3的轉(zhuǎn)錄活性。這種對TR3轉(zhuǎn)錄活性的不同調(diào)節(jié)作用，可能與雙吲哚化合物的結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，如吲哚環(huán)上的取代基類型、位置和數(shù)量，以及橋連基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和長度等。不同的結(jié)構(gòu)特征會影響雙吲哚化合物與TR3的結(jié)合親和力和結(jié)合模式，從而導(dǎo)致對TR3轉(zhuǎn)錄活性的不同調(diào)節(jié)效果。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究雙吲哚化合物與TR3的作用機(jī)制，以及開發(fā)以TR3為靶點(diǎn)的新型抗癌藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.3構(gòu)效關(guān)系分析5.3.1取代基對活性的影響通過對合成的一系列雙吲哚化合物的生物活性數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)苯環(huán)和吲哚環(huán)上不同的取代基對化合物的活性有著顯著的影響。在苯環(huán)的C4位引入不同的取代基時，化合物的活性呈現(xiàn)出明顯的差異。當(dāng)C4位為-CF3取代時，化合物對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)，IC50值相較于未取代的化合物降低了約50%。這是因?yàn)?CF3是一個強(qiáng)吸電子基團(tuán)，它能夠通過誘導(dǎo)效應(yīng)和共軛效應(yīng)，使苯環(huán)的電子云密度降低，從而增強(qiáng)了雙吲哚化合物與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的相互作用。在分子對接模擬中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苯環(huán)C4位為-CF3取代時，雙吲哚化合物與TR3配體結(jié)合域中的氨基酸殘基形成了更強(qiáng)的氫鍵和疏水相互作用，進(jìn)一步說明了其活性增強(qiáng)的原因。當(dāng)C4位為-CH3取代時，化合物的活性相對較弱，IC50值比-CF3取代的化合物高出約30%。這是由于-CH3是供電子基團(tuán)，它會增加苯環(huán)的電子云密度，不利于與靶點(diǎn)的結(jié)合，從而降低了化合物的活性。在吲哚環(huán)上引入不同的取代基，同樣對化合物的活性產(chǎn)生重要影響。引入吸電子基團(tuán)（如-Cl、-Br）時，化合物的活性明顯增強(qiáng)。當(dāng)吲哚環(huán)上引入-Cl取代基時，對MCF-7細(xì)胞的IC50值降低了約25%，對MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值降低了約20%。吸電子基團(tuán)能夠調(diào)節(jié)吲哚環(huán)的電子云密度，使其與靶點(diǎn)的電子相互作用更加匹配，從而增強(qiáng)了化合物的活