長鏈非編碼RNAlnc-OAD(1700018A04Rik)調(diào)控3T3-L1脂肪分化的作用研究目錄TOC\o"1-2"\h\u中文摘要............................................................................................4英文摘要............................................................................................51實驗材料........................................................................................71.1細胞系........................................................................................71.2實驗相關(guān)試劑及用品................................................................71.3主要實驗儀器............................................................................82實驗方法........................................................................................92.13T3-L1細胞復蘇、傳代及凍存...................................................92.2成脂分化方法及穩(wěn)定敲除細胞構(gòu)建......................................102.3定量PCR方法...........................................................................102.4WesternBlot方法....................................................................112.5統(tǒng)計分析..................................................................................143實驗結(jié)果......................................................................................153.13T3-L1前體脂肪細胞分化過程中l(wèi)nc-OAD的動態(tài)表達........153.2lnc-OAD的表達下調(diào)阻礙了脂肪細胞的分化 ......................163.3lnc-OAD敲除促進了3T3-L1分化中β-catenin的表達.....173.4IWR-1可促進sh-lnc-OAD的脂肪分化....................................174討論..............................................................................................18參考文獻..........................................................................................19致謝..................................................................................................21附錄一:在讀本科期間獲得的榮譽...............................................21中文摘要目的:研究lnc-OAD調(diào)控3T3-L1細胞脂肪分化的作用。方法:用胰島素、地塞米松和IBMX經(jīng)典三因子建立3T3-L1脂肪細胞分化模型;利用顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，并采用油紅O染色判斷脂肪分化;利用定量PCR檢測成脂分化0、1、2、4、6天FABP4，PPARγ,lnc-OAD表達情況;采用定量PCR和WesternBlot分析干擾lnc-OAD表達后,脂肪分化核心轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、PPARγ和脂肪分化相關(guān)標志基因FABP4等表達變化,以及WNT信號通路變化;最后采用WNT抑制劑作用后,觀察脂肪細胞分化情況。結(jié)果:lnc-OAD的表達在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中逐漸升高;采用shRNA慢病毒穩(wěn)定干擾lnc-OAD(1700018A04Rik)后,脂肪分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ、C/EBPa以及脂肪分化相關(guān)標志基因FABP4表達水平明顯減少;穩(wěn)定干擾lnc-OAD(1700018A04Rik)后,β-catenin表達水平明顯升高;使用WNT/β-catenin信號通路抑制劑能明顯恢復穩(wěn)定敲除lnc-OAD細胞脂肪分化水平。結(jié)論:穩(wěn)定敲除lnc-OAD表達通過調(diào)控WNT/β-catenin信號通路明顯抑制3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化。關(guān)鍵詞:lnc-OAD;3T3-L1前體脂肪細胞;脂肪分化;β-catenin;WNT/β-cateninABSTRACTObject:Tostudytheeffectoflnc-OADonadipogenicdifferentiationof3T3-L1cells.Methods:Thedifferentiationmodelof3T3-L1adipocyteswasestablishedwithinsulin,dexamethasoneandIBMXclassicalthreefactors.ThedifferentiationofadipocyteswasdeterminedbymicroscopiccellmorphologyandoilredOstaining.QuantitativePCRwasusedtodetecttheexpressionofFABP4,PPARandlnc-OADduringadipogenicdifferentiationat0,1,2,4and6days.Theexpressionsoflnc-OAD,thecoretranscriptionfactorofadipogenicdifferentiationsuchasPPARandC/EBP,FABP4andWNTsignalingpathwaywereanalyzedbyquantitativePCRorWesternBlotanalysisafterknockdownoflnc-OAD.Finally,thedifferentiationofadipocyteswasobservedafterusingWntinhibitor.Results:Theexpressionoflnc-OADwasgraduallyincreasedduringadipocytedifferentiationin3T3-L1cells.TheexpressionlevelsoftheadipogenictranscriptionfactorPPAR-γ,C/EBPaandFABP4weresignificantlydecreasedafterknockdownoflnc-OAD(1700018A04Rik)byshRNAlentivirus.WesternBlotresultsshowedthatafterstableinterferencewithlnc-OAD(1700018A04Rik),theexpressionlevelofβ-cateninwassignificantlyincreased,andtheuseofWNT/β-cateninsignalingpathwayinhibitorscouldsignificantlyrestorethelevelofadipocytedifferentiationinlnc-OADknockdowncells.Conclusion:Stableknockdownoflnc-OADexpressionsignificantlyinhibitedadipogenicdifferentiationof3T3-L1cellsbyregulatingtheWNT/β-cateninsignalingpathway.Keywords:lnc-OAD；3T3-L1preadipocytes；adipogenicdifferentiation；β-catenin；WNT/β-catenin長鏈非編碼RNAlnc-OAD(1700018A04Rik)調(diào)控3T3-L1脂肪分化的作用研究肥胖已發(fā)展成為全球性的流行疾病，并且也是引起一系列代謝紊亂病的風險因數(shù),包括2型糖尿病、高血壓、高脂血癥、癌癥等疾病[1]。近20年來,肥胖在全球廣泛流行,尤其在中國，肥胖人口的比例逐年程上升和年輕化趨勢,對我國國民體質(zhì)和身體健康構(gòu)成重大威脅,已成為我們國家急需解決的公共衛(wèi)生問題。引發(fā)肥胖的關(guān)鍵原因是甘油三酯在白色脂肪組織中的過度積累,而脂肪細胞分化在脂肪組織形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。脂肪細胞體積增大或者數(shù)目增多為肥胖的重要特征。脂肪細胞分化是指從前體脂肪細胞生成成熟脂肪細胞的過程,而此過程是肥胖形成的重要原因。因此深入研究脂肪細胞的分化機制對于治療和預防代謝紊亂疾病具有極大價值。lncRNA是長度大于200個核苷酸的一類非編碼RNA。人類基因組計劃研究表明,在組成人類基因組的3億個堿基對中,有高達98.5%的基因組為非蛋白編碼序列,即不具備翻譯為蛋白質(zhì)的功能:其中有75%的基因組序列能夠被轉(zhuǎn)錄成RNA,而轉(zhuǎn)大部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即為長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA),進而在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的水平上廣泛參與到細胞分化中以及調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達[3],并且與人類許多重大疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。lncRNA在基因組表達調(diào)控的作用越發(fā)被發(fā)現(xiàn),國際上對lncRNA的研究日漸成為功能基因組研究的熱點。通過計算機生物信息學的預測、RNA測序技術(shù)以及科學實驗研究等手段,現(xiàn)階段對lncRNA功能的了解越來越全面[4]。近年來,國內(nèi)外對于lncRNA參與調(diào)控脂肪分化和代謝的文獻報道逐漸引起重視。岳文峻等報道了長鏈非編碼RNA在人脂肪干細胞分化過程中的差異表達,但未從根本上深入研究成脂分化的潛在機制[5]。Zheng等報道了長鏈非編碼RNAMEG3對成脂分化有抑制作用,并且這種抑制機制是通過調(diào)節(jié)mir140-5P來抑制脂肪干細胞的分化來發(fā)揮作用的;為深入研究此調(diào)控機制,zheng等通過大量實驗來深入分析脂肪分化期間PPARγ、CEBPa等基因(PPARγ、CEBPa等基因是脂肪分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子)的表達情況,進而證實長鏈非編碼RNAMEG3對脂肪分化具有抑制作用[6]。楊絲絲等總結(jié)了國際上一些對于lncRNA在棕色脂肪和米色脂肪細胞發(fā)育、分化和功能中起調(diào)控作用的文獻,指出增加Blnc1、lnc-BAT1等lncRNAs的表達對棕色和米色脂肪的形成具有促進作用,但其中的潛在調(diào)控機制和具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需深入研究[7]。綜上,lncRNA參與脂肪細胞分化的潛在功能尚未完全被發(fā)現(xiàn)。雖然有些lncRNA的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了lncRNA在脂肪細胞分化中的作用,但是參與脂肪分化的潛在功能尚未充分闡明,以及對信號通路的詳細了解仍不清楚。通過實驗,我們發(fā)現(xiàn)了一種新的名叫l(wèi)nc-OAD的lncRNA,它由1700018A04Rik基因轉(zhuǎn)錄而來,并且與脂肪細胞和成骨細胞分化密切相關(guān)。lnc-OAD通過調(diào)節(jié)WNT信號通路變化調(diào)控著3T3-L1細胞的成脂分化。1實驗材料1.1細胞系:3T3-L1細胞(購自中科院干細胞庫)1.2實驗相關(guān)試劑用品:無水乙醇、異丙醇、氯仿廣州化學試劑廠DMEM/高糖培養(yǎng)基 GibcoBRL公司(USA)胎牛血清(FBS)GibcoBRL公司(USA)胰島素北京索來寶科技有限公司異丁基-甲基-黃嘌呤(IBMX)sigma公司地塞米松sigma公司PCR試劑盒(編號:RR820A)日本TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(編號:RR047A)日本TAKARA公司DEPC水 北京索萊寶科技有限公司Trizol 美國LifeTechnologies公司濃鹽酸 科貿(mào)生物科技有限公司DMSO Sigma公司胰酶 GibcoBRL公司(USA)ArraySTARmouselncRNAmicroarray上?？党缮锕こ逃邢薰径嗑奂兹?天津市大茂試劑廠RIPA裂解液 碧云天生物技術(shù)有限公司Tris-Hcl(PH6.8) 碧云天生物技術(shù)有限公司PMSF 碧云天生物技術(shù)有限公司30%Acr-Bis(29:1) 碧云天生物技術(shù)有限公司脫脂奶粉 MBCHEM公司5x蛋白上樣緩沖液碧云天生物技術(shù)有限公司10%SDS 碧云天生物技術(shù)有限公司Tween20 MP公司甘氨酸(MW75.07) 生工有限公司SDS MP公司Tris(MW121.14) 生工有限公司BSA 廣州市威佳科技有限公司Tris-Hcl(PH8.8) 碧云天生物技術(shù)有限公司APS 碧云天生物技術(shù)有限公司甲醇 天津市大茂試劑廠TEMED 碧云天生物技術(shù)有限公司HRP標記羊抗小鼠IgG抗體碧云天生物技術(shù)有限公司顯影液 美國Millipore公司A-FABP(B-4)抗體美國SANTACRUZ公司BCA蛋白測定試劑盒 上海博彩生物科技有限公司Tubulin抗體 碧云天生物技術(shù)有限公司W(wǎng)estern一抗稀釋液 碧云天生物技術(shù)有限公司Marker 美國Thermo公司HRP標記羊抗兔IgG抗體英國Abcam公司油紅“O”粉末 Sigma公司1.3主要實驗儀器:單道可調(diào)移液器 德國Eppendorf公司-80C低溫冰箱 美國Thermo公司恒溫水浴鍋 金壇市杰爾瑞電器有限公司酶標儀 美國Bio-Rad公司電泳儀、垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司轉(zhuǎn)膜儀、轉(zhuǎn)膜槽 美國Bio-Rad公司熒光顯微鏡 日本Nikon公司常溫及低溫離心機(Centrifuge5427R) Eppendorf公司(Germany)CO2細胞培養(yǎng)箱 ThermoScientific（USA）迷你離心機 上海托莫斯科學儀器有限公司電子分析天平(SHIMADZU) 南京東邁科技儀器有限公司渦旋振蕩器 上海長哲生物科技有限公司核酸蛋白定量檢測儀(NanoDrop?ND-1000) USA水平搖床 北京六一儀器廠凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司2實驗方法2.13T3-L1細胞復蘇、傳代及凍存2.1.1細胞復蘇從液氮中取出3T3-L1細胞凍存管,迅速放入37℃水浴中,融解后用移液槍吸出細胞懸液置于離心管中,并加入5.0ml培養(yǎng)基混勻,離心(900rpm,3min)。把上清液去掉,用4.0ml培養(yǎng)基混勻細胞沉淀物。向25cm2培養(yǎng)瓶中加入1.0ml培養(yǎng)基,把上述細胞懸液(4.0ml)加入這個培養(yǎng)瓶中,放于37℃,5%CO2的孵育箱中。2.1.2細胞傳代等到3T3-L1細胞生長至80%～90%融合度時,加入0.25%胰酶1.0ml消化細胞2min,等到細胞完全消化下來后再向培養(yǎng)瓶中加入2.5ml培養(yǎng)基,中和胰酶，使消化反應停止。把細胞混懸液吸到10ml離心管中進行離心(900rpm,3min)。把上清液去掉,然后再用5.0ml培養(yǎng)基輕吹細胞沉淀使其混勻,于37℃,5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2.1.3細胞凍存3T3-L1細胞生長達到80%融合度時,取0.25%胰酶1.0ml放入培養(yǎng)基中消化細胞,等到細胞完全消化下來后再往培養(yǎng)瓶中加入2.5ml培養(yǎng)基,中和胰酶,使消化反應停止。把細胞混懸液放入10ml離心管中進行離心(900rpm,3min)。把上清液去掉,再用1.0ml細胞凍存液輕吹打細胞沉淀使其混勻,然后把細胞混懸液置于至凍存管,標志好。最后把凍存管置于程序降溫盒中,再轉(zhuǎn)到-80℃冰箱中,第二天把細胞轉(zhuǎn)到液氮中凍存。2.2成脂分化方法及穩(wěn)定敲除細胞構(gòu)建2.2.1構(gòu)建3T3-L1細胞成脂分化模型按1.6x104個/cm2密度把3T3-L1細胞接種在6孔板中,在5%CO2飽和濕度,37C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至100%匯合度時,把舊培養(yǎng)基去掉,加入新鮮培養(yǎng)基,等到兩天后進行成脂誘導(指定為成脂0天)。用10%胎牛血清(FBS),0.5mMIBMX,1μM地塞米松,10μg/mL胰島素(簡稱為MDI)誘導3T3-L1細胞進行成脂分化。等到兩天后把舊培養(yǎng)基去掉，加入含F(xiàn)BS和10μg/mL胰島素的新鮮培養(yǎng)基。然后,間隔兩天則用含有10%FBS-DMEM培養(yǎng)基更換,直到細胞生成收獲。油紅O染色觀察變化情況,并提取0、1、2、4、6天的RNA。2.2.2構(gòu)建干擾lnc-OAD(1700018A04Rik)3T3-L1細胞模型通過上海吉凱基因有限公司進行慢病毒載體構(gòu)建(中國上海)。短核苷酸序列5′-CCAGGTGTGTCCTGTGATT-3′用于進行shRNA介導的lnc-OAD敲除(sh-lnc-OAD),非靶向陰性shRNA(sh-NC,5′-CCAGGTGTGTCCTGTGATT-3′)作為對照。為了獲得穩(wěn)定的細胞系,我們用sh-NC或sh-lnc-OAD慢病毒感染3T3-L1前體脂肪細胞12小時后,細胞在無病毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后選擇使用3μg/mL的嘌呤素篩選一周。然后用定量PCR方法評價其敲除效果。2.3定量PCR方法2.3.1準備定量樣品不同3T3-L1細胞模型按上述相同方法誘導成脂分化不同時段后,分別加入1mlTrizol試劑后吹打至細胞完全溶解,收集細胞,樣品用于提RNA或-80℃貯存?zhèn)溆?。不?T3-L1細胞模型按上述相同方法誘導成脂分化不同時段后,分別加入1mlTrizol試劑后吹打至細胞完全溶解,收集細胞用于提取RNA或者放在-80℃冰箱中貯存,用于后用。2.3.2提細胞取樣品中的總RNAa.溶解:把-80℃中貯存的Trizol裂解的脂肪細胞取出,置于室溫中。b.進行粹取分離:按照0.2ml氯仿/1mlTrizol試劑的比例加入氯仿,振搖使其混勻,放置3min。12000rpm,4℃進行離心15分鐘。離心后RNA全部分布在上層液相中。c.加異丙醇:取約0.4ml上層液至于另一個離心管中,加等體積的異丙醇進行混勻,室溫放置10min。2000rpm,4℃離心機中離心10分鐘,把上清液去掉,可見RNA沉積于管底下。d.清洗:把上清液去掉,按照1ml75%乙醇/1mlTrizol的比例加入1ml75%的乙醇。繞著管壁輕輕洗一圈。2000rpm,4℃離心5分鐘。e.RNA干燥:把乙醇溶液吸走,再將RNA沉淀置于室溫中干燥30分鐘。f.溶解RNA沉淀:加無酶水20ul,反復吹打幾次,使沉淀完全溶解,然后分裝進行OD值測定。2.3.3測定總RNA濃度及純度用NanoDrop?ND-1000測定總RNA濃度以及OD260/OD280的比值。此比值可反映RNA的純度,當比值為1.8～2.0時純度良好。2.3.4樣品cDNA合成——逆轉(zhuǎn)錄反應模板cDNA按PrimeScriptTMRTReagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑說明由總RNA逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)量為每管800ng。2.3.5定時定量PCR按照試劑盒分別配制cDNA和引物,然后按照比例混勻,再用定量PCR擴增儀進行擴增。2.3.6結(jié)果分析根據(jù)定量PCR結(jié)果圖分析lnc-OAD(1700018A04Rik)的表達水平及FABP4等表達情況。2.4WesternBlot方法2.4.1總蛋白質(zhì)提取從-20℃中取出RIPA裂解液(強)和PMSF（蛋白酶抑制劑）,并放置于冰上溶解,根據(jù)RIPA:PMSF=100:1進行配制,并放置在冰上備用;把2mlPBS緩沖液預冷,之后加入已去掉培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)皿,輕輕搖動一會后去掉PBS緩沖液,然后再漂洗1次;漂洗完后每孔加0.1ml蛋白質(zhì)裂解液,用移液槍反復吹打使使得所有細胞被裂解液完全覆蓋,再放置在冰上進行孵育;30min后,把細胞刮取下來,移到1.5ml的滅菌EP管中,把蓋子蓋好,渦旋震蕩十秒,于12000rpm,4℃離心機中離心15min;再把上清轉(zhuǎn)移到另外一支滅菌EP管中,用于進行蛋白印跡實驗或放置于-80℃中保存。2.4.2蛋白免疫印跡實驗(1)處理蛋白質(zhì)樣品把蛋白質(zhì)樣品從-80℃冰箱中取出,放置于冰上融解,之后加入5x蛋白上樣緩沖液,渦旋震蕩,再在4℃12000rpm的離心機中離心2min，于95℃的水浴中水浴5min后冷卻至室溫,12000rpm4℃離心1min,準備上樣;把剩余已經(jīng)變性的蛋白質(zhì)放回-80℃冰箱中儲存;再次使用時,僅在室溫中進行解凍,渦旋震蕩,95℃水浴2min,然后12000rpm4℃離心1min后即可上樣;倘若放置時間過久,則需要把樣品在95℃中水浴5min使其重新變性。(2)清洗玻璃板輕輕擦洗玻璃板兩面,沖洗干凈,再用超純水沖洗，晾干或用濾紙將水吸干后待用。(3)安裝玻璃板在長板兩側(cè)和制膠膠條上均勻涂抹適量凡士林，將兩塊玻璃板在濾紙上對齊后,垂直插入固定架,保證底部平齊,把玻璃板裝好,在把帶裝有玻璃板的固定架安裝在制膠架上。(4)配制分離膠按照下表1的試劑比例配制10%分離膠,并根據(jù)表中順序加樣,每加一步均需輕搖混勻(以免產(chǎn)生大量氣泡),待10%AP和TEMED加入混勻后立即灌膠;灌膠到一定高度時(大約加入了4.5ml分離膠),停止灌膠,改加超純水封膠,速度慢,超純水加至溢出即可;室溫放置80min(冬天時放置時間可延長),待充分凝膠后,就配制濃縮膠。表110%分離膠的配制超純水(ml)2.04.030%Acr-Bis(29:1)(ml)1.653.31.5MTris-HCl(PH8.8)(ml)1.252.510%SDS(ml)0.050.110%AP(ml)0.050.1TEMED(ml)0.0020.004(5)配制濃縮膠按照下表2的試劑比例配制5%濃縮膠,并根據(jù)表中順序加試劑,每加一種試劑都要輕搖混勻(以免產(chǎn)生大量氣泡),等到10%AP和TEMED加入并且混勻后馬上灌膠,按照左至右的順序把槍頭貼著玻璃板移動灌膠。把膠灌滿后,水平輕輕把梳子插入(以免產(chǎn)生氣泡),然后在室溫中放置80min。表25%濃縮膠的配制2.5ml5ml超純水(ml)1.73.430%Acr-Bis(29:1)(ml)0.4150.831MTris-HCl(PH6.8)(ml)0.3150.6310%SDS(ml)0.0250.0510%AP(ml)0.0250.05TEMED(ml)0.00250.005(6)沖洗凝膠板濃縮膠凝固后,取下已凝好膠的玻璃板,自來水沖去溢出的膠,再用超純水沖洗,沖然后重新將玻璃板安裝回架子上,放入電泳槽中,內(nèi)外槽均加入新配制的1x電泳液。(7)上樣按同等的量上樣,并用1x蛋白上樣緩沖液補足至相同體積,用10μl移液槍伸入上樣孔內(nèi)緩慢打下樣品,樣品布局從右至左,依次為Marker,樣品,之后把等體積1x蛋白上樣緩沖液加入到剩余的孔中,準備電泳。(8)電泳(恒壓)將電泳儀的電壓調(diào)至80V,時間設(shè)置為30min,30min后再把電泳儀電壓調(diào)至120V,當觀察到溴粉藍條帶移動至適當?shù)奈恢脮r,即可停止電泳。用超純水把玻璃板沖洗干凈,然后將玻璃板放置于預冷后的1x轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，5min后即可準備轉(zhuǎn)膜。(9)轉(zhuǎn)膜(恒壓)①把海綿、濾紙放置于預冷的1x轉(zhuǎn)膜液緩沖液中浸泡15min；②將PVDF膜于甲醇溶液中漂洗3min,超純水中漂洗數(shù)秒,然后放置在1x轉(zhuǎn)膜緩沖液(已預冷)浸泡15min；③按照海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿的順序放置在預冷的1x轉(zhuǎn)膜緩沖液中,每放一層,就用玻璃棒輕輕滾動把氣泡趕走,再把夾架夾緊,置于濕轉(zhuǎn)槽中,加入預冷的1x轉(zhuǎn)膜緩沖液,轉(zhuǎn)膜槽放置在泡沫盒中,然后將整個轉(zhuǎn)膜槽用冰塊覆蓋(以免轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱,造成溶膠現(xiàn)象)。④接通電源,電壓調(diào)至80V,設(shè)為1h；(10)剪膜根據(jù)Marker的分子量,在膜上用剪刀剪取所需要的蛋白條帶,并用剪刀在膜的上角剪去一角用以標記方向；用1xTBST緩沖溶液把剪好的PVDF膜快速漂洗3次,3min/次,準備封閉;(11)封閉把適量過濾好的5%脫脂奶粉加入玻璃平皿中,用濾紙吸干PVDF膜上的液體，再放入脫脂奶粉中,在搖床上低速搖動,室溫封閉1h。(12)孵育一抗①從-20℃冰箱中取出一抗,冰上融解后依照一定的比例用一抗稀釋液稀釋一抗,混勻,放置在冰上以備后用。②從脫脂奶粉溶液中取出PVDF膜,用濾紙吸干,再將膜放入抗體孵育盒(注意使含有蛋白的一面朝上),把已配制好的一抗加入抗體孵育盒中,盒子安裝在小型搖床上,并放在4℃冰箱中搖動孵育過夜(約14h)。③一抗孵育結(jié)束后,回收,把PVDF膜置于1xTBST緩沖液中漂洗,10min/次，漂洗3次。(13)孵育二抗①從4℃取出二抗母液(HRP-抗鼠、HRP-抗兔),按一定比例加入1xTBST溶液進行稀釋,混勻備用。②將漂洗完的PVDF膜用濾紙吸干,放入抗體孵育盒中,將配好的二抗稀釋液輕輕加在膜上,然后放置在低速搖床上，在室溫孵育1h;等到孵育結(jié)束后再用1xTBST緩沖溶液漂洗10min/次，漂洗3次。(14)曝光把顯影液加在漂洗過的PVDF膜上,采用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光。(15)分析蛋白條帶應用ImageJ軟件對凝膠成像結(jié)果進行灰度分析。2.5統(tǒng)計學分析每個實驗都重復3次,并采用GraphPadPrism5.0軟件處理所得的實驗數(shù)據(jù),以平均值±標準差Mean±SEM）繪制柱狀圖,線性圖；組間比較采用t檢驗或者one-wayANOVA分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。3實驗結(jié)果3.1lnc-OAD在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中的動態(tài)表達我們使用MDI誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1小鼠脂肪細胞系,如圖1A所示,與0天比較,可以觀察到誘導6天有明顯的脂滴積聚。aP2(Fabp4)和PPAR-γ兩個脂肪分化主要標記基因均顯示表達增加(Fig.1BC)。采用定量PCR測定lnc-OAD的表達水平在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中的變化規(guī)律,如圖1D所示,lnc-OAD的表達水平在脂肪分化誘導后第1天迅速升高,直到第2天恢復到原來的水平,然后在分化第4天逐漸升高,在分化成熟第6天達到高峰,與第0天相比增加了3.35倍。以上結(jié)果表明lnc-OAD在3T3-L1分化中有潛在的作用。圖1lnc-OAD在3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中的動態(tài)表達（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）3.2lnc-OAD的表達下調(diào)抑制了脂肪細胞的分化我們利用3T3-L1前體脂肪細胞建立lnc-OAD穩(wěn)定敲除細胞模型(sh-lnc-OAD),陰性對照為shRNA細胞(sh-NC)。然后用MDI培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)sh-NC和sh-lnc-OAD細胞。與sh-NC相比,油紅O染色顯示sh-lnc-OAD細胞中脂滴積累明顯下降(圖2A和B)。定量PCR顯示lnc-OAD的mRNA及aP2、PPAR-γ、C/EBPa等脂肪分化標志基因的表達水平因lnc-OAD的敲除而顯著下降(圖2C)。Westernblot實驗也證實aP2、PPAR-γ、C/EBPa在sh-Lnc-OAD細胞的表達水平中顯著低于sh-NC細胞(圖2D)。以上結(jié)果顯示抑制lnc-OAD的表達可以抑制3T3-L1細胞分化。圖2lnc-OAD的敲除抑制了3T3-L1前體脂肪細胞的分化（*P<0.05,**P<0.01）3.3lnc-OAD敲除促進了3T3-L1分化中β-catenin的表達大量文獻表明,典型的WNT信號通路對脂肪細胞的分化起負調(diào)控作用。β-catenin是一種通過WNT信號的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,在脂肪細胞分化期間表達減少。Westernblot實驗發(fā)現(xiàn)sh-NC細胞在誘導分化第四天,β-catenin幾乎減少了三倍;然而,sh-lncOAD細胞只是略微減少(Fig.3A),這表明穩(wěn)定敲除lnc-OAD會導致β-catenin表達上調(diào),從而抑制了3T3-L1脂肪分化。圖3WNT/β-catenin信號通路參與了由lnc-OAD敲除引起的脂肪細胞分化損傷（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）3.4IWR-1可部分恢復sh-lnc-OAD細胞脂肪分化最后,我們研究IWR-1(一種WNT/β-catenin信號通路抑制劑)的加入是否可以恢復sh-lnc-OAD細胞的脂肪分化。結(jié)果如預期一樣,當sh-lnc-OAD細胞中的IWR-1為10μM(圖3C)時,β-catenin的表達下降,而脂肪細胞的脂質(zhì)積累顯著增多(圖3B)。另外,Westernblot和定量PCR結(jié)果也證實了IWR-1的加入使得aP2、PPAR-γ以及C/EBPa的表達水平顯著升高（圖3C和D）。以上結(jié)果說明了IWR-1可以挽救lnc-OAD敲除引起的脂肪細胞分化缺陷。4討論脂肪細胞數(shù)量以及脂肪細胞大小的增加是肥胖的兩個重要特征。盡管國際上對于脂肪分化調(diào)控的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但是深入研究影響脂類代謝和脂肪分化的因素以及存在機制對于靶向治療和預防肥胖病具有重要作用。越來越多的研究表明長鏈非編碼RNA對脂肪分化具有一定的作用。一種新的長鏈非編碼RNA,它是從老鼠身上的1700018A04Rik基因(GeneID:71307)轉(zhuǎn)錄而來,我們把它稱作lnc-OAD。目前,lnc-OAD所涉及的生物學功能尚不明確。我們發(fā)現(xiàn)在3T3-L1分化期間lnc-OAD上調(diào)表達,猜測lnc-OAD可能參與調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化。接下來,我們使用慢病毒感染3T3-L1細胞,構(gòu)建了lnc-OAD穩(wěn)定敲除細胞模型(sh-lnc-OAD)及其對照shRNA細胞模型(sh-NC)。與預期一樣,lnc-OAD的穩(wěn)定敲除會導致脂滴減少,并且導致脂肪細胞標記基因PPAR-g,C/EBPa和aP2的表達水平顯著下降。不同的信號通路,包括WNT、ERK、JNK和p38MAPK通路參與了脂肪細胞分化[8]，如，WNT信號是脂肪細胞分化的負調(diào)節(jié)因子[9]。我們分析了β-catenin在3T3-L1分化中的表達水平,MDI誘導后sh-NC細胞中β-catenin的表達水平下降,而在sh-lnc-OAD細胞中僅略有下降。進一步研究WNT信號對脂肪細胞分化的作用,我們用MDI和DMSO或IWR-1處理sh-lnc-OAD細胞,結(jié)果證明了IWR-1導致了β-catenin蛋白水平的降低。此外,10μMIWR-1能顯著挽救由lnc-OAD敲除引起脂肪細胞分化缺陷。上述結(jié)果均表明lnc-OAD可能通過WNT/β-catenin信號通路調(diào)控著3T3-L1前體脂肪細胞的分化。我們所研究的lnc-OAD因子與現(xiàn)有的許多因子相比，作用效果明顯，作用途徑明確，且不說它是否通過多條信號通路，但實驗證明了lnc-OAD是通過WNT/β-catenin信號通路調(diào)控著3T3-L1前體脂肪細胞分化。亦有大量的文獻表明，許多作用因子也是通過WNT/β-catenin信號通路影響脂肪細胞分化，如林浩等證明了miR-122-3p通過WNT/β-catenin調(diào)控著小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的分化[10]。這表明WNT/β-catenin信號通路在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。綜上所述，本研究首次證明lnc-OAD對脂肪細胞分化的作用。實驗結(jié)果表明,穩(wěn)定敲除lnc-OAD可以通過調(diào)控β-catenin的表達抑制3T3-L1前體脂肪細胞的分化。然而,還需要進一步研究lnc-OAD抑制3T3-L1前體脂肪細胞的分化的機制以及這種抑制作用對肥胖的影響和對機體有何不良影響等，以進一步評價其應用前景。參考文獻[1]GanChun-Chun,NiTian-Wen,YuYang,QinNan,ChenYing,JinMei-Na,DuanHong-Quan.Flavonoidderivative(Fla-CN)inhibitedadipocytedifferentiationviaactivatingAMPKandup-regulatingmicroRNA-27in3T3-L1cells.[J].Europeanjournalofpharmacology,2017,797.[2]WangX,WuH,YuW,tal.Hepatocytenuclearfactor1bisanovelnegativeregulatorofwhiteadipocytedifferentiation[J].CellDeathDiffer,2017,24(9):1588-1597.[3]馮玉環(huán),李勁松.長非編碼RNA在頭頸部鱗狀細胞癌中的研究進展[J].頜面外科雜志,2015,13(2):182-186.[4]岳文峻,王香梅,張芹,等.人脂肪干細胞脂向分化中長非編碼RNA的差異表達[J].中國組織工程研究,2014(28):4491-4497.[5]LiZ,JinC,ChenS,etal.Longnon-codingRNAMEG3inhibitsadipogenesisandpromotesosteogenesisofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellsviamiR-140-5p[J].MolCellBiochem,2017,433(1-2):51-60.[6]LiZ,JinC,ChenS,etal.Longnon-coding