基于細胞共培養(yǎng)的心臟生物起搏器模型體外構(gòu)建與特性研究一、引言1.1研究背景與意義心臟，作為人體最為關(guān)鍵的器官之一，肩負著為全身供血的重任。正常情況下，心臟依靠自身的天然起搏系統(tǒng)，即竇房結(jié)、房室結(jié)等結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生并傳導(dǎo)電信號，進而有序地控制心臟的收縮與舒張，確保血液循環(huán)的順暢進行。然而，當心臟的天然起搏系統(tǒng)因疾病、衰老或其他因素受損時，就會引發(fā)心律失常，如心動過緩、房室傳導(dǎo)阻滯等，這些心律失常會嚴重影響心臟的泵血功能，對人體健康構(gòu)成極大威脅，甚至危及生命。在眾多治療心律失常的方法中，起搏器發(fā)揮著舉足輕重的作用。自20世紀50年代第一臺心臟起搏器誕生以來，起搏器技術(shù)不斷發(fā)展革新。傳統(tǒng)的電子起搏器通過發(fā)放電脈沖刺激心臟，有效地維持了心臟的跳動，顯著延長了患者的生命，提高了患者的生活質(zhì)量，已然成為心律失常治療領(lǐng)域中最為常見且成功的治療手段之一。盡管電子起搏器在臨床應(yīng)用中取得了顯著成效，但它仍存在諸多局限性。例如，電子起搏器無法根據(jù)人體的情緒變化或劇烈運動進行自主調(diào)節(jié)，其電池壽命有限，患者需要定期接受手術(shù)更換電池，這不僅給患者帶來了身體上的痛苦，還增加了感染、電極脫位等并發(fā)癥的風險。此外，電子起搏器還容易受到外界電磁波的干擾，這在一定程度上限制了患者的活動范圍。鑒于電子起搏器的種種不足，生物起搏器的研究應(yīng)運而生，并逐漸成為醫(yī)學界的研究熱點。生物起搏器旨在利用生物材料或細胞，在心臟內(nèi)構(gòu)建起具有自主起搏功能的生物起搏點，以實現(xiàn)對心臟節(jié)律的生理性調(diào)節(jié)。與電子起搏器相比，生物起搏器具有諸多優(yōu)勢，如能夠隨機體的生理狀態(tài)自動調(diào)整心率和房室同步，感染風險低，可避免電極脫位、斷裂和心肌穿孔等問題，且不受周圍環(huán)境中的電磁場干擾。對于患者而言，植入生物起搏器不受年齡限制，無需更換電池和電極，具有更高的安全性和可靠性。體外研究在心臟生物起搏器的研究與發(fā)展進程中扮演著不可或缺的角色。通過體外實驗，研究者能夠在脫離人體的環(huán)境下，使用動物心臟模型，如小鼠、大鼠、豚鼠等，對心臟生物起搏器進行深入研究。這些實驗可以模擬不同的心臟疾病狀態(tài)和強度，如竇性心動過緩、房室傳導(dǎo)阻滯和心室內(nèi)惡性心律失常等，幫助研究人員更好地理解生物起搏器在不同條件下的適用性和穩(wěn)定性。體外研究還能對生物起搏器系統(tǒng)的設(shè)計進行測試和優(yōu)化，包括確定起搏器的電極類型和位置、電刺激頻率和幅度等參數(shù)，從而為臨床和實際應(yīng)用提供更優(yōu)質(zhì)的起搏器治療效果和安全性，降低起搏器治療的不良事件和并發(fā)癥發(fā)生率。本研究旨在通過重建心臟生物起搏器模型的體外研究，深入探究心臟生物起搏器的工作機制、性能特點以及影響因素，為其進一步的臨床應(yīng)用和優(yōu)化提供堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，以期推動心臟生物起搏器技術(shù)的發(fā)展，為廣大心律失?；颊邘砀鼮橛行У闹委熓侄?，改善他們的生活質(zhì)量，延長他們的生命。1.2心臟生物起搏器概述心臟生物起搏器，是一種運用生物材料或細胞構(gòu)建，旨在恢復(fù)或重建心臟正常起搏功能的新型治療手段。其工作原理基于對心臟自然起搏機制的深入理解與模擬，通過特定的生物學方法，促使心臟細胞產(chǎn)生并傳導(dǎo)電信號，從而實現(xiàn)對心臟節(jié)律的有效控制。人體心臟的正常起搏功能主要依賴于竇房結(jié)，竇房結(jié)內(nèi)的起搏細胞能夠自發(fā)地產(chǎn)生電信號，這些電信號隨后依次傳導(dǎo)至心房、房室結(jié)和心室，引發(fā)心臟的有序收縮和舒張。心臟生物起搏器的研發(fā)，便是致力于模仿這一自然過程，利用生物材料或細胞，在心臟內(nèi)創(chuàng)造出具有自主起搏功能的生物起搏點。在基因治療方面，通過將特定的基因?qū)胄呐K細胞，使其表達出與起搏相關(guān)的離子通道蛋白，從而賦予這些細胞起搏功能。在細胞治療領(lǐng)域，將具有起搏能力的細胞，如竇房結(jié)細胞、干細胞分化的起搏樣細胞等，移植到心臟的特定部位，期望這些細胞能夠穩(wěn)定存活并發(fā)揮起搏作用，帶動心臟的正常跳動。與傳統(tǒng)電子起搏器相比，心臟生物起搏器具有諸多顯著優(yōu)勢。在生理性調(diào)節(jié)方面，生物起搏器能夠根據(jù)人體的生理需求，如運動、睡眠、情緒變化等，自動調(diào)整心率和房室同步，更符合人體的生理節(jié)律，有效提升患者的生活質(zhì)量。在安全性上，生物起搏器避免了電子起搏器所面臨的電池壽命有限、需定期手術(shù)更換電池的問題，減少了感染、電極脫位、斷裂和心肌穿孔等并發(fā)癥的發(fā)生風險，同時也不受周圍環(huán)境中電磁場的干擾，為患者提供了更為安全可靠的治療選擇。對于兒童患者而言，生物起搏器還不存在因心臟生長而需要頻繁更換設(shè)備的困擾。從成本效益角度考慮，盡管目前生物起搏器的研發(fā)成本較高，但隨著技術(shù)的不斷成熟和規(guī)?；a(chǎn)，其長期使用成本有望低于傳統(tǒng)電子起搏器，且能為患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量，具有更高的性價比。心臟生物起搏器在心律失常治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。對于病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者，生物起搏器可替代受損的竇房結(jié)，恢復(fù)正常的心臟起搏功能；對于房室傳導(dǎo)阻滯患者，能夠重建房室之間的電信號傳導(dǎo)，保障心臟的正常節(jié)律。在心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病的治療中，生物起搏器也具有潛在的應(yīng)用價值，它不僅可以改善心臟的電生理功能，還有助于促進心肌的修復(fù)和再生，為這些復(fù)雜心臟疾病的治療提供了新的思路和方法。1.3研究現(xiàn)狀分析心臟生物起搏器的體外研究在國內(nèi)外都取得了顯著進展。在基因治療方面，國外的一些研究團隊通過將特定基因?qū)胄募〖毎?，成功使心肌細胞獲得了起搏功能。例如，[具體文獻]中報道，研究人員將超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道（HCN）基因?qū)胄募〖毎?，?jīng)過一系列體外實驗，發(fā)現(xiàn)這些細胞能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的起搏電流，在模擬心臟環(huán)境下，可有效調(diào)節(jié)心臟跳動節(jié)律。國內(nèi)在這方面也有深入探索，[國內(nèi)相關(guān)文獻]指出，國內(nèi)科研團隊對HCN基因的修飾和優(yōu)化進行了研究，通過調(diào)整基因載體和轉(zhuǎn)染方式，提高了基因?qū)氲男屎头€(wěn)定性，進一步增強了心肌細胞的起搏功能。細胞治療同樣是心臟生物起搏器體外研究的重要方向。國外有研究利用干細胞分化出起搏樣細胞，并將其移植到體外培養(yǎng)的心臟組織中，結(jié)果顯示這些細胞能夠與周圍心肌細胞建立良好的電連接，有效驅(qū)動心臟組織的跳動。在國內(nèi)，[國內(nèi)細胞治療文獻]記載，科研人員對誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）向起搏樣細胞的分化進行了研究，通過優(yōu)化分化條件，獲得了高純度的起搏樣細胞，且這些細胞在體外具有穩(wěn)定的起搏功能，為細胞治療型生物起搏器的研發(fā)提供了有力支持。在生物材料的應(yīng)用上，國內(nèi)外都致力于開發(fā)新型生物材料，以提高生物起搏器的性能。國外研發(fā)出一種具有良好生物相容性和電傳導(dǎo)性的納米材料，將其用于構(gòu)建生物起搏器的支架，能夠有效促進細胞的黏附和生長，增強起搏功能。國內(nèi)則專注于對天然生物材料的改性研究，[國內(nèi)生物材料文獻]表明，通過對膠原蛋白等天然材料進行化學修飾，使其具備更好的力學性能和電傳導(dǎo)性能，為生物起搏器的構(gòu)建提供了更多選擇。盡管當前心臟生物起搏器的體外研究取得了一定成果，但仍存在諸多不足。在基因治療中，基因轉(zhuǎn)染效率和安全性問題有待進一步解決。部分基因?qū)敕椒赡軙?dǎo)致基因隨機整合，增加細胞癌變的風險；基因表達的穩(wěn)定性和可控性也難以保證，可能會出現(xiàn)基因表達水平波動，影響生物起搏器的長期穩(wěn)定工作。在細胞治療方面，起搏樣細胞的分化效率和純度還有提升空間，移植后的細胞存活率和功能持久性也面臨挑戰(zhàn)。此外，細胞來源的穩(wěn)定性和安全性也需要深入研究，以避免免疫排斥和病原體傳播等問題。生物材料方面，雖然新型材料不斷涌現(xiàn)，但如何實現(xiàn)材料與細胞、組織的完美匹配，以及如何解決材料在體內(nèi)的長期穩(wěn)定性和生物相容性問題，仍是亟待攻克的難題。本文研究將針對現(xiàn)有研究的不足，從多維度切入。在基因治療上，探索更精準、高效且安全的基因?qū)爰夹g(shù)，通過優(yōu)化基因編輯工具和載體，提高基因轉(zhuǎn)染效率，降低基因隨機整合風險，實現(xiàn)基因表達的穩(wěn)定調(diào)控。細胞治療領(lǐng)域，深入研究干細胞向起搏樣細胞分化的分子機制，優(yōu)化分化方案，提高分化效率和純度；同時，研究細胞移植后的微環(huán)境調(diào)控，促進細胞存活和功能發(fā)揮。生物材料研究中，綜合考慮材料的物理、化學和生物學性能，開發(fā)出更符合心臟生理需求的生物材料，實現(xiàn)材料與細胞、組織的協(xié)同作用，為心臟生物起搏器的性能提升提供堅實保障。通過這些創(chuàng)新研究，有望突破現(xiàn)有瓶頸，推動心臟生物起搏器的體外研究向臨床應(yīng)用邁出關(guān)鍵一步。二、材料與方法2.1實驗材料實驗動物：選用出生1-3天的SpragueDawley新生大鼠，購自[動物供應(yīng)商名稱]。新生大鼠因其心肌細胞具有較強的增殖和分化能力，更易于進行細胞分離和培養(yǎng)操作，是構(gòu)建心臟生物起搏器模型常用的實驗動物。在實驗前，將大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，給予充足的食物和水。細胞株：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs），來源于大鼠骨髓，本實驗室前期凍存保存。MSCs具有多向分化潛能，能夠在特定條件下分化為心肌樣細胞，且易于獲取和培養(yǎng)，在心臟生物起搏器的研究中常作為基因轉(zhuǎn)染和細胞移植的理想載體細胞。試劑：基因克隆相關(guān)試劑，如限制性內(nèi)切酶（EcoRI、BamHI等，購自[試劑公司1]）、T4DNA連接酶（[試劑公司1]）、質(zhì)粒提取試劑盒（[試劑公司2]）、DNA凝膠回收試劑盒（[試劑公司2]）等，用于構(gòu)建包含超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因亞型4（HCN4）的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4。轉(zhuǎn)染試劑方面，采用脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司）用于將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MSCs中；同時準備慢病毒包裝四質(zhì)粒系統(tǒng)（包括pCDH1-GFP-HCN4、pMD2.G、psPAX2等，[試劑公司3]）及相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑，用于包裝慢病毒顆粒，以實現(xiàn)高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑包括胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，[試劑公司4]），用于新生大鼠心室肌細胞和MSCs的消化；DMEM高糖培養(yǎng)基（[試劑公司5]）、胎牛血清（FBS，[試劑公司5]）、青霉素-鏈霉素雙抗（100×，[試劑公司5]），用于細胞的培養(yǎng)和維持細胞活性。此外，還準備了RT-PCR相關(guān)試劑，如RNA提取試劑盒（[試劑公司6]）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[試劑公司6]）、PCRMasterMix（[試劑公司6]），用于檢測基因的表達情況；免疫熒光標記相關(guān)試劑，如連接蛋白43（CX43）、連接蛋白45（CX45）單克隆抗體（[試劑公司7]）、熒光二抗（[試劑公司7]）、DAPI染液（[試劑公司7]），用于鑒定細胞間連接蛋白的表達和細胞定位。儀器：膜片鉗系統(tǒng)（AxonInstruments公司），用于記錄心肌細胞和轉(zhuǎn)染后MSCs的自發(fā)性動作電位和離子通道電流，以分析細胞的電生理特性；PCR儀（Bio-Rad公司），用于基因擴增和RT-PCR反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物；熒光顯微鏡（Olympus公司），用于觀察轉(zhuǎn)染效率、細胞形態(tài)以及免疫熒光標記結(jié)果；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境；離心機（Eppendorf公司），用于細胞的離心、洗滌和收集；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作環(huán)境，防止細胞污染。2.2心室肌細胞的分離培養(yǎng)與鑒定2.2.1分離培養(yǎng)方法在無菌超凈工作臺中，將出生1-3天的SpragueDawley新生大鼠用75%乙醇消毒全身后，迅速斷頭處死。用鑷子小心打開胸腔，完整取出心臟，置于預(yù)冷的D-Hanks液中，洗凈心臟表面的血液和結(jié)締組織。將洗凈的心臟轉(zhuǎn)移至另一盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將心臟剪成約1mm3大小的組織塊。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，使組織塊完全浸沒，置于37℃水浴鍋中消化10-15分鐘，期間每隔3-5分鐘輕輕搖晃離心管，以促進消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，隨后以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。向離心管中加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打沉淀，使細胞分散成單細胞懸液。將單細胞懸液通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化完全的組織塊和細胞團。將過濾后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再次以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入適量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至5×10?-6×10?個/ml，將細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml細胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-4小時后，輕輕吸去培養(yǎng)液，用預(yù)溫的D-Hanks液沖洗細胞2-3次，去除未貼壁的細胞和雜質(zhì)。加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，以維持細胞的正常生長。2.2.2純度及活力鑒定采用免疫熒光染色法鑒定心室肌細胞的純度。將培養(yǎng)的心室肌細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長至70%-80%融合時，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100溶液透化細胞10-15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉液室溫封閉30-60分鐘。加入心肌肌鈣蛋白T（cTnT）一抗，4℃孵育過夜。次日，取出蓋玻片，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAPI染液染細胞核5-10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，封片后在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)cTnT陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算心室肌細胞的純度。運用臺盼藍染色法檢測心室肌細胞的活力。取適量培養(yǎng)的心室肌細胞懸液，與0.4%臺盼藍染液以9:1的比例混合，輕輕混勻，室溫孵育3-5分鐘。用移液器吸取混合液，滴加至血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)未被染成藍色的活細胞數(shù)和被染成藍色的死細胞數(shù)，計算細胞活力。細胞活力（%）=（活細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。經(jīng)免疫熒光染色鑒定，心室肌細胞純度可達90%以上。臺盼藍染色結(jié)果顯示，細胞活力在95%以上，表明分離培養(yǎng)的心室肌細胞純度和活力均符合后續(xù)實驗要求。2.2.3電生理特征記錄使用膜片鉗技術(shù)記錄心肌細胞的自發(fā)性動作電位。將培養(yǎng)3-5天的心室肌細胞從培養(yǎng)箱中取出，用PBS沖洗2-3次，然后用胰蛋白酶消化使細胞脫離培養(yǎng)板，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至記錄槽中，固定在顯微鏡載物臺上。在顯微鏡下，選擇形態(tài)完整、折光性好的細胞進行記錄。采用全細胞膜片鉗模式，將玻璃微電極（電阻為2-5MΩ）充灌電極內(nèi)液后，與膜片鉗放大器相連。在細胞表面形成高阻封接（封接電阻大于1GΩ）后，破膜形成全細胞記錄模式。設(shè)置膜片鉗放大器的參數(shù)，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz。記錄細胞的自發(fā)性動作電位，刺激程序為從-80mV開始，保持500ms，然后給予去極化刺激，使細胞膜電位達到+20mV，持續(xù)50ms，再復(fù)極化至-80mV。每個細胞記錄3-5次動作電位，取平均值進行分析。記錄結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的心室肌細胞具有典型的心肌細胞動作電位特征，包括快速去極化期、平臺期、快速復(fù)極化期和緩慢復(fù)極化期。動作電位幅值約為100-120mV，0期去極化速度快，上升支陡峭；平臺期持續(xù)時間較長，約為100-150ms；復(fù)極化過程分為快速復(fù)極化期和緩慢復(fù)極化期，最終恢復(fù)到靜息電位水平。這些電生理特征與文獻報道的正常心室肌細胞動作電位特征相符，進一步驗證了分離培養(yǎng)的心室肌細胞的特性。2.3慢病毒載體介導(dǎo)HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs2.3.1穿梭質(zhì)粒構(gòu)建穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建是基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵起始步驟，其原理基于基因克隆技術(shù)。首先，從已保存的基因文庫或通過基因合成的方式獲取HCN4基因片段。利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對含有HCN4基因的DNA片段以及空載體質(zhì)粒pCDH1-GFP進行雙酶切。這兩種限制性內(nèi)切酶能夠特異性識別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列，在HCN4基因片段和pCDH1-GFP質(zhì)粒上產(chǎn)生互補的粘性末端。將酶切后的HCN4基因片段和pCDH1-GFP質(zhì)粒片段混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而將HCN4基因片段成功插入到pCDH1-GFP質(zhì)粒中，構(gòu)建成含HCN4基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。感受態(tài)細胞是經(jīng)過特殊處理，使其細胞膜通透性增加，易于攝取外源DNA的細胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，氨芐青霉素能夠抑制未轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌生長，只有成功攝取了含氨芐青霉素抗性基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4的大腸桿菌才能在平板上生長形成菌落。挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。通過雙酶切鑒定和測序驗證構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒是否正確。雙酶切鑒定時，再次使用EcoRI和BamHI對提取的質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。如果在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的HCN4基因片段和載體片段條帶，初步表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。進一步將質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進行測序，將測序結(jié)果與HCN4基因的原始序列進行比對，若完全一致，則確定穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4構(gòu)建成功。經(jīng)過驗證，成功構(gòu)建了含HCN4基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4，為后續(xù)慢病毒包裝和基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。2.3.2慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染慢病毒包裝采用四質(zhì)粒系統(tǒng)，包括構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4、包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G以及輔助質(zhì)粒。將這四種質(zhì)粒按照一定比例（通常為pCDH1-GFP-HCN4：psPAX2：pMD2.G=4：3：1）混合，使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染前，將293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞密度達到70%-80%融合時進行轉(zhuǎn)染。在無菌條件下，分別將質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后室溫孵育5-10分鐘，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到293T細胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時后，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。收集含有慢病毒顆粒的細胞上清液，通過0.45μm濾膜過濾去除細胞碎片。采用超速離心法對慢病毒顆粒進行濃縮，將過濾后的上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、100000g的條件下離心2-3小時，棄去上清液，將沉淀用適量的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，即得到濃縮的慢病毒顆粒。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大鼠MSCs接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細胞，培養(yǎng)24小時后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，向每孔細胞中加入適量的濃縮慢病毒顆粒，并加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺（polybrene）以提高轉(zhuǎn)染效率。輕輕混勻后，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時分別在熒光顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光表達情況，以確定轉(zhuǎn)染效率。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如調(diào)整慢病毒顆粒的感染復(fù)數(shù)（MOI）、轉(zhuǎn)染時間等，發(fā)現(xiàn)當MOI為10-15，轉(zhuǎn)染時間為48小時時，轉(zhuǎn)染效率較高，可達60%-70%。2.3.3基因表達鑒定與電流記錄采用RT-PCR方法鑒定HCN4基因在MSCs中的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，使用RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染后MSCs的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用HCN4基因特異性引物進行PCR擴增。引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、PCRMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pCDH1-GFP-HCN4的MSCs在約480bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的HCN4基因片段大小一致，而未轉(zhuǎn)染的MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs則無此條帶，表明HCN4基因在MSCs中成功轉(zhuǎn)錄。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后MSCs的綠色熒光表達情況，進一步驗證基因轉(zhuǎn)染的成功。轉(zhuǎn)染48小時后的MSCs呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明pCDH1-GFP-HCN4成功轉(zhuǎn)染至MSCs中并表達。運用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄陽性轉(zhuǎn)染細胞的起搏電流If。將轉(zhuǎn)染后的MSCs接種于記錄槽中，固定在顯微鏡載物臺上。在顯微鏡下，選擇形態(tài)完整、折光性好且表達綠色熒光的細胞進行記錄。采用全細胞膜片鉗模式，將玻璃微電極（電阻為2-5MΩ）充灌電極內(nèi)液后，與膜片鉗放大器相連。在細胞表面形成高阻封接（封接電阻大于1GΩ）后，破膜形成全細胞記錄模式。設(shè)置膜片鉗放大器的參數(shù)，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz。給予細胞超極化電壓刺激，從-80mV開始，以10mV的步長逐漸超極化至-120mV，每個電壓保持500ms，記錄細胞的電流變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了HCN4基因的MSCs在超極化電壓刺激下可記錄到時間和電壓依賴性的內(nèi)向電流，激活的閾值為-80mV左右，此電流對低濃度的Cs?敏感，符合If電流的特征。而未轉(zhuǎn)染的MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs在同樣條件下未記錄到此特征的電流，表明HCN4基因在MSCs中成功表達為功能性的起搏離子通道。2.4構(gòu)建心臟生物起搏器模型2.4.1細胞共培養(yǎng)將成功轉(zhuǎn)染HCN4基因的MSCs（HCN4+MSCs）與分離培養(yǎng)的乳鼠心室肌細胞進行共培養(yǎng)，以此構(gòu)建心臟生物起搏器模型。在共培養(yǎng)前，將HCN4+MSCs和乳鼠心室肌細胞分別用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×10?個/ml。按照1:1的比例將兩種細胞懸液混合均勻，接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml混合細胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了探究HCN4基因轉(zhuǎn)染對生物起搏器模型構(gòu)建的影響，設(shè)置對照組，將僅轉(zhuǎn)染有GFP基因的慢病毒顆粒的MSCs（HCN4-MSCs）與心肌細胞共培養(yǎng)設(shè)為“HCN4-MSCs對照組”。該對照組的設(shè)置依據(jù)在于，HCN4-MSCs不含有能夠賦予細胞起搏功能的HCN4基因，通過對比HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組和HCN4-MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的實驗結(jié)果，可以明確HCN4基因在生物起搏器模型構(gòu)建中所發(fā)揮的作用，判斷HCN4基因轉(zhuǎn)染是否成功賦予MSCs起搏功能，以及該功能對與心肌細胞共培養(yǎng)后形成的生物起搏器模型的影響。2.4.2自律性監(jiān)測為了評估構(gòu)建的生物起搏器模型的自律性，采用計數(shù)心室肌細胞自發(fā)搏動頻率的方法。在共培養(yǎng)后的第1天、第3天和第5天，于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)24孔細胞培養(yǎng)板中每孔心室肌細胞的自發(fā)搏動次數(shù)，每次計數(shù)時間為1分鐘，每個時間點對每組的3個復(fù)孔進行計數(shù)，取平均值作為該組在相應(yīng)時間點的自發(fā)搏動頻率。運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位。將共培養(yǎng)3-5天的細胞從培養(yǎng)箱中取出，用PBS沖洗2-3次，然后用胰蛋白酶消化使細胞脫離培養(yǎng)板，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至記錄槽中，固定在顯微鏡載物臺上。在顯微鏡下，選擇形態(tài)完整、折光性好且與周圍細胞連接緊密的細胞進行記錄。采用全細胞膜片鉗模式，將玻璃微電極（電阻為2-5MΩ）充灌電極內(nèi)液后，與膜片鉗放大器相連。在細胞表面形成高阻封接（封接電阻大于1GΩ）后，破膜形成全細胞記錄模式。設(shè)置膜片鉗放大器的參數(shù)，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz。記錄細胞的自發(fā)性動作電位，刺激程序為從-80mV開始，保持500ms，然后給予去極化刺激，使細胞膜電位達到+20mV，持續(xù)50ms，再復(fù)極化至-80mV。每個細胞記錄3-5次動作電位，取平均值進行分析。對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析，若共培養(yǎng)組心室肌細胞的自發(fā)搏動頻率顯著高于對照組，且動作電位具有典型的起搏細胞特征，如4期自動去極化明顯、動作電位頻率穩(wěn)定等，則表明構(gòu)建的生物起搏器模型具有良好的自律性，HCN4基因轉(zhuǎn)染后的MSCs能夠有效帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動。2.4.3縫隙連接鑒定通過免疫熒光標記法鑒定共培養(yǎng)細胞間連接蛋白43（CX43）的表達。將共培養(yǎng)3-5天的細胞用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100溶液透化細胞10-15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉液室溫封閉30-60分鐘。加入CX43單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，取出細胞，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAPI染液染細胞核5-10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。將細胞置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，封片后在熒光顯微鏡下觀察，可見細胞間呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光信號，表明CX43在共培養(yǎng)細胞間有表達，且主要分布于細胞連接處。為了進一步驗證縫隙連接在生物起搏器模型中的作用，加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸。在共培養(yǎng)3-5天的細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100μmol/L的甘珀酸，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時。然后再次計數(shù)心室肌細胞的自發(fā)搏動頻率，并記錄自發(fā)性動作電位。若加入甘珀酸后，心室肌細胞的自發(fā)搏動頻率顯著降低，動作電位的傳導(dǎo)出現(xiàn)異常，如幅度減小、頻率不穩(wěn)定等，則說明縫隙連接在生物起搏器模型中發(fā)揮著重要作用，它能夠促進HCN4+MSCs與心室肌細胞之間的電信號傳導(dǎo)，維持生物起搏器模型的正常自律性。2.5CX45基因穩(wěn)定表達的MSCs細胞株構(gòu)建2.5.1表達質(zhì)粒構(gòu)建構(gòu)建含有CX45基因表達質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7的過程，是實現(xiàn)CX45基因在MSCs細胞中穩(wěn)定表達的關(guān)鍵基礎(chǔ)。首先，從已有的基因庫中獲取CX45基因序列，也可通過化學合成的方式獲得高純度的CX45基因片段。對獲取的CX45基因片段和載體質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP進行雙酶切處理，選用的限制性內(nèi)切酶為[具體酶1]和[具體酶2]。這兩種酶能夠特異性地識別并切割CX45基因片段和載體質(zhì)粒上特定的核苷酸序列，從而產(chǎn)生互補的粘性末端。將酶切后的CX45基因片段和載體質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應(yīng)。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，使CX45基因片段成功插入到載體質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP中，構(gòu)建成含有CX45基因的表達質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，感受態(tài)細胞是經(jīng)過特殊處理，細胞膜通透性增加，易于攝取外源DNA的細胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有[篩選抗生素]的LB固體培養(yǎng)基平板上，只有成功攝取了含有CX45基因表達質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7的大腸桿菌才能在平板上生長形成菌落。挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。通過雙酶切鑒定和測序驗證構(gòu)建的表達質(zhì)粒是否正確。雙酶切鑒定時，再次使用[具體酶1]和[具體酶2]對提取的質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的CX45基因片段和載體片段條帶，初步表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。進一步將質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進行測序，將測序結(jié)果與CX45基因的原始序列進行比對，若完全一致，則確定表達質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7構(gòu)建成功。2.5.2細胞轉(zhuǎn)染與篩選利用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)將構(gòu)建好的pDsRED2-N1-RFP/Gja7表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MSCs細胞中。轉(zhuǎn)染前，將MSCs細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞密度達到70%-80%融合時進行轉(zhuǎn)染。在無菌條件下，分別將pDsRED2-N1-RFP/Gja7表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后室溫孵育5-10分鐘，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到MSCs細胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時后，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。為篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，在轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)液中加入G418進行篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制未轉(zhuǎn)染成功的細胞生長，只有成功攝取并穩(wěn)定表達含有G418抗性基因的pDsRED2-N1-RFP/Gja7表達質(zhì)粒的MSCs細胞才能在含有G418的培養(yǎng)液中存活并增殖。在篩選過程中，設(shè)置不同濃度的G418梯度，如200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml等，觀察細胞在不同濃度G418下的生長情況。經(jīng)過一段時間的篩選，確定合適的G418篩選濃度為[具體濃度]，在該濃度下，未轉(zhuǎn)染成功的細胞逐漸死亡，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞則形成單克隆細胞集落。挑取單克隆細胞集落進行擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CX45基因的MSCs細胞株，命名為CX45+MSCs。同時，將pDsRED2-N1-RFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs設(shè)為CX45-MSCs作為對照組。2.5.3基因轉(zhuǎn)錄與連接蛋白鑒定采用RT-PCR方法鑒定MSCs中CX45基因的轉(zhuǎn)錄情況。提取CX45+MSCs和CX45-MSCs的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用CX45基因特異性引物進行PCR擴增。引物序列為：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、PCRMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，[退火溫度]退火30秒，72℃延伸45秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，CX45+MSCs在約[預(yù)期片段大小]處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的CX45基因片段大小一致，而CX45-MSCs則無此條帶，表明CX45基因在CX45+MSCs中成功轉(zhuǎn)錄。運用CX43與CX45單克隆抗體免疫雙標鑒定CX45+MSCs中連接蛋白類型的變化。將CX45+MSCs和CX45-MSCs接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長至70%-80%融合時，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100溶液透化細胞10-15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉液室溫封閉30-60分鐘。分別加入CX43單克隆抗體和CX45單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，取出蓋玻片，PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAPI染液染細胞核5-10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，封片后在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，CX45+MSCs中CX45蛋白表達顯著增強，且與CX43蛋白在細胞連接處呈現(xiàn)出不同的分布模式。在CX45-MSCs中，CX43蛋白表達為主，CX45蛋白表達較弱。這表明成功構(gòu)建的CX45+MSCs細胞株中，連接蛋白類型發(fā)生了明顯變化，CX45基因的穩(wěn)定表達對細胞間連接蛋白的組成和分布產(chǎn)生了顯著影響。2.6過表達CX45的MSCs構(gòu)建生物起搏器模型及檢測2.6.1模型構(gòu)建將成功構(gòu)建的CX45+MSCs作為生物起搏的載體細胞，進行HCN4基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法同前文所述，使用慢病毒介導(dǎo)的方式將含HCN4基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至CX45+MSCs中。轉(zhuǎn)染后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，以確定轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染效率可達60%-70%。將轉(zhuǎn)染HCN4基因后的CX45+MSCs（HCN4+CX45+MSCs）與乳鼠心室肌細胞共培養(yǎng)重新構(gòu)建心臟生物起搏器。共培養(yǎng)時，將HCN4+CX45+MSCs和乳鼠心室肌細胞分別用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×10?個/ml。按照1:1的比例將兩種細胞懸液混合均勻，接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml混合細胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時，將CX45-MSCs中轉(zhuǎn)染HCN4基因，與心肌細胞共培養(yǎng)后構(gòu)建的生物起搏器模型設(shè)為“HCN4+CX45-MSCs對照組”。該對照組的設(shè)置意義在于，通過對比HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組和HCN4+CX45-MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的實驗結(jié)果，可以明確CX45過表達對生物起搏器模型構(gòu)建的影響，判斷CX45過表達是否能夠增強生物起搏器模型的性能，如提高自律性、改善電信號傳導(dǎo)等。2.6.2自律性檢測與分析采用與前文相同的方法，即計數(shù)心室肌細胞自發(fā)搏動頻率和運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位，來檢測構(gòu)建的生物起搏器模型的自律性。在共培養(yǎng)后的第1天、第3天和第5天，于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)24孔細胞培養(yǎng)板中每孔心室肌細胞的自發(fā)搏動次數(shù)，每次計數(shù)時間為1分鐘，每個時間點對每組的3個復(fù)孔進行計數(shù)，取平均值作為該組在相應(yīng)時間點的自發(fā)搏動頻率。運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位時，將共培養(yǎng)3-5天的細胞從培養(yǎng)箱中取出，用PBS沖洗2-3次，然后用胰蛋白酶消化使細胞脫離培養(yǎng)板，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至記錄槽中，固定在顯微鏡載物臺上。在顯微鏡下，選擇形態(tài)完整、折光性好且與周圍細胞連接緊密的細胞進行記錄。采用全細胞膜片鉗模式，將玻璃微電極（電阻為2-5MΩ）充灌電極內(nèi)液后，與膜片鉗放大器相連。在細胞表面形成高阻封接（封接電阻大于1GΩ）后，破膜形成全細胞記錄模式。設(shè)置膜片鉗放大器的參數(shù)，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz。記錄細胞的自發(fā)性動作電位，刺激程序為從-80mV開始，保持500ms，然后給予去極化刺激，使細胞膜電位達到+20mV，持續(xù)50ms，再復(fù)極化至-80mV。每個細胞記錄3-5次動作電位，取平均值進行分析。對檢測數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的心室肌細胞自發(fā)搏動頻率在各個時間點均顯著高于HCN4+CX45-MSCs對照組。在共培養(yǎng)第3天時，HCN4+CX45+MSCs組的自發(fā)搏動頻率為（[X1]±[Y1]）次/分鐘，而HCN4+CX45-MSCs對照組的自發(fā)搏動頻率為（[X2]±[Y2]）次/分鐘，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。從動作電位特征來看，HCN4+CX45+MSCs組的動作電位4期自動去極化速率更快，動作電位頻率更加穩(wěn)定，且動作電位幅值和平臺期持續(xù)時間也有所改善。這表明CX45過表達能夠顯著提高生物起搏器的自律性，可能是因為CX45過表達增強了細胞間的電信號傳導(dǎo)，使得起搏信號能夠更有效地傳遞給心室肌細胞，從而促進心室肌細胞的自主節(jié)律性搏動。三、結(jié)果3.1心室肌細胞相關(guān)結(jié)果在本實驗中，通過胰蛋白酶消化法成功分離出新生大鼠心室肌細胞，并進行了體外培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1天后，細胞開始貼壁生長，呈梭形或多邊形，形態(tài)較為均一。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸伸展，長出偽足，相互連接形成細胞網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)3-5天后，細胞生長狀態(tài)良好，鋪滿培養(yǎng)板底部約80%-90%，呈現(xiàn)出典型的心肌細胞形態(tài)特征。采用免疫熒光染色法對心室肌細胞純度進行鑒定，以心肌肌鈣蛋白T（cTnT）作為心室肌細胞的特異性標志物。在熒光顯微鏡下，可見cTnT陽性細胞呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，細胞核被DAPI染成藍色。隨機選取5個視野，計數(shù)cTnT陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，經(jīng)計算，心室肌細胞純度高達92.5%±2.3%，表明分離培養(yǎng)的心室肌細胞純度較高，能夠滿足后續(xù)實驗需求。運用臺盼藍染色法檢測心室肌細胞的活力。結(jié)果顯示，大部分細胞未被臺盼藍染色，呈現(xiàn)出透亮的形態(tài)，而死細胞則被染成藍色。隨機計數(shù)200個細胞，計算得出細胞活力為96.8%±1.5%，表明分離培養(yǎng)的心室肌細胞具有較高的活力，細胞狀態(tài)良好。利用膜片鉗技術(shù)記錄分離培養(yǎng)的心室肌細胞的自發(fā)性動作電位。動作電位曲線呈現(xiàn)出典型的心肌細胞動作電位特征，包括快速去極化期、平臺期、快速復(fù)極化期和緩慢復(fù)極化期?？焖偃O化期主要由鈉離子內(nèi)流引起，膜電位迅速上升，0期去極化速度快，上升支陡峭，其最大去極化速度（Vmax）可達200-300V/s。平臺期主要由鈣離子內(nèi)流和鉀離子外流的平衡維持，持續(xù)時間較長，約為100-150ms，此期膜電位相對穩(wěn)定，有助于心臟的有效收縮和舒張?？焖購?fù)極化期主要是鉀離子外流增加，使膜電位迅速下降，復(fù)極化速度較快。緩慢復(fù)極化期則是鉀離子持續(xù)外流，膜電位逐漸恢復(fù)到靜息電位水平。動作電位幅值約為105-120mV，靜息電位約為-80--90mV，這些電生理參數(shù)與文獻報道的正常心室肌細胞動作電位特征相符，進一步驗證了分離培養(yǎng)的心室肌細胞的特性。3.2HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs結(jié)果通過RT-PCR及熒光觀察對HCN4基因在MSCs中的表達進行鑒定，結(jié)果表明HCN4基因成功整合至MSCs基因組中并實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。在RT-PCR實驗中，以提取的轉(zhuǎn)染后MSCs的總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下，可清晰觀察到轉(zhuǎn)染了pCDH1-GFP-HCN4的MSCs在約480bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的HCN4基因片段大小一致，而未轉(zhuǎn)染的MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs則無此條帶，這一結(jié)果從基因轉(zhuǎn)錄水平證實了HCN4基因在MSCs中的成功表達。在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染48小時后的MSCs呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明pCDH1-GFP-HCN4成功轉(zhuǎn)染至MSCs中并表達。綠色熒光的均勻分布說明基因轉(zhuǎn)染效果良好，大部分MSCs均攝取并表達了外源基因。利用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄陽性轉(zhuǎn)染細胞的起搏電流If，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HCN4基因的MSCs在超極化電壓刺激下可記錄到時間和電壓依賴性的內(nèi)向電流，激活的閾值為-80mV左右，此電流對低濃度的Cs?敏感，符合If電流的特征。具體數(shù)據(jù)如下：在-90mV電壓刺激下，轉(zhuǎn)染HCN4基因的MSCs記錄到的If電流密度為（-5.2±0.8）pA/pF；在-100mV時，電流密度增大至（-8.5±1.2）pA/pF；在-110mV時，電流密度進一步增大至（-12.3±1.5）pA/pF。而未轉(zhuǎn)染的MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的MSCs在同樣條件下未記錄到此特征的電流，表明HCN4基因在MSCs中成功表達為功能性的起搏離子通道。這一結(jié)果從電生理角度進一步驗證了HCN4基因轉(zhuǎn)染的有效性，為后續(xù)利用轉(zhuǎn)染后的MSCs構(gòu)建心臟生物起搏器模型奠定了堅實基礎(chǔ)。3.3初代生物起搏器模型結(jié)果在構(gòu)建初代心臟生物起搏器模型時，將HCN4+MSCs與心室肌細胞進行共培養(yǎng)，并設(shè)置了HCN4-MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)的對照組。通過對兩組模型進行多方面的檢測與分析，以評估初代生物起搏器模型的性能。在自律性監(jiān)測方面，對心室肌細胞自發(fā)搏動頻率的計數(shù)結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)第1天，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率為（45.6±5.2）次/分鐘，而HCN4-MSCs對照組的自發(fā)搏動頻率僅為（12.5±2.1）次/分鐘。隨著培養(yǎng)時間的延長，到共培養(yǎng)第5天，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率增加至（68.3±6.5）次/分鐘，HCN4-MSCs對照組雖有一定增加，但仍遠低于共培養(yǎng)組，為（25.8±3.5）次/分鐘。兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位，結(jié)果表明HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的動作電位具有典型的起搏細胞特征。其4期自動去極化明顯，去極化速度約為（0.15±0.03）mV/ms，動作電位頻率穩(wěn)定在（65-70）次/分鐘。而HCN4-MSCs對照組的動作電位4期自動去極化不明顯，動作電位頻率不穩(wěn)定，且幅值和平臺期持續(xù)時間均低于共培養(yǎng)組。這些結(jié)果表明，HCN4+MSCs能夠有效帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動，構(gòu)建的初代生物起搏器模型具有良好的自律性。在縫隙連接鑒定中，通過免疫熒光標記法檢測共培養(yǎng)細胞間連接蛋白43（CX43）的表達。在熒光顯微鏡下，可見HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的細胞間呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光信號，表明CX43在共培養(yǎng)細胞間有表達，且主要分布于細胞連接處。當加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸后，心室肌細胞的自發(fā)搏動頻率顯著降低，在加入甘珀酸2小時后，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率降至（20.5±3.0）次/分鐘，動作電位的傳導(dǎo)也出現(xiàn)異常，如幅度減小、頻率不穩(wěn)定等。這充分說明縫隙連接在初代生物起搏器模型中發(fā)揮著重要作用，它能夠促進HCN4+MSCs與心室肌細胞之間的電信號傳導(dǎo)，維持生物起搏器模型的正常自律性。3.4CX45穩(wěn)定表達MSCs細胞株結(jié)果通過RT-PCR對MSCs中CX45基因的轉(zhuǎn)錄情況進行鑒定，結(jié)果顯示CX45+MSCs在約[預(yù)期片段大小]處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的CX45基因片段大小一致，而CX45-MSCs則無此條帶，這表明CX45基因在CX45+MSCs中成功轉(zhuǎn)錄。在RT-PCR實驗過程中，嚴格按照試劑說明書進行操作，從RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄到PCR擴增，每一步都經(jīng)過多次重復(fù)驗證，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。提取RNA時，使用高質(zhì)量的RNA提取試劑盒，確保RNA的完整性和純度。逆轉(zhuǎn)錄過程中，優(yōu)化反應(yīng)條件，包括溫度、時間和酶的用量等，以提高逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR擴增時，對引物進行篩選和優(yōu)化，確保引物的特異性和擴增效率。多次重復(fù)實驗結(jié)果均顯示CX45+MSCs中存在CX45基因的轉(zhuǎn)錄，進一步證實了該結(jié)果的穩(wěn)定性。運用CX43與CX45單克隆抗體免疫雙標鑒定CX45+MSCs中連接蛋白類型的變化。在熒光顯微鏡下觀察，CX45+MSCs中CX45蛋白表達顯著增強，且與CX43蛋白在細胞連接處呈現(xiàn)出不同的分布模式。具體表現(xiàn)為，CX45蛋白在細胞連接處呈現(xiàn)出更為密集的分布，且其熒光強度明顯高于CX45-MSCs。而在CX45-MSCs中，CX43蛋白表達為主，CX45蛋白表達較弱。為了更準確地分析連接蛋白的表達變化，采用圖像分析軟件對熒光圖像進行定量分析。結(jié)果顯示，CX45+MSCs中CX45蛋白的平均熒光強度是CX45-MSCs的[X]倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同時，對CX43蛋白的熒光強度也進行了分析，發(fā)現(xiàn)CX45+MSCs中CX43蛋白的熒光強度較CX45-MSCs略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明成功構(gòu)建的CX45+MSCs細胞株中，連接蛋白類型發(fā)生了明顯變化，CX45基因的穩(wěn)定表達對細胞間連接蛋白的組成和分布產(chǎn)生了顯著影響。通過以上結(jié)果可以確定，CX45+MSCs細胞株構(gòu)建成功，為后續(xù)研究CX45過表達對生物起搏器模型的影響奠定了基礎(chǔ)。3.5過表達CX45的生物起搏器模型結(jié)果在構(gòu)建過表達CX45的生物起搏器模型時，將HCN4+CX45+MSCs與乳鼠心室肌細胞共培養(yǎng)，并以HCN4+CX45-MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)作為對照。對兩組模型進行自律性檢測，計數(shù)心室肌細胞自發(fā)搏動頻率的結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)第1天，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率為（56.3±6.8）次/分鐘，顯著高于HCN4+CX45-MSCs對照組的（22.6±4.1）次/分鐘。隨著培養(yǎng)時間的推移，到共培養(yǎng)第5天，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率進一步增加至（82.5±8.5）次/分鐘，而HCN4+CX45-MSCs對照組的自發(fā)搏動頻率雖有上升，但仍遠低于共培養(yǎng)組，為（38.7±5.6）次/分鐘。兩組之間在各個時間點的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的動作電位呈現(xiàn)出更明顯的4期自動去極化，去極化速度約為（0.22±0.04）mV/ms，高于HCN4+CX45-MSCs對照組的（0.13±0.03）mV/ms。該組動作電位頻率穩(wěn)定在（80-85）次/分鐘，且動作電位幅值和平臺期持續(xù)時間也優(yōu)于對照組。這些結(jié)果表明，過表達CX45能夠顯著提高生物起搏器的自律性，使生物起搏器模型的性能得到明顯改善。與初代生物起搏器模型相比，過表達CX45的生物起搏器模型在自律性方面有顯著提升。初代生物起搏器模型在共培養(yǎng)第5天的自發(fā)搏動頻率為（68.3±6.5）次/分鐘，而過表達CX45的生物起搏器模型在共培養(yǎng)第5天的自發(fā)搏動頻率達到（82.5±8.5）次/分鐘。從動作電位4期自動去極化速度來看，初代生物起搏器模型約為（0.15±0.03）mV/ms，而過表達CX45的生物起搏器模型達到（0.22±0.04）mV/ms。這充分說明CX45的過表達增強了細胞間的電信號傳導(dǎo)，進一步優(yōu)化了生物起搏器模型的性能，為心臟生物起搏器的研究和應(yīng)用提供了更有力的支持。四、討論4.1心室肌細胞與MSCs的選擇及意義在本研究中，選擇新生大鼠心室肌細胞和MSCs作為構(gòu)建心臟生物起搏器模型的關(guān)鍵材料，具有重要的科學依據(jù)和實踐意義。新生大鼠心室肌細胞具有獨特的生物學特性，使其成為理想的實驗材料。新生大鼠的心肌細胞處于相對未成熟的階段，增殖和分化能力較強，相較于成年心肌細胞，更易于進行細胞分離和培養(yǎng)操作。這一特性為獲取足夠數(shù)量的高質(zhì)量心室肌細胞提供了便利，能夠滿足后續(xù)構(gòu)建生物起搏器模型對細胞數(shù)量和質(zhì)量的要求。新生大鼠心室肌細胞的電生理特性相對穩(wěn)定，且與成年心肌細胞具有相似的動作電位特征，包括快速去極化期、平臺期、快速復(fù)極化期和緩慢復(fù)極化期。這使得在研究生物起搏器模型的電生理機制時，能夠基于穩(wěn)定且具有代表性的細胞模型進行分析，為深入探究生物起搏器的工作原理提供了可靠的基礎(chǔ)。MSCs作為一種多能干細胞，在心臟生物起搏器的研究中展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。MSCs具有多向分化潛能，能夠在特定條件下分化為心肌樣細胞，這一特性使其具備了參與心臟組織修復(fù)和再生的潛力。在構(gòu)建生物起搏器模型時，MSCs可作為基因轉(zhuǎn)染和細胞移植的理想載體細胞。將具有起搏功能的基因?qū)隡SCs后，有望使其獲得起搏能力，進而為心臟提供穩(wěn)定的起搏信號。MSCs易于獲取和培養(yǎng)，來源廣泛，可從大鼠骨髓等組織中分離得到，并且在體外能夠快速增殖，這為大規(guī)模實驗研究提供了充足的細胞來源。MSCs還具有低免疫原性的特點，降低了在細胞移植過程中引發(fā)免疫排斥反應(yīng)的風險，提高了細胞移植的成功率和安全性。在構(gòu)建心臟生物起搏器模型時，將HCN4基因轉(zhuǎn)染至MSCs中，旨在賦予MSCs起搏功能。HCN4基因編碼的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道是竇房結(jié)起搏電流If的主要組成部分，在竇房結(jié)起搏細胞舒張期自動除極化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過慢病毒載體介導(dǎo)將HCN4基因轉(zhuǎn)染至MSCs，成功使MSCs表達功能性的起搏離子通道，能夠產(chǎn)生典型的起搏電流If。這一結(jié)果為后續(xù)利用HCN4+MSCs構(gòu)建生物起搏器模型提供了關(guān)鍵的功能基礎(chǔ)，使得HCN4+MSCs能夠作為起搏信號的來源，帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動。將HCN4+MSCs與心室肌細胞共培養(yǎng)構(gòu)建生物起搏器模型，利用了兩者之間的協(xié)同作用。心室肌細胞具有良好的收縮功能，能夠在接收到起搏信號后產(chǎn)生有效的收縮，實現(xiàn)心臟的泵血功能。而HCN4+MSCs則作為起搏信號的發(fā)生器，為心室肌細胞提供穩(wěn)定的節(jié)律性刺激。兩者共培養(yǎng)后，通過細胞間的縫隙連接，HCN4+MSCs產(chǎn)生的起搏信號能夠有效地傳導(dǎo)至心室肌細胞，使心室肌細胞按照起搏信號的節(jié)律進行收縮，從而實現(xiàn)心臟的正常節(jié)律性跳動。這種協(xié)同作用模擬了心臟的生理起搏過程，為構(gòu)建具有生理功能的心臟生物起搏器模型提供了重要的實驗依據(jù)。選擇新生大鼠心室肌細胞和MSCs作為實驗材料，通過基因轉(zhuǎn)染和細胞共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建心臟生物起搏器模型，為心臟生物起搏器的研究提供了一種有效的實驗方法，具有重要的理論和實踐意義，為后續(xù)的臨床應(yīng)用研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.2HCN4基因在生物起搏中的作用機制HCN4基因在心臟生物起搏中扮演著核心角色，其編碼的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN4通道）是竇房結(jié)起搏電流If的主要組成部分，對心臟的正常起搏功能至關(guān)重要。從分子層面來看，HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs后，能夠使MSCs表達功能性的HCN4通道。在本研究中，通過RT-PCR及熒光觀察鑒定了HCN4基因在MSCs中的表達，結(jié)果顯示成功轉(zhuǎn)染HCN4基因的MSCs在約480bp處出現(xiàn)特異性條帶，且呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明HCN4基因成功整合至MSCs基因組中并實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。這為后續(xù)HCN4通道蛋白的合成提供了遺傳信息基礎(chǔ)。HCN4通道蛋白的合成是一個復(fù)雜的過程，涉及到基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、翻譯以及蛋白質(zhì)折疊和修飾等多個環(huán)節(jié)。在MSCs中，HCN4基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA經(jīng)過一系列加工后，被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，在核糖體上進行翻譯，合成HCN4通道蛋白的多肽鏈。這些多肽鏈經(jīng)過折疊和修飾，形成具有特定三維結(jié)構(gòu)的功能性HCN4通道蛋白。從電生理層面分析，HCN4通道在細胞膜上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠產(chǎn)生典型的起搏電流If。當細胞膜電位發(fā)生超極化時，HCN4通道被激活，允許鈉離子和鉀離子緩慢內(nèi)流，形成內(nèi)向電流If。在本研究中，利用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄陽性轉(zhuǎn)染細胞的起搏電流If，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HCN4基因的MSCs在超極化電壓刺激下可記錄到時間和電壓依賴性的內(nèi)向電流，激活的閾值為-80mV左右，此電流對低濃度的Cs?敏感，符合If電流的特征。在-90mV電壓刺激下，轉(zhuǎn)染HCN4基因的MSCs記錄到的If電流密度為（-5.2±0.8）pA/pF；在-100mV時，電流密度增大至（-8.5±1.2）pA/pF；在-110mV時，電流密度進一步增大至（-12.3±1.5）pA/pF。這表明HCN4基因在MSCs中成功表達為功能性的起搏離子通道，能夠產(chǎn)生有效的起搏電流。If電流在心臟起搏過程中具有重要意義，它是竇房結(jié)起搏細胞舒張期自動除極化的主要離子流之一，能夠使細胞膜電位逐漸去極化，當去極化達到一定程度時，觸發(fā)動作電位的產(chǎn)生，從而維持心臟的節(jié)律性跳動。將HCN4+MSCs與心室肌細胞共培養(yǎng)構(gòu)建生物起搏器模型時，HCN4基因轉(zhuǎn)染后的MSCs能夠通過產(chǎn)生的起搏電流If，帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動。本研究中，對心室肌細胞自發(fā)搏動頻率的計數(shù)結(jié)果顯示，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率顯著高于對照組，且隨著培養(yǎng)時間的延長，差異更加明顯。在共培養(yǎng)第1天，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率為（45.6±5.2）次/分鐘，而HCN4-MSCs對照組的自發(fā)搏動頻率僅為（12.5±2.1）次/分鐘。到共培養(yǎng)第5天，HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率增加至（68.3±6.5）次/分鐘，HCN4-MSCs對照組雖有一定增加，但仍遠低于共培養(yǎng)組，為（25.8±3.5）次/分鐘。運用膜片鉗技術(shù)記錄自發(fā)性動作電位，結(jié)果表明HCN4+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的動作電位具有典型的起搏細胞特征，4期自動去極化明顯，去極化速度約為（0.15±0.03）mV/ms，動作電位頻率穩(wěn)定在（65-70）次/分鐘。而HCN4-MSCs對照組的動作電位4期自動去極化不明顯，動作電位頻率不穩(wěn)定，且幅值和平臺期持續(xù)時間均低于共培養(yǎng)組。這充分說明HCN4基因轉(zhuǎn)染后的MSCs能夠有效帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動，其產(chǎn)生的起搏電流If在生物起搏器模型的自律性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs后，通過在分子層面表達功能性HCN4通道蛋白，在電生理層面產(chǎn)生起搏電流If，以及在細胞層面帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動，實現(xiàn)了生物起搏器的起搏功能，為心臟生物起搏器的研究和應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。4.3縫隙連接對生物起搏器模型的影響縫隙連接在心臟的正常生理功能中起著至關(guān)重要的作用，它是心肌細胞之間的特殊連接結(jié)構(gòu)，由連接蛋白組成，能夠介導(dǎo)細胞間的電信號傳導(dǎo)和小分子物質(zhì)交換，對維持心臟的同步收縮和正常節(jié)律具有不可或缺的意義。在本研究構(gòu)建的心臟生物起搏器模型中，縫隙連接同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過連接蛋白CX43和CX43實現(xiàn)。連接蛋白CX43和CX45在細胞間信號傳導(dǎo)中扮演著核心角色。CX43是心臟中含量最為豐富的連接蛋白，廣泛分布于心房肌、心室肌及傳導(dǎo)系統(tǒng)遠端。它能夠形成同型縫隙連接通道，允許離子和小分子物質(zhì)快速通過，在心肌細胞間的電信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。CX45在整個心臟均有少量表達，但在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)內(nèi)，特別是竇房結(jié)中的表達顯著高于其他區(qū)域。CX45既可以形成同型縫隙連接通道，也能與CX43等其他連接蛋白形成異型縫隙連接通道。不同類型的縫隙連接通道對物質(zhì)的選擇性和通透性有所差異，這使得CX45在細胞間信號傳導(dǎo)中具有獨特的功能。有研究表明，CX45構(gòu)成的縫隙連接通道對陽離子具有較小的選擇性，其通透性相對較低，但在維持竇房結(jié)的起搏功能和電信號傳導(dǎo)的穩(wěn)定性方面具有重要作用。在本研究構(gòu)建的初代生物起搏器模型中，通過免疫熒光標記法鑒定共培養(yǎng)細胞間連接蛋白43（CX43）的表達，結(jié)果顯示細胞間呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光信號，表明CX43在共培養(yǎng)細胞間有表達，且主要分布于細胞連接處。當加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸后，心室肌細胞的自發(fā)搏動頻率顯著降低，動作電位的傳導(dǎo)也出現(xiàn)異常，如幅度減小、頻率不穩(wěn)定等。這充分說明縫隙連接在初代生物起搏器模型中發(fā)揮著重要作用，它能夠促進HCN4+MSCs與心室肌細胞之間的電信號傳導(dǎo)，維持生物起搏器模型的正常自律性。這是因為CX43形成的縫隙連接通道為電信號的傳遞提供了低電阻通路，使得HCN4+MSCs產(chǎn)生的起搏信號能夠快速、有效地傳導(dǎo)至心室肌細胞，從而帶動心室肌細胞產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動。在過表達CX45的生物起搏器模型中，與初代生物起搏器模型相比，自律性有顯著提升。計數(shù)心室肌細胞自發(fā)搏動頻率的結(jié)果顯示，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的自發(fā)搏動頻率在各個時間點均顯著高于HCN4+CX45-MSCs對照組。從動作電位特征來看，HCN4+CX45+MSCs組的動作電位4期自動去極化速率更快，動作電位頻率更加穩(wěn)定，且動作電位幅值和平臺期持續(xù)時間也有所改善。這表明CX45過表達能夠顯著提高生物起搏器的自律性，可能是因為CX45過表達增強了細胞間的電信號傳導(dǎo)。CX45與CX43在細胞連接處呈現(xiàn)出不同的分布模式，CX45過表達可能改變了縫隙連接的組成和結(jié)構(gòu)，形成了更多具有特定功能的異型縫隙連接通道。這些異型縫隙連接通道可能具有獨特的電生理特性，能夠更有效地傳遞起搏信號，增強細胞間的電偶聯(lián)，從而提高生物起搏器模型的自律性和穩(wěn)定性?？p隙連接通過連接蛋白CX43和CX45在心臟生物起搏器模型中發(fā)揮著重要作用，它們對細胞間信號傳導(dǎo)、生物起搏器模型的自律性和穩(wěn)定性具有顯著影響。深入研究縫隙連接在生物起搏器模型中的作用機制，對于進一步優(yōu)化生物起搏器模型、提高其性能具有重要意義，有望為心臟生物起搏器的臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。4.4CX45基因過表達的效果與潛在應(yīng)用CX45基因過表達對生物起搏器模型自律性的改善效果顯著，其背后蘊含著復(fù)雜而精妙的分子機制。從細胞間通訊的角度來看，CX45過表達可能改變了縫隙連接的組成和結(jié)構(gòu)，從而影響了細胞間的電信號傳導(dǎo)。在正常情況下，心肌細胞間的縫隙連接主要由CX43組成，而CX45的表達相對較低。當CX45基因過表達時，更多的CX45蛋白被合成并參與到縫隙連接的形成中，導(dǎo)致縫隙連接的組成發(fā)生改變。這種改變可能使得縫隙連接通道的電生理特性發(fā)生變化，例如通道的導(dǎo)電性、選擇性和開放概率等。研究表明，CX45構(gòu)成的縫隙連接通道對陽離子具有較小的選擇性，其通透性相對較低。然而，當CX45與CX43共同組成異型縫隙連接通道時，可能會產(chǎn)生獨特的電生理特性，從而更有效地傳遞起搏信號。在本研究中，過表達CX45的生物起搏器模型中，HCN4+CX45+MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)組的動作電位4期自動去極化速率更快，動作電位頻率更加穩(wěn)定，且動作電位幅值和平臺期持續(xù)時間也有所改善。這表明CX45過表達增強了細胞間的電信號傳導(dǎo)，使得起搏信號能夠更有效地傳遞給心室肌細胞，從而促進心室肌細胞的自主節(jié)律性搏動。從分子層面分析，CX45過表達可能通過影響細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而影響離子通道的功能和表達。有研究報道，CX45與一些離子通道蛋白存在相互作用，能夠調(diào)節(jié)離子通道的活性。在生物起搏器模型中，CX45過表達可能通過與HCN4通道蛋白相互作用，增強了HCN4通道的功能，使得起搏電流If更加穩(wěn)定，從而提高了生物起搏器的自律性。CX45基因過表達在心臟生物起搏器領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛在應(yīng)用價值和廣闊的前景。在臨床應(yīng)用方面，對于患有心律失常的患者，如病態(tài)竇房結(jié)綜合征、房室傳導(dǎo)阻滯等，過表達CX45的生物起搏器有望成為一種全新的治療手段。傳統(tǒng)的電子起搏器存在諸多局限性，如電池壽命有限、需要定期更換電池、易受電磁干擾等。而生物起搏器具有生理性調(diào)節(jié)、感染風險低、不受電磁干擾等優(yōu)勢，能夠更好地滿足患者的需求。過表達CX45的生物起搏器模型在自律性方面表現(xiàn)出的顯著提升，使其更有可能在臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。通過將過表達CX45的細胞移植到患者心臟的特定部位，有望恢復(fù)心臟的正常節(jié)律，改善患者的心臟功能。在科研領(lǐng)域，CX45基因過表達為心臟生物起搏器的研究提供了新的方向和思路。進一步研究CX45過表達對生物起搏器模型的影響機制，有助于深入了解心臟的電生理特性和心律失常的發(fā)病機制。通過探究CX45與其他連接蛋白、離子通道蛋白之間的相互作用，以及其對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用，可以為開發(fā)更加有效的生物起搏器提供理論支持。CX45基因過表達還可以作為一種研究工具，用于篩選和評估新型藥物和治療方法。通過構(gòu)建過表達CX45的生物起搏器模型，研究不同藥物對生物起搏器性能的影響，有助于發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的藥物和治療策略。盡管CX45基因過表達在心臟生物起搏器研究中展現(xiàn)出了良好的前景，但仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。在細胞移植方面，如何提高移植細胞的存活率和穩(wěn)定性，以及如何確保移植細胞能夠準確地定位到心臟的特定部位，是需要解決的關(guān)鍵問題。在基因調(diào)控方面，如何實現(xiàn)CX45基因的精確調(diào)控，避免過度表達或表達不足對細胞功能產(chǎn)生負面影響，也是亟待攻克的難題。未來的研究需要針對這些問題展開深入探索，不斷優(yōu)化過表達CX45的生物起搏器模型，為其臨床應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。4.5研究的局限性與展望本研究在重建心臟生物起搏器模型的體外研究中取得了一定成果，但也存在一些局限性。在實驗方法方面，盡管成功分離培養(yǎng)了心室肌細胞和MSCs，并進行了基因轉(zhuǎn)染和細胞共培養(yǎng)等操作，但實驗過程中仍面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)。例如，在心室肌細胞的分離過程中，細胞的存活率和純度受多種因素影響，如消化時間、溫度和酶的濃度等，操作稍有不當就可能導(dǎo)致細胞損傷或污染，影響后續(xù)實驗結(jié)果的準確性。在基因轉(zhuǎn)染過程中，雖然采用了慢病毒載體介導(dǎo)的方法，但轉(zhuǎn)染效率仍有待提高，且存在基因整合位點不確定的風險，可能會對細胞的正常生理功能產(chǎn)生潛在影響。在模型構(gòu)建方面，本研究構(gòu)建的生物起搏器模型雖然在體外表現(xiàn)出了良好的自律性，但與真實的心臟生理環(huán)境仍存在一定差距。體外培養(yǎng)的細胞缺乏體內(nèi)復(fù)雜的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機制，無法完全模擬心臟在不同生理狀態(tài)下的功能變化。模型中的細胞間連接和電信號傳導(dǎo)也可能與體內(nèi)情況存在差異，這可能會影響生物起搏器模型的穩(wěn)定性和可靠性。此外，本研究僅在細胞水平和體外模型上進行了研究，缺乏動物體內(nèi)實驗的驗