ICS11.020

CCSC05

DB22

吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB22/T3567—2023

腫瘤基因突變檢測——高通量測序技術(shù)規(guī)

范

Technicalregulationofnext-generationgenesequencingfortumorgenemutation

detection

2023-09-28發(fā)布2023-11-16實(shí)施

吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布

DB22/T3567—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由吉林省衛(wèi)生健康委員會提出并歸口。

本文件起草單位：吉林大學(xué)。

本文件主要起草人：姜艷芳、胡欣彤、何佳雪、陳立國、王多、李昂、張鵬、劉勇。

I

DB22/T3567—2023

腫瘤基因突變檢測——高通量測序技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了腫瘤基因突變檢測-高通量測序檢測技術(shù)的生物安全要求、材料與試劑、樣本、測序

流程、質(zhì)量控制和廢棄物處理。

本文件適用于腫瘤基因突變檢測的高通量測序檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實(shí)驗室生物安全通用要求

GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程

SN/T1193基因檢驗實(shí)驗室技術(shù)要求

YY/T1723高通量基因測序儀

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4生物安全要求

4.1采樣及檢測過程所涉及的實(shí)驗操作應(yīng)按GB19489、GB/T30989、SN/T1193規(guī)定執(zhí)行。

4.2為保證生物安全，檢測應(yīng)在指定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。區(qū)域分區(qū)可分為：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、打

斷區(qū)、文庫制備區(qū)、擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)、測序區(qū)等，見圖1。

圖1

5材料與試劑

5.1儀器與耗材

1

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5.1.1微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。

5.1.2微量帶濾芯吸頭：10μL、100μL、200μL、1000μL。

5.1.3實(shí)時熒光定量PCR儀。

5.1.4離心管：200μL、1.5mL、2mL、10mL、15mL。

5.1.5高通量測序儀：高通量測序儀質(zhì)量應(yīng)符合YY/T1723的要求。

5.1.6生物分析儀。

5.1.7微量核酸定量儀：可檢測低至10pg/μL的DNA。

5.1.8微量分光光度計和熒光分光光度計。

5.1.9基因擴(kuò)增儀。

5.2試劑

5.2.1試劑級別：除另有規(guī)定，本方法試驗用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的二級水，所用化學(xué)試劑均為

分析純。

5.2.2核酸提取試劑。

5.2.3熒光PCR試劑。

5.2.4RNaseA。

5.2.5測序反應(yīng)通用試劑盒。

6樣本

6.1采集、保存及質(zhì)量要求

6.1.1手術(shù)組織樣本：在顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞所占比例應(yīng)≥30%，壞死細(xì)胞所占比例應(yīng)≤10%，相關(guān)

的病理檢測結(jié)果保存?zhèn)洳?。新鮮組織樣本在含福爾馬林或DNA/RNA保存液保存，常溫下可保存1個月。

凍存樣本需在樣本采集后立即放入液氮完全冷凍，-80℃低溫保存，干冰運(yùn)輸。

6.1.2石蠟組織/切片組織：10%中性福爾馬林固定手術(shù)標(biāo)本，按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。石蠟包埋

病理組織或切片樣品應(yīng)確定含有腫瘤病變細(xì)胞，F(xiàn)FPE樣本的組織面積應(yīng)介于0.5cm2～1cm2，切片用

量為5片～10片，厚度為5μm～10μm，用載玻片片盒或者離心管保存，常溫保存、運(yùn)輸。活檢材料

的固定時間一般是24h以內(nèi)。

6.1.3外周血：采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測，使用血漿游離DNA專用采血管采集外周血10

mL，在常溫條件下，ctDNA在全血中可穩(wěn)定保存7d。

6.1.4體液：體液中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測時，需確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細(xì)胞

病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，或在含有細(xì)胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩

沖液室溫保存。體液中的ctDNA用于基因檢測時，使用血漿游離DNA專用采血管采集新鮮體液10mL。

6.2樣本提取

6.2.1手術(shù)組織樣本/離心后的體液中腫瘤細(xì)胞

應(yīng)采用常規(guī)的DNA/RNA提取試劑盒。

6.2.2石蠟組織/切片組織

宜使用能提取石蠟包埋組織微量DNA/RNA的試劑盒。

6.2.3外周血/體液

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檢測樣本中的ctDNA宜使用ctDNA提取試劑盒。

6.3質(zhì)量評價

使用微量核酸定量儀、微量分光光度計和熒光分光光度計、生物分析儀或凝膠電泳將樣本的核酸提

取物進(jìn)行質(zhì)量評價。

7測序流程

7.1文庫構(gòu)建

7.1.1文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫，應(yīng)對檢測基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建

立實(shí)驗室檢測SOP，按照SOP執(zhí)行。

7.1.2單樣本文庫分子通常需要經(jīng)歷文庫編碼、擴(kuò)增、定量和混合等步驟后進(jìn)行上機(jī)測序。上機(jī)前需

要對測序文庫進(jìn)行定量和片段大小分析，保證文庫質(zhì)量能滿足上機(jī)要求。

7.1.3根據(jù)檢測項目設(shè)定文庫質(zhì)量的要求，并明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

7.2高通量測序

7.2.1NGS測序儀主要有檢測氫離子釋放和熒光信號兩大技術(shù)平臺。

7.2.2測序時根據(jù)檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒员ＷC測序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。

7.2.3錄入芯片編號、測序方案，如讀長、單端/雙端測序、barcode信息等內(nèi)容，按測序儀操作流程

進(jìn)行測序。

7.3生物信息學(xué)分析

7.3.1NGS數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析可分為以下兩個主要步驟：

a)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析及過濾。

b)對通過質(zhì)控的序列與參考序列進(jìn)行比對，對變異位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析并注釋。

7.3.2生物信息學(xué)流程中所用各種生物信息分析軟件，應(yīng)通過適量標(biāo)準(zhǔn)品測序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，證明所

用軟件及參數(shù)可達(dá)到臨床報告要求。

7.3.3數(shù)據(jù)分析的軟件應(yīng)根據(jù)指南更新版本。

7.4檢測報告

7.4.1報告內(nèi)容

報告內(nèi)容應(yīng)包括以下內(nèi)容

c)患者姓名、年齡、住院號/門診號、送檢單位/科室、送檢醫(yī)師、現(xiàn)病史等基本信息。

d)樣本編號、樣本種類、采樣日期、送檢日期、接收日期。

e)檢測項目、檢測方法、檢測范圍、檢測結(jié)果。

f)檢測者、審核者及報告時間。

7.4.2對檢出的基因變異的解釋

對檢出的基因變異解釋應(yīng)包括如下內(nèi)容：

a)基因變異檢測結(jié)果。

b)用藥提示。

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7.4.3報告臨床意義的解讀和批注

對于腫瘤體細(xì)胞突變，基因變異宜以下分級方式處理：

a)A級：寫入中外診療指南有明確診斷/治療/預(yù)后意義的變異。在報告中注釋該變異位點(diǎn)的臨床

診斷/治療/預(yù)后意義的權(quán)威指南來源。

b)B級：尚未進(jìn)入診療指南，但已經(jīng)寫入該領(lǐng)域的專家共識的變異位點(diǎn)。注釋時要批注研究報道

及專家共識的來源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。

c)C級：批準(zhǔn)用于其他腫瘤可預(yù)測療效的基因變異，或者正在進(jìn)行中的臨床試驗變異位點(diǎn)。注釋

時要批注用于其他腫瘤的權(quán)威指南，研究文獻(xiàn)及臨床試驗正在開展的狀態(tài)等信息。

d)D級：處于學(xué)術(shù)爭議或臨床意義不明確的基因變異。同一實(shí)驗室應(yīng)該有統(tǒng)一的政策用來應(yīng)對檢

測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。

e)其他內(nèi)容，如局限性說明、參考文獻(xiàn)、檢測基因列表等。

8質(zhì)量控制

8.1質(zhì)控品要求

腫瘤高通量測序室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)包括陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品及空白對照。陰陽性質(zhì)控品可使用試劑盒

自帶的陰陽性質(zhì)控品、使用已知突變的患者組織作為陽性質(zhì)控品或使用正常體細(xì)胞DNA作為陰性質(zhì)控品。

空白對照品一般為超純水。

8.2室內(nèi)質(zhì)量控制

8.2.1制定室內(nèi)質(zhì)控計劃，在每次檢測中至少添加一個陽性質(zhì)控品、一個陰性質(zhì)控品與常規(guī)標(biāo)本同時

檢測，并選定質(zhì)控規(guī)則，保留質(zhì)控記錄。

8.2.2實(shí)驗室應(yīng)建立生物信息學(xué)室內(nèi)質(zhì)量控制程序，在每次更換及更新生物信息學(xué)分析軟件或版本時

進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)可包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)品的突變類型及百分比。

8.2.3各個質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實(shí)驗室應(yīng)建立應(yīng)對措施或備選方案；對于測序結(jié)果質(zhì)

量差或有問題的