ICS65.020.01

CCSB04

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T4108—2025

馬鈴薯病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

CodeofpracticeforRT-PCRdetectionofpotatoviruses

2025-07-10發(fā)布2025-08-10實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4108—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)果蔬標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC25）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古師范大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古民族幼

兒師范高等?？茖W(xué)校、鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)中心。

本文件主要起草人：李正男、張磊、孫平平、張斌、席先梅、呂秀華、曹春梅、張溪、霍宏麗、周

宇、孫宇、牟英男、郭孟澤。

I

DB15/T4108—2025

馬鈴薯病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件描述馬鈴薯病毒檢測(cè)中的術(shù)語和定義，檢測(cè)對(duì)象，抽樣、取樣、檢測(cè)方法和判定規(guī)則等內(nèi)容。

本文件適用于馬鈴薯病毒的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T34265Sanger法測(cè)序技術(shù)指南

GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

SN/T2497.21進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全試驗(yàn)方法第21部分：瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

RNA病毒RNAviruses

核糖核酸病毒，其遺傳物質(zhì)為RNA。

類病毒viroids

又感染性RNA，是一種和病毒相似，但不具有蛋白質(zhì)外殼的一類環(huán)狀閉合的單鏈RNA分子。

反轉(zhuǎn)錄reversetranscription（RT）

以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA的過程。

互補(bǔ)DNAcomplementaryDNA（cDNA）

由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的、與RNA模板互補(bǔ)的DNA。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerasechainreaction（PCR）

1

DB15/T4108—2025

利用DNA聚合酶，對(duì)DNA或cDNA模板的特定區(qū)域進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。反應(yīng)混合物通常由DNA聚合酶、

脫氧核苷三磷酸、引物和緩沖液組成，反應(yīng)過程主要包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟。

引物Primers

人工合成的具有一定長(zhǎng)度的單鏈DNA分子，與DNA模板鏈的特定區(qū)域互補(bǔ)，其3’末端在PCR過程中作

為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)。

4檢測(cè)對(duì)象

主要RNA病毒種類

苜蓿花葉病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）。

黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）。

馬鈴薯奧古巴花葉病毒（Potatoaucubamosaicvirus，PAMV）。

馬鈴薯卷葉病毒（Potatoleafrollvirus，PLRV）。

馬鈴薯帚頂病毒（Potatomop-topvirus，PMTV）。

馬鈴薯A病毒（PotatovirusA，PVA）。

馬鈴薯M病毒（PotatovirusM，PVM）。

馬鈴薯S病毒（PotatovirusS，PVS）。

馬鈴薯X病毒（PotatovirusX，PVX）。

馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）。

主要類病毒種類

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potatospindletuberviroid，PSTVd）。

注：類病毒雖然不具有病毒所具有的蛋白質(zhì)外殼，但具有RNA基因組，檢測(cè)方法與RNA病毒一致。因此，列為本標(biāo)準(zhǔn)

的檢測(cè)對(duì)象。

5抽樣方法

采用5點(diǎn)法抽樣。

種植面積小于2001m（含22001m2），抽檢100株。種植面積在2001m2到20010m2之間（含20010m2），

前2001m2抽100株，之后每增2001m2增檢50株。種植面積超過20010m2時(shí)，前20010m2按上述方法抽樣，

之后每增加2001m2增檢20株。

6取樣方法

對(duì)樣方內(nèi)的馬鈴薯進(jìn)行采樣，取靠近頂部的新鮮葉或枝條，撣掉灰塵或其他附著物，除去蚜蟲，放

置于自封采樣袋內(nèi)。

采樣點(diǎn)距離檢測(cè)點(diǎn)較遠(yuǎn)時(shí)，用濕紙巾、海綿或布條包裹葉或枝條的切割處，置于采樣自封袋內(nèi)進(jìn)行

運(yùn)輸。

樣品在檢測(cè)點(diǎn)存儲(chǔ)時(shí)間較短時(shí)（一般不超過24h），在4℃存放即可。長(zhǎng)期存放樣品時(shí)，需要將樣

品用液氮預(yù)冷后，保存于-80℃超低溫保存箱。

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DB15/T4108—2025

7檢測(cè)方法

樣品前處理

避開葉片中脈，切取葉片組織用于檢測(cè)。

樣品核酸提取

選擇市售的用于提取含有多糖多酚材料RNA的試劑盒，按照試劑盒自帶的說明書進(jìn)行操作。核酸質(zhì)

量評(píng)價(jià)按照GB/T40974執(zhí)行。

反轉(zhuǎn)錄

以質(zhì)量合格的總RNA為模板，選擇市售的具有基因組DNA去除功能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成

cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照試劑盒自帶的說明書進(jìn)行設(shè)置。

PCR擴(kuò)增

7.4.1PCR反應(yīng)體系

市售產(chǎn)品通常為預(yù)混液或單品，根據(jù)所選產(chǎn)品提供的說明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)混合物配制，并按說明

書指示加入cDNA模板以及病毒檢測(cè)引物。各種病毒的特異性檢測(cè)引物見表1。

表1馬鈴薯病毒的特異性檢測(cè)引物

病毒名稱引物名稱引物序列/（5’→3’方向）目標(biāo)DNA片段大小/（bp）

AMVAMV-FaCCATCATGAGTTCTTCACAAA351

AMVAMV-RbTCGTCACGTCATCAGTGAGAC351

CMVCMV-FGTTTATTTACAAGAGCGTACGG650

CMVCMV-RGGTTCGAARRWATAACCGGG650

PAMVPAMY-FACCCAAGCGTTCCTATATACTC360

PAMVPAMV-RGGTCAAATCATTGCCAGCAATC360

PLRVPLRV-FCGCGCTAACAGAGTTCAGCC336

PLRVPLRV-RGCAATGGGGGTCCAACTCAT336

PMTVPMTV-FATGGCTGAAAACAGAGGTGA531

PMTVPMTV-RCTATGCACCAGCCCAGCGTAA531

PVAPVA-FGATGTCGATTTAGGTACTGCTG273

PVAPVA-RTCCATTCTCAATGCACCATAC273

PVMPVM-FACATCTGAGGACATGATGCGC520

PVMPVM-RTGAGCTCGGGACCATTCATAC520

PVSPVS-FTCTCCTTTGAGATAGGTAGG602

PVSPVS-RCAGCCTTTCATTTCTGTTAG602

PVXPVX-FATGTCAGCACCAGCTAGCA711

PVXPVX-RTGGTGGTGGTAGAGTGACAA711

PVYPVY-FGGCATACGGACATAGGAGAAACT447

PVYPVY-RCTCTTTGTGTTCTTCTCTTGTGT447

PSTVdPSTVd-FCACCCTTCCTTTCTTCG359

PSTVdPSTVd-RAAAACCCTGTTTCGGCGGGA359

F表示上游引物。

R表示下游引物。

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7.4.2PCR反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性2min。35個(gè)反應(yīng)循環(huán)：95℃變性20s；退火20s，退火溫度按引物合成報(bào)告設(shè)置，

兩個(gè)引物退火溫度不一致時(shí)，取較低溫度；72℃延伸，延伸時(shí)間根據(jù)所選產(chǎn)品說明書提供的參數(shù)進(jìn)行

計(jì)算。最后，72℃終延伸5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

7.5.1瓊脂糖凝膠制備

用Tris-乙酸緩沖液溶解瓊脂糖，制備質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的制備按照SN/T

2497.21執(zhí)行。

7.5.2電泳檢測(cè)

用Tris-乙酸緩沖液，在水平板電泳槽中進(jìn)行電泳。上樣、電泳按照SN/T2497.21執(zhí)行。電泳結(jié)束

時(shí)，凝膠置于紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè)和拍照，獲取的圖片用于結(jié)果判定。

8判定規(guī)則

異常結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖，與圖中DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品相比，從陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增到了預(yù)期大小

的DNA片段，或從陰性對(duì)照和陽性對(duì)照樣品均未擴(kuò)增到預(yù)期大小的DNA片段，此時(shí)，判定為檢測(cè)錯(cuò)誤，應(yīng)

重新進(jìn)行檢測(cè)。

陽性結(jié)果

從陰性對(duì)照樣品未擴(kuò)增到預(yù)期大小的DNA片段，從被檢測(cè)樣品擴(kuò)增到了預(yù)期大小的DNA片段。有陽性

對(duì)照時(shí)，從陽性對(duì)照擴(kuò)增的DNA片段大小，與判定為陽性的樣品中擴(kuò)增的DNA片段大小