液相色譜儀操作標(biāo)準(zhǔn)流程液相色譜儀（HPLC）作為分離分析復(fù)雜混合物的核心設(shè)備，其操作規(guī)范性直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與儀器使用壽命。本文結(jié)合實驗室實踐經(jīng)驗，梳理從準(zhǔn)備到維護(hù)的全流程操作要點，助力從業(yè)者高效、安全地開展分析工作。操作前的準(zhǔn)備工作流動相與溶劑系統(tǒng)流動相應(yīng)根據(jù)分析方法要求配置，優(yōu)先選用色譜純試劑，水相需用超純水（電導(dǎo)率≤1.0μS/cm）?；旌狭鲃酉嘈璩浞?jǐn)嚢韬蟪暶摎?0-30分鐘（或使用在線脫氣機(jī)），避免氣泡進(jìn)入泵體；含緩沖鹽的流動相應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，防止微生物滋生堵塞管路。色譜柱與進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢查：安裝前確認(rèn)柱身無破損，柱壓在正常范圍（新柱≤10MPa，使用中柱壓升高≤30%為正常）。安裝時注意流動相流向與柱上箭頭一致，接頭擰緊至不漏液（避免過度用力損壞螺紋）。進(jìn)樣針維護(hù)：手動進(jìn)樣針用甲醇反復(fù)抽吸-排出（≥5次），檢查針尖是否堵塞；自動進(jìn)樣針需確認(rèn)針座清潔，進(jìn)樣體積校準(zhǔn)無誤。儀器開機(jī)與系統(tǒng)平衡模塊啟動順序依次開啟電源總開關(guān)→泵（Pump）→進(jìn)樣器（Autosampler）→柱溫箱（ColumnOven）→檢測器（Detector），待各模塊自檢完成（屏幕顯示“Ready”）后，進(jìn)入工作站軟件。系統(tǒng)排氣與平衡泵排氣：打開泵排液閥（PurgeValve），設(shè)置流速5ml/min，按“Purge”鍵使流動相流經(jīng)泵頭、管路，直至流出液無氣泡（約3-5分鐘）。關(guān)閉排液閥，調(diào)節(jié)流速至分析方法要求（如1ml/min）。色譜柱平衡：待泵壓穩(wěn)定后（波動≤0.1MPa），保持流動相流經(jīng)色譜柱，平衡時間≥10倍柱體積（例：柱體積1ml、流速1ml/min時，平衡10分鐘）。若采用梯度洗脫，需先以初始流動相平衡色譜柱，確?；€平穩(wěn)。分析方法的建立與參數(shù)設(shè)置在工作站軟件中新建方法，根據(jù)樣品特性設(shè)置關(guān)鍵參數(shù)：泵參數(shù)：流速（0.5-2ml/min，反相色譜常用1ml/min）、流動相比例（等度/梯度洗脫，梯度洗脫需設(shè)置時間-比例曲線）。柱溫箱：溫度（25-40℃，穩(wěn)定樣品可設(shè)30℃），確保柱溫波動≤0.5℃。檢測器：波長（根據(jù)樣品最大吸收峰確定，如254nm、210nm）、采樣頻率（10-20Hz，兼顧峰形與數(shù)據(jù)量）。進(jìn)樣參數(shù)：進(jìn)樣量（1-20μl，避免過載）、進(jìn)樣針清洗次數(shù)（≥3次，防止交叉污染）。設(shè)置完成后，保存方法并進(jìn)行“空白運行”（注入流動相），確認(rèn)基線噪聲≤0.5mAU、漂移≤1mAU/h，方可進(jìn)行樣品分析。樣品分析與數(shù)據(jù)采集樣品預(yù)處理液體樣品經(jīng)0.22μm有機(jī)/水系濾膜過濾（根據(jù)流動相選擇），去除顆粒物；粘稠樣品需稀釋至合適濃度，避免柱過載。樣品瓶需潔凈、無殘留，液面高度≥進(jìn)樣針長度的1/2。進(jìn)樣與運行手動進(jìn)樣：將進(jìn)樣閥旋至“Load”，用進(jìn)樣針吸入樣品（過量10-20%，排除氣泡），注入進(jìn)樣環(huán)后旋至“Inject”，同時點擊軟件“開始采集”。自動進(jìn)樣：將樣品瓶放入進(jìn)樣盤，設(shè)置進(jìn)樣序列（樣品位置、進(jìn)樣量、運行時間），啟動序列后儀器自動完成進(jìn)樣、分析、清洗。分析過程中實時監(jiān)控色譜圖：保留時間RSD≤2%、峰面積RSD≤5%為合格；若峰形異常（拖尾、分叉）或基線漂移，需暫停分析排查原因。關(guān)機(jī)流程與日常維護(hù)系統(tǒng)沖洗分析結(jié)束后，用過渡流動相（如10%甲醇水）以0.5ml/min流速沖洗色譜柱30分鐘（去除鹽分），再用純甲醇（或乙腈）沖洗30分鐘（封存色譜柱，防止固定相水解）。若使用含緩沖鹽的流動相，需先將泵比例切換為100%水相沖洗10分鐘，再換甲醇沖洗，避免鹽結(jié)晶堵塞管路。模塊關(guān)機(jī)順序依次關(guān)閉檢測器→柱溫箱→進(jìn)樣器→泵→電源總開關(guān)。關(guān)閉泵前需將流速降至0，避免壓力突變損壞泵頭。日常維護(hù)要點色譜柱：長期不用時，柱兩端密封，存放于4℃環(huán)境；每季度用純甲醇反向沖洗（若柱允許），恢復(fù)柱效。進(jìn)樣系統(tǒng)：每周清洗進(jìn)樣針（超聲+甲醇沖洗），每月更換進(jìn)樣墊，檢查進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封。流動相瓶：每月用硝酸浸泡（水相瓶）或甲醇沖洗（有機(jī)相瓶），防止微生物滋生。異常情況的排查與處理壓力異常壓力過高：檢查管路是否堵塞（斷開柱后管路，壓力仍高則為泵或管路問題）、色譜柱是否污染（沖洗后柱壓無下降則需更換）。壓力過低：排查接頭是否漏液（用濾紙檢測）、泵密封圈是否老化（更換密封圈）。峰形異常峰拖尾：樣品過載（減少進(jìn)樣量）、柱污染（用5%甲酸水+乙腈梯度沖洗）、流動相pH不適（調(diào)整pH至2-8）。峰分叉：進(jìn)樣體積過大（減小進(jìn)樣量）、色譜柱柱頭塌陷（截去柱頭1-2mm或更換柱芯）?；€噪聲大流動相問題：重新脫氣或更換流動相；檢測器問題：清洗流通池（