臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的實(shí)踐應(yīng)用

及發(fā)展趨勢

本次課的主要內(nèi)容一、一般醫(yī)院檢驗(yàn)科血清免疫室所開展的項(xiàng)目概況與方法學(xué)分類二、各主要類別方法的評價及方法選擇的原則三、臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的主要誤差/差錯表現(xiàn)、原因分析及對策四、臨床免疫學(xué)檢測方法的自動化發(fā)展趨勢結(jié)束一、一般醫(yī)院檢驗(yàn)科血清免疫室所開展的項(xiàng)目概況與方法學(xué)分類

1.

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb乙肝五項(xiàng)甲肝抗體、丙肝抗體、甲胎蛋白AFP，癌胚抗原CEA、HIV抗體的檢測。2.

凝膠沉淀試驗(yàn)（單擴(kuò)試驗(yàn)）：免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，補(bǔ)體C3、C4等。3.

凝集試驗(yàn)：（膠乳）抗O，類風(fēng)濕因子RF，（碳粒）梅毒血清學(xué)試驗(yàn)，（細(xì)菌）肥達(dá)試驗(yàn)4.

散射/透射免疫比濁測定：免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，補(bǔ)體C3、C4，抗O/ASO，類風(fēng)濕因子RF等5.

金標(biāo)免疫技術(shù)：HBsAg或乙肝五項(xiàng)，[絨毛膜促性腺激素HCG]6.

[放射免疫測定：T3、T4、TSH甲狀腺功能系列試驗(yàn)，胰島素、C肽，其他一些激素如HCG、FSH、LH等的檢測。]7.

溶血反應(yīng)：總補(bǔ)體CH50測定。8.

[化學(xué)發(fā)光免疫分析與時間分辨熒光免疫測定技術(shù)，可以替代ELISA和放免測定的所有項(xiàng)目]9.細(xì)胞免疫檢測：T、B細(xì)胞計數(shù)（E、EA、EAC花環(huán)實(shí)驗(yàn)），淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)CDC，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。返回二、各主要類別方法的評價及方法選擇的原則

方法學(xué)評價的內(nèi)容：1.準(zhǔn)確可靠（準(zhǔn)確度——參考方法/決定性方法做對照、校準(zhǔn)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)時的陰性、陽性對照與其他校準(zhǔn)品精密度——重復(fù)性試驗(yàn)，批內(nèi)、批間重復(fù)/日間重復(fù)，對于一些定量指標(biāo)還需要參考生化檢驗(yàn)的方法評價做線性試驗(yàn)—確定其測量的線性范圍，回收試驗(yàn)，相關(guān)與回歸實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行評價。）2.簡便快速提高服務(wù)水平，出報告要及時，對方法的要求就要簡便快速。但也得在保證準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上簡便快速才有意義。3.靈敏度最小檢出限，至少在醫(yī)學(xué)決定性水平以下。4.特異性該檢測方法是否容易受干擾物質(zhì)的影響，干擾試驗(yàn)。檢測指標(biāo)的特異性：該指標(biāo)陽性與疾病之間的相關(guān)度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，假陽性、假陰性率表示。5.安全性對工作人員的人身傷害、對環(huán)境的污染，綠色無污染已經(jīng)深入人心。6.經(jīng)濟(jì)實(shí)惠成本不要太高，檢驗(yàn)科有成本核算。診斷價值高，對病人有意義。節(jié)約社會資源，減輕病人負(fù)擔(dān)。各主要類別方法的評價1.

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：比較準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，適合定性或半定量檢測，也有些項(xiàng)目用其做定量檢測，但結(jié)果不如放射免疫準(zhǔn)確。安全性好、污染小。在血清免疫室應(yīng)用最廣泛的一種方法。但比較費(fèi)時，適合大批量檢測。手工操作勞動強(qiáng)度較大，可以實(shí)現(xiàn)自動化檢測。偶有板孔包被不好導(dǎo)致錯誤結(jié)果的現(xiàn)象。2.

凝膠沉淀試驗(yàn)（單擴(kuò)試驗(yàn)）：粗略定量或半定量的實(shí)驗(yàn)方法，操作簡單但比較費(fèi)時，稀釋加樣后一般需要反應(yīng)12到24小時才能測量沉淀環(huán)直徑計算結(jié)果。此類方法有被散射/透射免疫比濁測定取代的趨勢。3.

凝集試驗(yàn)：定性或粗略的半定量，操作簡單、出結(jié)果也快。準(zhǔn)確性較差，有血清非特異性凝集等干擾因素影響。部分項(xiàng)目有被散射/透射免疫比濁測定取代的趨勢。4.

散射/透射免疫比濁測定：在自動生化分析儀上自動稀釋、加樣、測定，操作簡便快速，在保證儀器、試劑質(zhì)量的情況下結(jié)果準(zhǔn)確可靠。不足之處在于需要特殊儀器，試劑的質(zhì)量要求也相當(dāng)高，抗體需要非常純，目前使用滿意的多為進(jìn)口試劑，國產(chǎn)試劑的問題主要在于線性范圍小，而且空白/本底高，用起來自己都沒有把握。進(jìn)口試劑的成本較高。5.

金標(biāo)免疫技術(shù)：最大的優(yōu)勢是簡便快速，不需要特殊儀器設(shè)備，HCG孕婦自己都可以檢測。是軍事檢驗(yàn)領(lǐng)域比較看好的一項(xiàng)技術(shù)，但是其準(zhǔn)確性尚有些問題，主要是靈敏度欠佳，需要被檢物達(dá)到相當(dāng)高的濃度才能出現(xiàn)陽性結(jié)果。HCG的應(yīng)用非常成功，HBsAg勉強(qiáng)可以用，乙肝五項(xiàng)的檢測板就很失敗。若能提高其靈敏度，該方法還是很有發(fā)展前途。6.

[放射免疫測定：T3、T4、TSH甲狀腺功能系列試驗(yàn)，胰島素、C肽，其他一些激素的檢測。]本方法最大的特點(diǎn)就是準(zhǔn)確、靈敏度高。適合檢測激素、信號分子、細(xì)胞因子一類微量的抗原性物質(zhì)。最大的弊端是放射性污染及對人體的放射損害。能用其他方法替代的項(xiàng)目已經(jīng)逐漸被替代了，尤其是化學(xué)發(fā)光法在靈敏度與準(zhǔn)確度上都與之接近。但還是有部分項(xiàng)目不可替代。7.

溶血反應(yīng)：總補(bǔ)體CH50測定，比較傳統(tǒng)的一個方法，操作煩瑣，又不好改進(jìn)。對補(bǔ)體總活性測定是一個經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的粗略方法。分別測定多個單獨(dú)的補(bǔ)體組分可取代總補(bǔ)體CH50測定，但費(fèi)用劇增。部分檢驗(yàn)科仍然保留本項(xiàng)目。8.

[化學(xué)發(fā)光免疫分析與時間分辨熒光免疫測定技術(shù)：靈敏可靠、準(zhǔn)確度高，易于自動化。但儀器依賴性高，需要特殊設(shè)備，試劑要求也比較高，價格昂貴。]9.細(xì)胞免疫檢測：T、B細(xì)胞計數(shù)（E、EA、EAC花環(huán)實(shí)驗(yàn)），淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)CDC，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。多為手工操作，而且這些方法的經(jīng)驗(yàn)要求比較高，方法改進(jìn)的難度大。檢驗(yàn)科多數(shù)不愿意開展但是臨床又確實(shí)需要，如器官移植的病人必須做。方法選擇的原則：

1.首要原則是準(zhǔn)確可靠，如果做出來的結(jié)果自己都沒把握、自己都不相信，則最好不要選擇該方法。2.在確保準(zhǔn)確可靠/能夠滿足臨床需要的前提下盡可能選用安全性好的方法。如有放射污染的放免方法部分項(xiàng)目逐步被無污染的ELISA，化學(xué)發(fā)光分析所取代。3.在準(zhǔn)確可靠與簡便快速/經(jīng)濟(jì)實(shí)惠之間尋找合適的平衡點(diǎn).返回三、臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的主要誤差/差錯表現(xiàn)、原因分析及對策

主要誤差/差錯表現(xiàn):

很簡單1.

定量檢測的項(xiàng)目結(jié)果時高時低。2.

定性檢測的項(xiàng)目結(jié)果時陰時陽。3.符號簡寫的項(xiàng)目搞混淆，做錯了項(xiàng)目。原因分析：

患者病情的變化而致的時高時低或陰性陽性改變屬正常情況。其他原因?qū)е碌淖兓褪遣铄e或錯誤，主要原因有：1.試劑的誤差，包括批內(nèi)誤差與批間誤差。2.操作誤差：加樣的準(zhǔn)確性，孵育、洗滌過程的一致性，等等。3.取放樣品、判讀結(jié)果時的串行錯誤。4.儀器的誤差，儀器的狀態(tài)，儀器是否校準(zhǔn)，5.樣品的原因，血清的異常如溶血、脂血、黃疸等是否對檢測項(xiàng)目有影響。血標(biāo)本是否拿錯，注意查對，三查七對。對策：1.選用質(zhì)量可靠的試劑。在更換不同批次或不同廠家試劑時要小心摸索一段時間。2.操作一定要仔細(xì)。包括加樣、孵育的溫度與時間、洗滌與控干的技巧，顯色終止后盡快測定，儀器的保養(yǎng)與校準(zhǔn)等等。采取適當(dāng)?shù)拇胧┒沤^加樣與判讀結(jié)果的串行錯誤。對樣品的異常最好做些記錄，便于以后分析錯誤原因。3.要分析成批試驗(yàn)的結(jié)果。是否全部都高了，還是大多數(shù)都低了，與往常的結(jié)果是否大概一致，一般說來，一批試驗(yàn)中有高有低是比較讓人放心的。做到這一步，按照試劑商的資料，可以將整體的差錯率控制在1%0到1%00。但僅滿足于這樣的效果仍然會使檢驗(yàn)科麻煩不斷。4.要分析單個病人的檢驗(yàn)結(jié)果是否與臨床診斷吻合，這一條是臨床醫(yī)生判斷檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確與否最主要的標(biāo)準(zhǔn)，雖然不是百分之百正確，但確實(shí)大多數(shù)結(jié)果與診斷是吻合的，不吻合的情況也有，但發(fā)報告更要非常慎重。做到這一點(diǎn)，可以將單個病人的錯誤率控制在1%左右，加上復(fù)查的效果，有可能杜絕差錯的發(fā)生。5.分析同一病人各種項(xiàng)目之間的結(jié)果是否吻合。這一條在生化檢驗(yàn)中非常有效。在免疫學(xué)檢驗(yàn)的乙肝五項(xiàng)檢查中也是有用的，比如HBsAg和HBsAb都陽性就肯定需要復(fù)查。6.按規(guī)定留存標(biāo)本（3-5天），加強(qiáng)復(fù)查工作。對沒有把握的結(jié)果，寧可浪費(fèi)點(diǎn)試劑、犧牲點(diǎn)時間，也要把它留下來再做一次，復(fù)查一下搞確切。對單個病人而言，假設(shè)做一次的錯誤率在1%，而做兩次再錯的可能性就下降到1%00。通過這樣的復(fù)查，還很容易查出臨床科室的種種問題，從而大大提升檢驗(yàn)科嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的形象。7.加強(qiáng)質(zhì)量控制工作。持之以恒地作好室內(nèi)質(zhì)控，包括每批實(shí)驗(yàn)的陰性陽性對照；積極參加省市或全國的室間質(zhì)評工作，作用有兩個：有時自我感覺良好，但是與同行一比較相差甚遠(yuǎn)，有的醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)總是批評檢驗(yàn)科的質(zhì)量問題，如果我們能拿出優(yōu)秀的室間質(zhì)評成績，則是說明我們清白的最佳證據(jù)。8.加強(qiáng)業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)，不但要學(xué)習(xí)檢驗(yàn)的方法技術(shù)，也要學(xué)習(xí)臨床疾病的病理生理改變，才能做到知己知彼，減少差錯的發(fā)生?？傊?，我在醫(yī)院檢驗(yàn)科工作幾年的經(jīng)驗(yàn)是：差錯也許一年兩年不發(fā)生，但我們必需把每個樣品都看成是一個可能發(fā)生差錯的陷阱。針對實(shí)習(xí)同學(xué)的特別建議：1.虛心請教，對安排給自己的工作一定要把每一步搞確切再動手。對化驗(yàn)單上不懂的一定要問確實(shí)，避免第三類低級錯誤的發(fā)生。2.務(wù)必小心仔細(xì)，從核對標(biāo)本到判斷結(jié)果每一步都不可疏忽大意。3.不要擅自出報告，即便是自己獨(dú)立做的檢驗(yàn)項(xiàng)目，也要請帶教老師過目簽發(fā)。4.要具有自我保護(hù)和自我防范意識，尤其是自己不可承擔(dān)的責(zé)任（如重要檢驗(yàn)報告的簽發(fā)）、不能處理的事情（如醫(yī)患糾紛），自己能做的就是報告帶教老師或科室領(lǐng)導(dǎo)處理。否則自己惹上麻煩將是災(zāi)難性的后果！返回四、臨床免疫學(xué)檢測方法發(fā)展趨勢微量、快速、自動化是整個醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)發(fā)展的趨勢，免疫學(xué)檢驗(yàn)也不例外。免疫學(xué)檢驗(yàn)另一個發(fā)展趨勢是：由定性向定量方向發(fā)展。這些趨勢的核心是自動化，有了精密、高效的自動化儀器，才可能實(shí)現(xiàn)微量、快速、準(zhǔn)確定量的檢測。此外，免疫學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展還有以下幾個值得關(guān)注的特點(diǎn)：另外還有幾個特點(diǎn)：

1.

免疫學(xué)檢驗(yàn)與檢驗(yàn)專業(yè)其他學(xué)科的交叉發(fā)展（1）免疫學(xué)檢驗(yàn)的方法廣泛應(yīng)用于其他領(lǐng)域：應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，如HCG，由原來的生物學(xué)方法（蟾蜍或青蛙排精）→膠體金免疫試紙條，給檢驗(yàn)人員帶來巨大的方便。細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)，利用特定細(xì)胞抗體進(jìn)行免疫組化染色，使細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)更加客觀。微生物檢驗(yàn)，免疫學(xué)是從微生物獨(dú)立出來的，方法技術(shù)的相互滲透不必多說。生化檢驗(yàn)，利用免疫比濁的方法對載脂蛋白（Apo）A、B，Lp-a，糖化血紅蛋白（HBA1C），C-反應(yīng)蛋白CRP等進(jìn)行了測定方法的重大改進(jìn)，簡化了操作，提高了準(zhǔn)確度。（2）免疫學(xué)檢驗(yàn)引進(jìn)生化檢驗(yàn)的全自動生化分析儀技術(shù)，利用免疫比濁的方法對免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，補(bǔ)體C3、C4，抗O/ASO，類風(fēng)濕因子RF等進(jìn)行了測定方法的重大改進(jìn)，簡化了操作，提高了準(zhǔn)確度。免疫比濁法包括散射比濁與透射比濁是免疫學(xué)檢驗(yàn)與生化檢驗(yàn)交叉發(fā)展的成果，使一些操作煩瑣的項(xiàng)目面目一新，簡單快捷，而且準(zhǔn)確度大大提高，該方法在一定程度上使生化檢驗(yàn)與免疫學(xué)檢驗(yàn)的項(xiàng)目區(qū)分由絕對變得模糊。2.

高通量芯片檢測技術(shù)的研發(fā)包括基因芯片、蛋白芯片與微處理芯片（微縮實(shí)驗(yàn)室），號稱可以取代龐雜的檢驗(yàn)科。目前研究得很熱，但距離實(shí)際應(yīng)用還有很長的路要走。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的自動化

全自動的免疫分析儀已經(jīng)進(jìn)入部分大醫(yī)院的檢驗(yàn)科。不同的自動免疫檢測儀的原理結(jié)構(gòu)可能千差萬別，但其組成一般可以歸納成三部分：機(jī)械操作部分、光學(xué)（檢測）部分、電子電路（含計算機(jī)控制與分析）部分?；驹恚涸缙诘氖荅IA、ELISA，現(xiàn)在多采用靈敏度更高、準(zhǔn)確性更好的化學(xué)發(fā)光免疫分析法和時間分辨熒光免疫測定技術(shù)時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)時間分辨熒光檢測技術(shù)TRF的簡單原理上海新波生物技術(shù)有限公司

國產(chǎn)半自動時間分辨熒光免疫分析儀

（ANYTEST-2000型時間分辨熒光檢測儀）配套的Egate2310全自動洗滌機(jī)和2510變頻振蕩器

時間分辨熒光免疫分析法的原理與特點(diǎn)時間分辨熒光免疫分析法（Time-ResolvedFluorescence，簡稱TRF）是用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物(代替熒光物質(zhì)、同位素或酶)，標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系（如：抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生后，用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，以此來判斷反應(yīng)體系中被測物質(zhì)的濃度。

TRF分析法之所以能夠繼放免、酶標(biāo)、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光后成為一種更新、更靈敏的檢測方法，主要取決于它所用標(biāo)記物（稀土離子）的獨(dú)一無二的物理性質(zhì)及化學(xué)性質(zhì)：標(biāo)記物體積很小(為原子標(biāo)記)，標(biāo)記后不會影響被標(biāo)記物的空間立體結(jié)構(gòu)，保證了被檢測物質(zhì)的穩(wěn)定性(尤其對蛋白質(zhì)影響更小)；此方法實(shí)現(xiàn)了多位點(diǎn)標(biāo)記，這不僅使檢測更靈敏，也使一個試劑盒能夠同時檢測出兩種或兩中以上的項(xiàng)目（如PSA的檢測）；目前只有原子標(biāo)記才能準(zhǔn)確的定量檢測DNA、RNA。

稀土原子具有的熒光發(fā)射峰譜范圍窄、激發(fā)光波長范圍寬的特點(diǎn)，有利于增強(qiáng)熒光的特異性，提高分辨率；激發(fā)光和發(fā)射光之間存在較大的STOKES位移，有利于排除非特異性熒光的干擾、降低本底熒光強(qiáng)度；稀土離子螯合物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高、壽命長，有利于消除環(huán)境中其它熒光物質(zhì)的影響，并可對樣品進(jìn)行多次檢測。

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有標(biāo)記物制備簡便、有效期長、不污染環(huán)境、操作流程短