CN108401902B 一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法 (黑龍江省科學(xué)院大慶分院)_第1頁
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(19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局地址163319黑龍江省大慶市高新區(qū)博學(xué)大街45號高媛所(普通合伙)23209代理人榮玲A01H4/00(2006.01)forcloningofhemp(CannabissativaL.)byshoottipculture.《Pak.J.Bot.》.2forcloningofhemp(CannabissativaL.)byshoottipculture.《Pak.J.Bot.》佟金鳳等.大麻試管苗生根培養(yǎng)基的優(yōu)化.14438-14440頁.Lataetal..InvitromasspropagatiofCannabissativaL.:Aprotocolmeta-topolinandtheassessmentofeco-physiological,biochemicalandgeneticfidelityofmicropropagatedplants.《JournalofAppliedResearchonMandAromaticPlants》.2016,第1-9頁.審查員郝永利pH5.7~5.9,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度21.一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,其特征在于:包括如下步驟:步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿、有光澤的大麻種子,先用洗滌液洗滌后用自來水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖25~30g/L,瓊脂7~8g/L,pH5.7~5.9,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)8~10天,得到大麻無菌苗莖尖;步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖25~30g/L,瓊脂7~8g/L,pH5.7~5.9,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)15~20天,得到大麻莖尖再生植株;步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的大麻莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的MS培養(yǎng)基或含激素的1/2MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為20~30天,得到生根的植株;步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括1500~1650mg/L的NH?NO?、120~170mg/L的KH?PO?、1200~1500mg/L的KNO?、350~400mg/L的CaCl?·2H?0、300~350mg/L的MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、2H?0、0.025mg/L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90~95mg/L的肌醇、1.0~3.0mg/L的甘氨酸、0.1~0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.5~1.0mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5~1.0mg/L的煙酸;步驟3或4中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括1550mg/L的NH?NO?、130mg/L的KH?PO?、1250mg/L的KNO?、370mg/L的CaCl?·2H?0、330mg/L的MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括93mg/L的肌醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.6mg/L的鹽酸吡哆醇、0.6mg/L的煙酸,激素為1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤、1.0mg/L激動(dòng)素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,其特征在于:步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為2~3min,無菌水沖洗次數(shù)3~4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間6~7min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,其特征在于:步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,3所述的有機(jī)成份包括92mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸。4一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于植物的人工栽培技術(shù)領(lǐng)域;具體涉及一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法。背景技術(shù)生草本植物。大麻是世界也是中國最古老、歷史最悠久的栽培作物之一,大麻渾身是寶,可等十幾個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈。[0003]由于大麻中含有一種致幻成癮的活性成分一四氫大麻酚(THC),易被不法分子用來非法生產(chǎn)毒品,造成社會危害,許多國家把大麻也一并列為禁種作物,導(dǎo)致許多珍貴的種質(zhì)資源遺失,對大麻的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他經(jīng)濟(jì)作物。大麻有雌雄異株和雌雄同株之分,但由于同一群體內(nèi)不同個(gè)體間表現(xiàn)多樣性,種質(zhì)雜合度高,遺傳背景非常復(fù)雜且遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究也比較少,通過引種、系選、雜交、雜種優(yōu)勢、誘變等方法存在周期長、田間選擇難度大、抗源不足等問題。為了加速育種工作,許多研究者也利用溫室進(jìn)行育種,但由于光照不足、苗期溫度過高等條件的影響,導(dǎo)致大麻幼苗徒長而出現(xiàn)倒伏死亡現(xiàn)象的發(fā)生,這也會給育種工作帶來困難。生物技術(shù)是解決這些問題的有效途徑,即可加速種質(zhì)資源改良進(jìn)程,穩(wěn)定優(yōu)良性狀,又可解決溫室育種的弊端。[0004]在以往大麻再生體系的研究中,整個(gè)再生過程周期較長。申請?zhí)枮?00610088353.7的中國專利,將種子消毒后接種于發(fā)芽培養(yǎng)基,30天后才將莖尖接種到側(cè)芽培養(yǎng)基中,40天后獲得側(cè)芽,生根培養(yǎng)需要60天,培養(yǎng)周期長。選用種子消毒后接種培養(yǎng)基產(chǎn)生的無菌苗的下胚軸為外植體,從種子接種到生根獲得新的植株需要100多天的時(shí)間,影響實(shí)驗(yàn)周期的緊密性。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明目的是提供一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法。[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):[0007]一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:[0008]步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿、有光澤的大麻種子,先用洗滌液洗滌后用自來水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;[0009]步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖25~30g/L,瓊脂7~8g/L,pH5.7~5.9,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)8~10天,得到大麻無菌苗莖尖;[0010]步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含5激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖25~30g/L,瓊脂7~8g/L,pH5.7~5.9,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)15~20天,得到大麻莖尖再生植株;[0011]步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的MS培養(yǎng)基或含激素的1/2MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為20~30天,得到生根的植株。[0012]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為2~3min,無菌水沖洗次數(shù)3~4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間6~7min。[0013]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括1500~1650mg/L的~350mg/L的MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90~95mg/L的肌醇、1.0~3.0mg/L的甘氨酸、0.1~0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.5~1.0mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5~1.0mg/L的煙酸。[0014]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括1600mg/L的NH?NO?、微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·7H?0、0.25mg/L的Na?Mo0?的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括92mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸。[0015]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3或4中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括1500~CaCl?·2H?0、300~350mg/L的MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L0.025mg/L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90~95mg/L的肌醇、1.0~3.0mg/L的甘氨酸、0.1~0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.5~1.0mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5~1.0mg/L的煙酸,激素為1.0~2.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤、1.0~2.0mg/L激動(dòng)素。[0016]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3或4中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,6所述的有機(jī)成份包括93mg/L的肌醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.6mg/L的鹽酸吡哆醇、0.6mg/L的煙酸,激素為1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤、1.0mg/L激動(dòng)素。[0017]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3或4中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括93mg/L的肌醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.6mg/L的鹽酸吡哆醇、0.6mg/L的煙酸,激素為2.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤、2.0mg/L激動(dòng)素。[0018]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括700~800mg/L的NH?NO?、60~80mg/L的KH?PO?、602H?0、150~175mg/L的MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90~95mg/L的肌醇、1.0~3.0mg/L的甘氨酸、0.1~0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.5~1.0mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5~1.0mg/L的煙酸,激素為0.1~0.15mg/L吲哚丁酸、0.05~0.1mg/Lα-萘乙酸。[0019]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括750mg/7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·7H?0、0.25mg/L的Na?Mo0?·2H?0、0.025mg/L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸,激素為0.1mg/L吲哚丁酸、0.05mg/Lα-萘乙酸。[0020]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括750mg/7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·7H?0、0.25mg/L的Na?Mo0?·2H?0、0.025mg/L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸,激素為0.15mg/L吲哚丁酸、0.1mg/Lα-萘乙酸。[0021]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括750mg/7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/7L的ZnSO?·7H?0、0.25mg/L的Na?Mo0?·2H?0、0.025mg/L的CuSO?·5H?0和0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸,激素為0.1mg/L吲哚丁酸、0.075mg/Lα-萘乙酸。[0022]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,所述的“大麻”包括雌雄異株和雌雄同株的工業(yè)大麻。[0023]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,利用莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖得到再生植株,實(shí)驗(yàn)周期短,整個(gè)周期只需43~60天,生根效果好,根系變粗且長勢較好,提高移栽成活率。[0024]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,觀察根系生長情況,用尺測量十個(gè)根的粗度,并記錄;所得到的生根植株按照常規(guī)方法進(jìn)行移栽,統(tǒng)計(jì)移栽成活率,得到的結(jié)果生根的植株生根率為85.67±1.53%,根粗為9.67±0.42mm,移栽成活率為[0025]本發(fā)明所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,能夠加速種質(zhì)資源改良進(jìn)程,穩(wěn)定優(yōu)良性狀,又可解決溫室育種的弊端。附圖說明[0026]圖1為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻無菌苗照片;[0027]圖2為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻莖尖苗照片;[0028]圖3為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻莖尖再生植株照片;[0029]圖4為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻生根植株根部照片;[0030]圖5為具體實(shí)施方式二方法制備的大麻生根植株根部照片;[0031]圖6為具體實(shí)施方式三方法制備的大麻生根植株根部照片;[0032]圖7為具體實(shí)施方式四方法制備的大麻生根植株根部照片;[0033]圖8為具體實(shí)施方式五方法制備的大麻生根植株根部照片。具體實(shí)施方式[0034]具體實(shí)施方式一:[0035]一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:[0036]步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿、有光澤的大麻種子,先用洗滌液洗滌后用自來水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;[0037]步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)10天,得到大麻無菌苗莖尖;[0038]步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)20天,得到大麻莖尖再生植株;8[0039]步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的大麻莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的1/2MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度[0040]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為3min,無菌水沖洗次數(shù)4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間7min。[0041]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括92mg/L的[0042]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括93mg/L的肌醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.6mg/L的[0043]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽[0044]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,圖1為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻無菌苗照片,圖2為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻莖尖苗照片,圖3為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻莖尖再生植株照片。從圖1中能夠看出種子培養(yǎng)10天后,無菌苗的生理狀態(tài)很好,葉片舒展,挺拔;從圖2中能夠看出生長較好的莖尖,中心葉片再生良[0045]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,圖4為具體實(shí)施方式一方法制備的大麻生根植株根部照片,從圖4中觀察根系生長情況,用尺測量十個(gè)根的粗度,并記錄;所得到的生根植株按照常規(guī)方法進(jìn)行移栽,統(tǒng)計(jì)移栽成活率,得到的結(jié)果如表1所示:本實(shí)施方式生根的植株生根率為62.00±4.00%,根粗為5.53±0.15mm,移栽成活率為[0046]表1具體實(shí)施方式一生根率、根粗和移栽成活率記錄表9生根率(%)根粗(mm)移栽成活率(%)[0048]具體實(shí)施方式二:[0049]一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:[0050]步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;[0051]步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖25g/L,瓊脂7g/L,pH5.7,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800lux,每天16h光照、[0052]步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖25g/L,瓊脂7g/L,pH5.7,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800lux,[0053]步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的大麻莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的1/2MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度[0054]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為3min,無菌水沖洗次數(shù)4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間7min。[0055]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90~95mg/L的肌醇、1.0~3.0mg/L的甘氨酸、0.1~0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、[0056]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·7H?0、0.250.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽[0057]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸,激素為0.15mg/L吲哚丁酸、0.1mg/Lα-萘乙酸。[0058]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,圖5為具體實(shí)施方式二方法制備的大麻生根植株根部照片,觀察根系生長情況,用尺測量十個(gè)根的粗度,并記錄;所得到的生根植株按照常規(guī)方法進(jìn)行移栽,統(tǒng)計(jì)移栽成活率,得到的結(jié)果生根的植株生根率為75.00±3.00%,根粗為7.33±1.26mm,移栽成活率為63.33%。表2具體實(shí)施方式二生根率、根粗和移栽成活率記錄表生根率(%)根粗(mm)移栽成活率(%)實(shí)施方式二具體實(shí)施方式三:一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿、有光澤的大麻種子,先用洗滌液洗滌后用自來水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;[0064]步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.9,培養(yǎng)溫度為25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)8天,得到大麻無菌苗莖尖;[0065]步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.9,培養(yǎng)溫度為25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)15天,得到大麻莖尖再生植株;[0066]步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的大麻莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為30天,得到生根的植株。[0067]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為2min,無菌水沖洗次數(shù)4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間7min。[0068]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括1650mg/L的NH?NO?、微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括95mg/L的肌醇、3.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、1.0mg/L的鹽酸吡哆醇、1.0mg/L的煙酸。[0069]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括11MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括95mg/L的肌醇、3mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、1.0mg/L的鹽[0070]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括95mg/L的肌醇、3.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、1.0mg/L的[0071]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,圖6為具體實(shí)施方式三方法制備的大麻生根植株根部照片,觀察根系生長情況,用尺測量十個(gè)根的粗度,并記錄;所得到的生根植株按照常規(guī)方法進(jìn)行移栽,統(tǒng)計(jì)移栽成活率,得到的結(jié)果生根的植株生根率為78.00±3.00%,根粗為7.67±0.21mm,移栽成活率為70.00%。表3具體實(shí)施方式三生根率、根粗和移栽成活率記錄表生根率(%)根粗(mm)移栽成活率(%)具體實(shí)施方式四:一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%的升汞溶液浸泡,然后用無菌水沖洗至水體澄清,用無菌濾紙吸干種子表面水分,得到消毒后的大麻種子;[0077]步驟2、發(fā)芽培養(yǎng):將步驟1消毒后的大麻種子接種于如下發(fā)芽培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度2300lux,每天16h光照、[0078]步驟3、再生培養(yǎng):將步驟2得到的大麻無菌苗莖尖接種到如下的再生培養(yǎng)基中:含激素的MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度1800~2300lux,每天16h光照、8h黑暗條件下培養(yǎng),培養(yǎng)天數(shù)15天,得到大麻莖尖再生植株;[0079]步驟4、生根培養(yǎng):將步驟3得到的大麻莖尖再生植株接種到如下的生根培養(yǎng)基中,含激素的1/2MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,pH5.8,培養(yǎng)溫度為23~25℃,光照強(qiáng)度[0080]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟1中乙醇浸泡的時(shí)間為2min,無菌水沖洗次數(shù)4次,升汞溶液浸泡處理時(shí)間7min。[0081]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟2中的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成份組成,其中所述的大量元素包括1600mg/L的NH?NO?、微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的H?BO?、8.6mg/L的ZnSO?·的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括92mg/L的肌醇、1.0mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸。[0082]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟3中的含激素的MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括93mg/L的肌醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.2mg/L的鹽酸硫胺素、0.6mg/L的鹽酸吡哆醇、0.6mg/L的煙酸,激素為1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤、1.0mg/L激動(dòng)素。[0083]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,步驟4中的含激素的1/2MS培養(yǎng)基是由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成份、激素組成,其中所述的大量元素包括MgSO?·7H?0,所述的微量元素包括0.83mg/L的KI、22.3mg/L的MnSO?·4H?0、6.2mg/L的0.025mg/L的CoCl?·6H?0,所述的鐵鹽為硫酸亞鐵27.8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,所述的有機(jī)成份包括90mg/L的肌醇、1mg/L的甘氨酸、0.1mg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的煙酸,激素為0.1mg/L吲哚丁酸、0.075mg/Lα-萘乙酸。[0084]本實(shí)施方式所述的一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,圖7為具體實(shí)施方式四方法制備的大麻生根植株根部照片,從圖7中觀察根系生長情況,用尺測量十個(gè)根的粗度,并記錄;所得到的生根植株按照常規(guī)方法進(jìn)行移栽,統(tǒng)計(jì)移栽成活率,得到的結(jié)果如表4所示:本實(shí)施方式生根的植株生根率為83.00±2.00%,根粗為9.00±1.32mm,移栽成活率為表4具體實(shí)施方式四生根率、根粗和移栽成活率記錄表生根率(%)根粗(mm)移栽成活率(%)實(shí)施方式四具體實(shí)施方式五:一種大麻莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖方法,包括如下步驟:步驟1、種子消毒:挑選成熟、飽滿、有光澤的大麻種子,先用洗滌液洗滌后用自來水沖洗,再在超凈臺中用濃度為75%的乙醇浸泡,然后用無菌水沖洗,再用濃度為0.1%

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