(12)發(fā)明專利段街151號所(普通合伙)23209段振等.超高壓技術(shù)及其在提取植物天然.2017,第43卷(第12期),245-252.nYnY→多粘芽孢桿菌發(fā)酵→洗滌離心→大孔吸附樹2步驟一、將漢麻葉和漢麻花80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以料液比1g:1mL向所述哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入所述漢麻粉，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，25℃溫度下種子培養(yǎng)48h得到菌絲濃度為200～250g/L的哈茨木霉種子液；以接種量7mL將哈茨木霉種子液接入50mL步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于28℃溫度和92%相對濕度條件下固體培養(yǎng)5天得到哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物；將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷步驟三、向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在15min時間內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至500Mpa并保壓20min,然后在10～14s內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待用；步驟四、向步驟三所得超高壓處理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；步驟五、多粘芽孢桿菌活化后接入多黏芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基，37℃溫度、220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24h得到芽孢率達(dá)到90%以上的多粘芽孢桿菌種子液；以3mL接種量將多粘芽孢桿菌種子液接入50mL步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃溫度、80%相對濕度條件下固體培養(yǎng)24h得到多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物，將所得多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min待用；步驟六、將冷卻后的步驟五所得滅過菌多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物用2～3倍體積的95%乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用2～3倍體積的95%乙醇再次充分洗滌，離心收集上清液，合并所得上清液待用；步驟七、將步驟六所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液以大孔吸附樹脂DM-130為層析介質(zhì)，大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1g:5mL,在25℃吸附溫度下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50~70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚雜質(zhì)；步驟八、將步驟七所得大麻二酚濃縮液用200目硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，流動相流速為10mL/min,收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟一所述哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,pH6.5。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟二所述哈茨木霉液體種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨1g/L,無水乙酸鈉2g/L,七水硫酸鎂6g/L,pH6.5。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟三所述哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物與水的質(zhì)量體積比為1g:1mL。35.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟四所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g/L,蛋白胨5g/L,NaCl5g/L,pH6.5。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟五所述多黏芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L,牛肉浸粉8g/L,酵母浸粉4g/L,葡萄糖20g/L,磷酸氫二鉀2g/L,檸檬酸氫二胺2g/L,乙酸鈉5g/L,硫酸鎂0.2g/L,硫酸錳0.04g/L,pH6.5;所述多粘芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件為37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min搖床培養(yǎng)24h,所述多粘芽孢桿菌種子液的菌濃為10?~10?CFU/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟六所述洗滌是用2～3倍體積的95%乙醇充分震蕩洗滌，所述離心為轉(zhuǎn)速5000r/min離心20min。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟七所述大麻二酚濃縮液中大麻二酚的純度為60～70%。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步驟八中所述硅膠層析柱為200目硅膠層析柱，所述流動相流速為10mL/min,所述大麻二酚固體純度為99%以10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，所述哈茨木霉購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.12165:所述多粘芽孢桿菌購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為ACCCNo.10122。4一種大麻二酚的高效提取方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于植物有效成分提取方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大麻二酚的高效提取背景技術(shù)[0002]大麻因含有一種致幻成癮的次生代謝產(chǎn)物-四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)而成為公眾熟知的毒品原植物之一。為了方便監(jiān)管和合理使用，國際上將大麻中THC含量<0.3%的大麻品種定義為不具備毒品利用價值的工業(yè)大麻，又名漢麻。[0003]漢麻中非成癮性成分大麻二酚(Cannabidiol,CBD)具有保護(hù)神經(jīng)、改善記憶力、抗取途徑為溶劑提取，因漢麻植物中大麻素類成分復(fù)雜且性質(zhì)相近，特別是四氫大麻酚與大麻二酚為同分異構(gòu)體，極性相近分離純化困難，且溶劑提取過程中使用了大量的有機(jī)溶劑，酚的提取收率不高。發(fā)明內(nèi)容[0004]為解決現(xiàn)有大麻二酚提取效率低、產(chǎn)品純度低、收率低的問題，本發(fā)明提供了一種大麻二酚的高效提取方法。[0007]步驟一、將漢麻葉和漢麻花干燥后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以一定料液比向所述哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入所述漢麻粉，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0008]步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，一定溫度下進(jìn)行種子培養(yǎng)得到哈茨木霉種子液；以一定接種量將哈茨木霉種子液接入步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于一定溫度和濕度條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)得到哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物；將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷卻、充分干燥并粉碎至40目待用；[0009]步驟三、向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在一定時間內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至200Mpa并保壓一定時間，然后在一定時間內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待用；[0010]步驟四、向步驟三所得超高壓處理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；下培養(yǎng)得到多粘芽孢桿菌種子液；以一定接種量將多粘芽孢桿菌種子液接入步驟三所得冷5卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，一定溫度、濕度條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)得到多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物，將所得多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min待用；[0012]步驟六、將冷卻后的步驟五所得滅過菌多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用乙醇再次充分洗滌，離心收集上清液，合并所得上清液[0013]步驟七、將步驟六所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液以大孔吸附樹脂為層析介質(zhì)在一定吸附溫度下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚雜質(zhì)；[0014]步驟八、將步驟七所得大麻二酚濃縮液用硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體。[0015]進(jìn)一步的，步驟一所述干燥為80℃干燥10～12h,所述哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,pH6.5;所述漢麻粉與哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比為1g:1mL。[0016]進(jìn)一步的，步驟二所述哈茨木霉液體種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨1g/L,無水乙酸鈉2g/L,七水硫酸鎂6g/L,pH6.5;所述哈茨木霉種子培養(yǎng)條件為25℃培養(yǎng)48h,所述哈茨木霉種子液的菌絲濃度為200～250g/L;所述哈茨木霉種子液的接入量為步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10～15%;所述固體培養(yǎng)的溫度為28℃,相對濕度為92%,培養(yǎng)時間為5d。[0017]進(jìn)一步的，步驟三所述哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物與水的質(zhì)量體積比為1g:1mL,所述升壓時間為15min,所述保壓時間為20min,所述泄壓時間為10～14s。[0018]進(jìn)一步的，步驟四所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g/L,蛋白胨5g/L,NaCl5g/[0019]進(jìn)一步的，步驟五所述多黏芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L,牛肉浸粉8g/L,酵母浸粉4g/L,葡萄糖20g/L,磷酸氫二鉀2g/L,檸檬酸氫二胺2g/L,乙酸鈉5g/L,硫酸鎂0.2g/L,硫酸錳0.04g/L,pH6.5;所述多粘芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件為37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min搖床培養(yǎng)24h,所述多粘芽孢桿菌種子液的芽孢率為90%以上；所述多粘芽孢桿菌種子液的菌濃為10?~10CFU/mL;所述多粘芽孢桿菌種子液的接入量為步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基體積的5～10%;所述固體培養(yǎng)的條件為28℃、相對濕度80%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h。[0020]進(jìn)一步的，步驟六所述洗滌是用2～3倍體積的95%乙醇充分震蕩洗滌，所述離心為轉(zhuǎn)速5000r/min離心20min。[0021]進(jìn)一步的，步驟七所述大孔吸附樹脂為DM-130大孔吸附樹脂，所述大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1g:5mL;所述吸附溫度為25℃,所述大麻二酚濃縮液中大麻二酚的純度為60～70%。[0022]進(jìn)一步的，步驟八中所述硅膠層析柱為200目硅膠層析柱，所述流動相流速為10mL/min,所述大麻二酚固體純度為99%以上。6[0023]進(jìn)一步的，所述哈茨木霉購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.12165:所述多粘芽孢桿菌購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為ACCCNo.10122。[0025]本發(fā)明利用哈茨木霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的以纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶為主的酶系對漢麻細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，酶解的過程即是發(fā)酵的過程，哈茨木霉會根據(jù)發(fā)酵體系中纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)的量調(diào)整相應(yīng)酶的合成量，在動態(tài)發(fā)酵過程中徹底將漢麻細(xì)胞壁酶解。然后利用超高壓處理將剩余的原生質(zhì)體徹底破碎，充分釋放出漢麻細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等物質(zhì)，能夠充分提取漢麻細(xì)胞中的大麻二酚。[0026]本發(fā)明對破碎的漢麻細(xì)胞進(jìn)行多粘芽孢桿菌的短時發(fā)酵，在24h的發(fā)酵時間內(nèi)，利用多粘芽孢桿菌豐富的以蛋白酶為主的酶系將殘存在體系中的漢麻細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行進(jìn)一步降解，尤其是蛋白質(zhì)、多糖等大分子雜質(zhì)，既可以將大麻二酚充分釋放出來，也可以避免大分子雜質(zhì)堵塞大孔吸附樹脂，減輕吸附樹脂的壓力，提高提純效率。[0027]本發(fā)明提取方法得到的大麻二酚純度高，無四氫大麻酚雜質(zhì)，提取過程中無有機(jī)溶劑，不污染環(huán)境，能夠顯著提高大麻二酚的提取率、收率和漢麻利用率，為大麻二酚的進(jìn)一步研究及將其應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域提供基礎(chǔ)。附圖說明[0028]圖1是實(shí)施例10提取所得大麻二酚固體的高效液相色譜分析(HPLC)圖譜。具體實(shí)施方式[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。[0032]步驟一、將漢麻葉和漢麻花干燥后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以一定料液比向所述哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入所述漢麻粉，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0033]步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，一定溫度下進(jìn)行種子培養(yǎng)得到哈茨木霉種子液；以一定接種量將哈茨木霉種子液接入步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于一定溫度和濕度條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)得到哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物；將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷卻、充分干燥并粉碎至40目待用；[0034]步驟三、向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在一定時間內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至200Mpa并保壓一定時間，然后在一定時間內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待用；[0035]步驟四、向步驟三所得超高壓處理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制營7養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；下培養(yǎng)得到多粘芽孢桿菌種子液；以一定接種量將多粘芽孢桿菌種子液接入步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，一定溫度、濕度條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)得到多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物，將所得多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min待用；[0037]步驟六、將冷卻后的步驟五所得滅過菌多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用乙醇再次充分洗滌，離心收集上清液，合并所得上清液[0038]步驟七、將步驟六所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液以大孔吸附樹脂為層析介質(zhì)在一定吸附溫度下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚雜質(zhì)；[0039]步驟八、將步驟七所得大麻二酚濃縮液用硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體。[0041]本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟一如下：[0042]步驟一、將漢麻葉和漢麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以料液比為1g:1mL將漢麻粉加入哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用。[0043]本實(shí)施例中哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,pH6.5。[0045]本實(shí)施例與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟二如下：[0046]將哈茨木霉活化后的斜面培養(yǎng)物接入液體種子培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48h,得到菌絲濃度為200～250g/L的哈茨木霉種子液；以哈茨木霉種子液接入量為哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10～15%,將哈茨木霉種子液接入步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于28℃,相對濕度為92%的條件下培養(yǎng)5d,將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷卻、充分干燥并粉碎至40目待用。[0047]本實(shí)施例中哈茨木霉液體種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g/L,蔗糖10g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨1g/L,無水乙酸鈉2g/L,七水硫酸鎂6g/L,pH6.5。[0048]漢麻葉與漢麻花的細(xì)胞壁以纖維素、木質(zhì)素、果膠和蠟質(zhì)為主要成分，這些成分所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)形成了細(xì)胞壁的基本架構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞的正常形態(tài)?，F(xiàn)有技術(shù)在提取大麻二酚時會使用纖維素酶、果膠酶來對細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，以破壞細(xì)胞壁，提高提取效率。但直接用纖維素酶、果膠酶進(jìn)行酶解的效果依賴于酶活力、酶解的溫度和時間等因素，常常不能徹底的酶解植物的細(xì)胞壁。[0049]本實(shí)施例利用哈茨木霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的以纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶為主的酶系對漢麻細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，酶解的過程即是發(fā)酵的過程，哈茨木霉會根據(jù)發(fā)酵體系8中纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)的量調(diào)整相應(yīng)酶的合成量，在動態(tài)發(fā)酵過程中徹底將漢麻細(xì)胞壁酶解。[0051]本實(shí)施例與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟三如下：[0052]向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在15min內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至500Mpa,保壓20min后在10～14s內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待[0053]現(xiàn)有技術(shù)在提取大麻二酚時，在酶解后直接進(jìn)行醇提，但大麻二酚作為次生代謝產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器中，被原生質(zhì)膜、細(xì)胞器膜以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其他蛋白、多糖等分泌物層層包圍，導(dǎo)致大麻二酚提取率低。[0054]本實(shí)施例在步驟二將漢麻細(xì)胞壁酶解后，利用超高壓處理將剩余的原生質(zhì)體徹底破碎，充分釋放出漢麻細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等物質(zhì)，能夠充分提取漢麻細(xì)胞中的大麻[0056]本實(shí)施例與實(shí)施例4的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟四如下：[0057]以步驟三所得超高壓處理后的物料為基礎(chǔ)配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用。[0058]本實(shí)施例中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g/L,蛋白胨5g/L,NaCl5g/L,pH6.5。[0060]本實(shí)施例與實(shí)施例5的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟五如下：[0061]多粘芽孢桿菌活化后的斜面培養(yǎng)物接入MRS培養(yǎng)基，37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min搖床培養(yǎng)24h,至芽孢率達(dá)到90%以上，得到多粘芽孢桿菌種子液，菌濃為10?~10?CFU/mL;以多粘芽孢桿菌種子液的接入量為步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基體積的5～10%;將多粘芽孢桿菌種子液接入步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，混勻并于28℃、相對濕度80%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h,將所得多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min待[0062]本實(shí)施例多黏芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L,牛肉浸粉8g/L,酵母浸粉4g/L,葡萄糖20g/L,磷酸氫二鉀2g/L,檸檬酸氫二胺2g/L,乙酸鈉5g/L,硫酸鎂0.2g/L,硫酸錳0.04g/L,pH6.5;[0063]本實(shí)施例在高壓處理后對破碎的漢麻細(xì)胞進(jìn)行多粘芽孢桿菌的短時發(fā)酵，在24h的發(fā)酵時間內(nèi)，利用多粘芽孢桿菌豐富的以蛋白酶為主的酶系將殘存在體系中的漢麻細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行進(jìn)一步降解，尤其是蛋白質(zhì)、多糖等大分子雜質(zhì)，既可以將大麻二酚充分釋放出來，也可以避免大分子雜質(zhì)堵塞大孔吸附樹脂，減輕吸附樹脂的壓力，提高提純效[0065]本實(shí)施例與實(shí)施例6的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟六如下：[0066]將冷卻后的步驟五所得滅過菌多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物用2～3倍體積的95%乙9醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用2～3倍體積的95%乙醇再次充分洗滌，離心收[0067]本實(shí)施例通過乙醇洗脫使大麻二酚溶解在乙醇中，也可使蛋白等雜質(zhì)發(fā)生變性經(jīng)離心除去。[0068]實(shí)施例8[0069]本實(shí)施例與實(shí)施例7的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟七如下：[0070]將步驟六所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液，以大孔吸附樹脂DM-130為層析介質(zhì)，大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1:5,在25℃條件下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析所得大麻二酚濃縮液中大麻二酚含量大于65%,且未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚。[0072]本實(shí)施例與實(shí)施例8的區(qū)別僅在于，本實(shí)施例中步驟八如下：[0073]所得大麻二酚濃縮液用200目硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，流動相流速為10mL/min,收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體，所得大麻二酚固體純度為99%以上。[0075]本實(shí)施例提供了一種大麻二酚的高效提取方法，包括如下步驟：[0076]步驟一、將漢麻葉和漢麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以料液比為1g:1mL將漢麻粉加入哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0077]步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48h,得到菌絲濃度為200~250g/L的哈茨木霉種子液；以接種量7mL將哈茨木霉種子液接入50mL步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于28℃,相對濕度為92%的條件下培養(yǎng)5d,將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷卻、充分干燥并粉碎至40目待用；[0078]步驟三、向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在15min內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至500Mpa,保壓20min后在10～14s內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待用；[0079]步驟四、以步驟三所得超高壓處理后的物料為基礎(chǔ)配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0080]步驟五、多粘芽孢桿菌活化后接入MRS培養(yǎng)基，37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min搖床培養(yǎng)24h,至芽孢率達(dá)到90%以上，得到多粘芽孢桿菌種子液，菌濃為10?~10?CFU/mL;以接種量3mL將多粘芽孢桿菌種子液接入50mL步驟三所得冷卻后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，混勻并于28℃、相對濕度80%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h,將所得多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min待用；[0081]步驟六、將冷卻后的步驟五所得滅過菌多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物用2～3倍體積的95%乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用2～3倍體積的95%乙醇再次充分洗滌，[0082]步驟七、將步驟六所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液，以大孔吸附樹脂DM-130為層析介質(zhì)，大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1:5,在25℃條件下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析所得大麻二酚濃縮液中大麻二酚含量大于65%,且未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚；[0083]步驟八、所得大麻二酚濃縮液用200目硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，流動相流速為10mL/min,收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體，經(jīng)高效液相色譜檢測所得大麻二酚固體純度為99.8%,收率為1.26%;高效液相檢測圖譜如圖1所示，無四氫大麻酚雜質(zhì)。[0084]本實(shí)施例使用的高效液相色譜條件如下：[0089]流動相：甲醇：0.1%甲酸=80:20。[0090]對比例1[0092]步驟一、將漢麻葉和漢麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以料液比為1g:1mL將漢麻粉加入哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0093]步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48h,得到菌絲濃度為200~250g/L的哈茨木霉種子液；以接種量7mL將哈茨木霉種子液接入50mL步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于28℃,相對濕度為92%的條件下培養(yǎng)5d,將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,待用；[0094]步驟三、將步驟二所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物用2～3倍體積的95%乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用2～3倍體積的95%乙醇再次充分洗滌，離心收集上清液，合并所得上清液待用；[0095]步驟四、將步驟三所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液，以大孔吸附樹脂DM-130為層析介質(zhì)，大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1:5,在25℃條件下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析所得大麻二酚濃縮液中大麻二酚含量大于65%,且未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚；[0096]步驟五、所得大麻二酚濃縮液用200目硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流11動相進(jìn)行等度洗脫，流動相流速為10mL/min,收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體，經(jīng)高效液相色譜檢測所得大麻二酚固體純度為99.3%,收率為0.67%。[0097]對比例1的大麻二酚收率僅為0.67%,約為實(shí)施例10大麻二酚收率的50%,這充分說明利用超高壓處理和多粘芽孢桿菌處理可以將漢麻細(xì)胞中的大麻二酚充分釋放，提高其收率。[0098]對比例2[0099]本對比例提供了一種僅做哈茨木霉和超高壓處理的大麻二酚的高效提取方法，包括如下步驟：[0100]步驟一、將漢麻葉和漢麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到漢麻粉；配制哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以料液比為1g:1mL將漢麻粉加入哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，120℃滅菌鍋中滅菌20min,冷卻后待用；[0101]步驟二、哈茨木霉活化后接入液體種子培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48h,得到菌絲濃度為200~250g/L的哈茨木霉種子液；以接種量7mL將哈茨木霉種子液接入50mL步驟一所得冷卻后的哈茨木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后于28℃,相對濕度為92%的條件下培養(yǎng)5d,將所得哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物置于120℃滅菌鍋中滅菌40min,冷卻、充分干燥并粉碎至40目待用；[0102]步驟三、向步驟二所得粉碎后的哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)物中加水制成混懸液，將所述混懸液裝入耐壓的塑料袋中，密封后放入超高壓處理裝置的提取容器中；常溫下在15min內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)升高至500Mpa,保壓20min后在10～14s內(nèi)將超高壓處理裝置內(nèi)的壓強(qiáng)迅速泄為常壓；重復(fù)升壓泄壓的操作3次后，將塑料袋從超高壓處理裝置的提取容器中取出待用；[0103]步驟四、將超高壓處理液用1～2倍體積的95%乙醇充分洗滌，離心收集上清液，將離心沉淀用1～2倍體積的95%乙醇再次充分洗滌，離心收集上清液，合并所得上清液待用；[0104]步驟五、將步驟四所得上清液置于50～70℃下減壓蒸餾脫除乙醇溶劑，得到濃縮液，以大孔吸附樹脂DM-130為層析介質(zhì)，大孔吸附樹脂質(zhì)量與濃縮液體積之間的料液比為1:5,在25℃條件下完成吸附；用45～55%的乙醇洗脫5個柱體積洗脫大部分極性雜質(zhì)，再用80～95%的乙醇洗脫3～5個柱體積洗脫大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脫液，50～70℃減壓濃縮得到大麻二酚濃縮液，經(jīng)高效液相色譜分析所得大麻二酚濃縮液中大麻二酚含量大于65%,且未發(fā)現(xiàn)四氫大麻酚；[0105]步驟六、所得大麻二酚濃縮液用200目硅膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以石油醚為流動相進(jìn)行等度洗脫，流動相流速為10mL/min,收集富含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮得到大麻二酚純化液，將大麻二酚純化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固體，經(jīng)高效液相色譜檢測所得大麻二酚固體純度為99.5%,收率為1.10%。[0106]對比例2的大麻二酚收率為1.10%,約為實(shí)施例10大麻二酚收率的87%,而比對比例1僅用哈茨木霉處理的大麻二酚收率提高了64%,這充分說明在哈茨木霉處理的基礎(chǔ)上增加超高壓處理取得了顯