動物細胞工程第66講高三一輪復(fù)習(xí)授課人：近5年考情考點2024江蘇、吉林、浙江，2023遼寧、海南、湖南，2022福建、江蘇、湖北，2025江蘇動物細胞培養(yǎng)技術(shù)2023北京，2022福建、江蘇、山東、浙江動物細胞融合與單克隆抗體的制備2024江蘇、重慶，2022遼寧干細胞工程2024江西、廣東、寧夏、湖北，2021江蘇、浙江、湖南動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物本節(jié)內(nèi)容考頻較低，題型主要以選擇題為主，部分是填空題，題目難度中等，常結(jié)合分化、染色體變異、PCR、細胞增殖、基因突變、神經(jīng)調(diào)節(jié)、翻譯等內(nèi)容一起考察，填空題?？疾靾D像、結(jié)合新情境出題?？记榉治?．生命觀念：理解細胞全能性的物質(zhì)基礎(chǔ)和生物生長的細胞學(xué)基礎(chǔ)。2.科學(xué)思維：建立動物細胞培養(yǎng)與單克隆抗體制備的基本流程模型；建立動物細胞核移植的基本流程模型。3．科學(xué)探究：結(jié)合高產(chǎn)奶牛的克隆過程，掌握動物細胞核移植技術(shù)。4.社會責(zé)任：克隆動物及其對人類社會的影響。學(xué)習(xí)目標(biāo)02動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體01動物細胞培養(yǎng)03動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物本節(jié)綱要1、動物細胞工程的技術(shù)手段

主要有

、_______________和_________________等。______________是動物細胞工程的基礎(chǔ)。動物細胞融合動物細胞核移植動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)2、動物細胞培養(yǎng)概念:從動物體中取出相關(guān)的組織,將它分散成_________,然后在適宜的培養(yǎng)條件下,讓這些細胞____________的技術(shù)。單個細胞生長和增殖原理:細胞增殖（有絲分裂）一、動物細胞培養(yǎng)3、動物細胞培養(yǎng)的條件血清培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具7.2～7.4維持培養(yǎng)液的pH血清可補充細胞生長和增殖所需的未知營養(yǎng)物質(zhì)通常采用

，將其置于含

的混合氣體的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶95%的空氣和5%CO2為什么培養(yǎng)液需要定期更換？____________________________________如何防止培養(yǎng)過程中的微生物污染？___________________________________防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害在細胞培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素一、動物細胞培養(yǎng)4、動物細胞培養(yǎng)的過程一、動物細胞培養(yǎng)取動物組織分散成單個細胞傳代培養(yǎng)細胞懸液原代培養(yǎng)①選材：

；原因是

。動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞分化程度低，分裂能力強，容易培養(yǎng)用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理②原因:細胞與細胞靠在一起,彼此限制了生長和增殖;能使細胞與培養(yǎng)液充分接觸,更易進行物質(zhì)交換。③使用胰蛋白酶分散細胞說明細胞間的物質(zhì)主要是

。用胰蛋白酶處理

（會/不會）把所培養(yǎng)的細胞消化掉？原因是

；故必須控制好胰蛋白酶的

。蛋白質(zhì)會蛋白質(zhì)是細胞膜的主要成分之一用量和處理時間加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)4、動物細胞培養(yǎng)的過程一、動物細胞培養(yǎng)取動物組織分散成單個細胞傳代培養(yǎng)細胞懸液原代培養(yǎng)細胞能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖需要貼附于某些基質(zhì)表面(如培養(yǎng)瓶壁)才能生長增殖（大多數(shù)細胞屬于此類型）④體外培養(yǎng)的動物細胞的可以分為兩大類:懸浮培養(yǎng)的細胞貼壁細胞當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制。動物組織經(jīng)過處理后的初次培養(yǎng)。4、動物細胞培養(yǎng)的過程一、動物細胞培養(yǎng)腫瘤細胞失去接觸抑制，在培養(yǎng)液中可以無限增殖下去。形成一層細胞⑤接觸抑制可形成多層細胞打破接觸抑制現(xiàn)象的方法是將貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細胞繼續(xù)增殖。取動物組織分散成單個細胞傳代培養(yǎng)細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)4、動物細胞培養(yǎng)的過程一、動物細胞培養(yǎng)取動物組織分散成單個細胞傳代培養(yǎng)細胞懸液原代培養(yǎng)10~50代，部分細胞細胞核型可能會發(fā)生變化，增殖緩慢，甚至完全停止。50代以后，大部分細胞衰老死亡。少數(shù)細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，細胞核型改變，朝癌細胞發(fā)展。先用胰蛋白酶處理，分瓶培養(yǎng)使用或保存的細胞通常選用傳代

代以內(nèi)的細胞，這樣做的目的是

。10保持細胞正常的二倍體核型分瓶培養(yǎng)一、動物細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)有的改變細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代危機1危機2原代和傳代“兩次”使用胰蛋白酶①將剪碎的組織分散成單個細胞②將貼壁細胞從瓶壁上分離下來，避免接觸抑制，同時分散細胞（遺傳物質(zhì)沒改變）原代保持細胞正常二倍體核型傳代遺傳物質(zhì)改變突破細胞壽限（遺傳物質(zhì)有的改變）5、動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)前處理取材培養(yǎng)基的物理性質(zhì)培養(yǎng)基特有的成分培養(yǎng)的目的植物細胞的全能性細胞增殖離體用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細胞分散開離體植物器官、組織、細胞動物胚胎或幼齡動物的器官、組織固體液體(又稱培養(yǎng)液)植物激素血清快速繁殖植物得到動物細胞及細胞產(chǎn)物一、動物細胞培養(yǎng)5、動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)特殊環(huán)境條件培養(yǎng)的結(jié)果是否體現(xiàn)細胞的全能性過程相同點再分化需光氣體環(huán)境一般獲得新的植株獲得大量細胞是否①培養(yǎng)過程中都需要加營養(yǎng)物質(zhì)、都需要防止雜菌污染;②需要適宜的溫度、pH和滲透壓等條件③都進行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂一、動物細胞培養(yǎng)動物的組織機械法↓或酶處理細胞懸液↓原代培養(yǎng)

↓細胞懸液↓傳代培養(yǎng)

外植體↓脫分化愈傷組織↓再分化芽、根或胚狀體↓生長發(fā)育植物體6、干細胞(1)概念:動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。(2)存在部位:存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。(3)分類：包括胚胎干細胞和成體干細胞等。一、動物細胞培養(yǎng)一、動物細胞培養(yǎng)胚胎干細胞（ES細胞）成體干細胞誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)來源特點應(yīng)用早期胚胎具有分化為任何一種類型的細胞、組織和器官，甚至個體的潛能。分化成心肌細胞、神經(jīng)元和造血干細胞成體組織或器官內(nèi)具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。①造血干細胞（治療白血?。谏窠?jīng)干細胞（治療帕金森病等）③精原干細胞（睪丸中）體細胞（如成纖維細胞等）能誘導(dǎo)分化成類似胚胎干細胞的細胞治療鐮狀細胞貧血、阿爾茨海默病、心血管疾病等6、干細胞iPS細胞誘導(dǎo)過程6、干細胞一、動物細胞培養(yǎng)病人各種類型的細胞導(dǎo)入特定基因?qū)胩囟ǖ鞍仔》肿踊衔锍衫w維細胞T細胞B細胞iPS細胞分化取出移植病人①胚胎干細胞為什么可以解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題？其應(yīng)用有什么限制因素？通過胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化，可以培育出人造組織器官，從而解決供體器官不足問題，另一方面，由于是自身細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化形成的，所以無免疫排斥反應(yīng)。胚胎干細胞必須從胚胎中獲取，這涉及倫理問題，因而限制了應(yīng)用。②為什么科學(xué)家認為iPS細胞的應(yīng)用前景優(yōu)于胚胎干細胞？iPS細胞的誘導(dǎo)過程無需破壞胚胎，而且iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)。6、干細胞一、動物細胞培養(yǎng)1、【2024吉林高考】從小鼠胚胎中分離獲取胚胎成纖維細胞進行貼壁培養(yǎng)，在傳代后的不同時間點檢測細胞數(shù)目，結(jié)果如圖。下列敘述正確的是（）A．傳代培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿需密封防止污染B．選?、俚募毎M行傳代培養(yǎng)比②更合理C．直接用離心法收集細胞進行傳代培養(yǎng)D．細胞增長進入平臺期可能與細胞密度過大有關(guān)DA、傳代培養(yǎng)時培養(yǎng)器皿容許內(nèi)部氣體和培養(yǎng)箱中的氣體進行交換，A錯誤；B、選?、诘募毎M行傳代培養(yǎng)比①更合理，②時細胞增長開始變得緩慢，B錯誤；C、對于貼壁生長的細胞進行傳代培養(yǎng)時，先需要用胰蛋白酶等處理，使之分散為單個細胞，然后再用離心法收集，C錯誤；D、細胞增長進入平臺期可能與細胞密度過大、細胞間產(chǎn)生接觸抑制有關(guān)，D正確。牛刀小試1、動物細胞融合技術(shù)PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導(dǎo)法等二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體（2）原理/結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：細胞膜具有一定的流動性（1）概念：使兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。（3）誘導(dǎo)方法：1、動物細胞融合技術(shù)植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細胞融合的方法細胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法電融合法PEG融合法滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細胞壁細胞核的融合培育植物新品種主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體2、單克隆抗體的制備①方法:向動物體內(nèi)反復(fù)注射

,使動物產(chǎn)生抗體,然后從動物血清中分離所需抗體。傳統(tǒng)獲得抗體的方法和缺點:②缺點:用這種方法制備的抗體

。某種抗原產(chǎn)量低、純度低,而且特異性差二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體2、單克隆抗體的制備(1)原理:一個B淋巴細胞雜交瘤細胞小鼠骨髓瘤細胞融合單克隆抗體培養(yǎng)能在體外無限增殖只分泌一種特異性抗體既能迅速大量增殖,又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體特異性強，靈敏度高，可大量制備2、單克隆抗體的制備(2)過程:二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體第一次篩選培養(yǎng)骨髓瘤細胞

誘導(dǎo)融合產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞分離已免疫的B淋巴細胞動物細胞融合技術(shù)（細胞膜具有一定的流動性）動物細胞培養(yǎng)技術(shù)（細胞增殖）給小鼠注射特定抗原選擇性培養(yǎng)基第二次篩選克隆化培養(yǎng)抗體檢測大量骨髓瘤細胞多種雜交瘤細胞體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體未融合親本細胞融合同種核細胞雜交瘤細胞2、單克隆抗體的制備(2)過程：若僅考慮細胞的兩兩融合，在獲取雜交瘤細胞的過程中，篩選淘汰的細胞有幾種類型？為什么？有未融合的細胞和同種細胞融合后形成的細胞(B－B融合細胞、瘤－瘤融合細胞)兩種類型。出現(xiàn)不同類型是因為細胞融合不是100%的，且是隨機的。二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體2、單克隆抗體的制備（3）單克隆抗體制備過程中兩次篩選的方法及目的第一次篩選第二次篩選目的:方法:目的:方法:篩選出雜交瘤細胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)。特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜種細胞才能生長。篩選出能產(chǎn)生所需(特異性)抗體，又能迅速大量增殖的雜交瘤細胞。進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選。二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體2、單克隆抗體的制備（4）單克隆抗體的應(yīng)用診斷試劑①作為

:在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發(fā)揮重要的作用。②運載藥物:抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC)通過將

與能特異性識別腫瘤抗原的

結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由

三部分組成。細胞毒素單克隆抗體抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體a.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？ADC示意圖抗體藥物接頭抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過抗體特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞。2、單克隆抗體的制備（4）單克隆抗體的應(yīng)用b.ADC在臨床應(yīng)用上的作用機理是什么？其作用機理是通過單克隆抗體的靶向作用特異性地識別腫瘤細胞表面抗原，然后利用細胞本身具備的內(nèi)吞作用使化學(xué)藥物進入腫瘤細胞體內(nèi)發(fā)生藥力，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體2、【2023遼寧高考】大量懸浮培養(yǎng)產(chǎn)流感病毒的單克隆細胞，可用于流感疫苗的生產(chǎn)。下列敘述錯誤的是（

）A．懸浮培養(yǎng)單克隆細胞可有效避免接觸抑制B．用于培養(yǎng)單克隆細胞的培養(yǎng)基通常需加血清C．當(dāng)病毒達到一定數(shù)量時會影響細胞的增殖D．培養(yǎng)基pH不會影響單克隆細胞的病毒產(chǎn)量A、懸浮培養(yǎng)單克隆細胞，可以保證足夠的氣體交換，通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)，可有效避免接觸抑制，A正確；B、由于細胞的生長是比較復(fù)雜的過程，血清中含有一些必須的因子，用于培養(yǎng)單克隆細胞的培養(yǎng)基通常需加血清，B正確；C、病毒借助于細胞進行繁殖，利用了活細胞的物質(zhì)、能量、酶等，當(dāng)病毒達到一定數(shù)量時細胞的生命活動受到影響，會影響細胞的增殖，C正確；D、細胞的正常生命活動需要適宜的pH，培養(yǎng)基pH會影響細胞代謝，進而影響單克隆細胞的病毒產(chǎn)量，D錯誤。D牛刀小試3、【2024江西高考】(多選)某病毒顆粒表面有一特征性的大分子結(jié)構(gòu)蛋白S（含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產(chǎn)生一種抗體）。為了建立一種靈敏、高效檢測S蛋白的方法，研究人員采用雜交瘤技術(shù)制備了抗-S單克隆抗體（如圖）。下列說法正確的是（）

A．利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞B．制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B是相同的單克隆抗體C．用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養(yǎng)，但不能凍存D．單克隆抗體A和單克隆抗體B都能夠特異性識別S蛋白牛刀小試AD牛刀小試A、膠原蛋白酶可以催化分解細胞外的膠原蛋白，因此利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞，A正確；B、由于蛋白S含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產(chǎn)生一種抗體，單克隆抗體A和單克隆抗體B來自不同的雜交瘤細胞，因此制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B不是相同的單克隆抗體，B錯誤；C、用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養(yǎng)，也可以冷凍保存，C錯誤；D、單克隆抗體A和單克隆抗體B都來自篩選出的雜交瘤細胞，因此都能夠特異性識別S蛋白上的抗原決定簇，D正確。①概念:將動物一個細胞的_______移入_______________中，使這個______________發(fā)育成________，繼而發(fā)育成_________的技術(shù)；②原理:_____________________③生殖方式:________________④哺乳動物核移植類型：

細胞核移植和體細胞核移植。細胞核去核的卵母細胞重新組合的細胞新胚胎動物個體*用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物；動物細胞核的全能性無性生殖1、動物細胞核移植技術(shù)概述胚胎三、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物1、動物細胞核移植技術(shù)概述⑤哺乳動物核移植類型胚胎細胞核移植動物胚胎細胞分化程度____，表現(xiàn)全能性___________體細胞核移植動物體細胞分化程度____，表現(xiàn)全能性_____________⑥非人靈長類動物體細胞核移植的困難原因______細胞的_______在_____________中_____________其___________________，這導(dǎo)致了_____________________；對非人靈長類動物_______進行操作的技術(shù)尚不完善；供體細胞核去核卵母細胞不能完全恢復(fù)分化前的功能狀態(tài)胚胎發(fā)育率低胚胎低相對容易高十分困難*因此動物體細胞核移植的難度明顯高于胚胎細胞核移植三、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物2、體細胞核移植的過程三、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物取供體細胞取卵母細胞培養(yǎng)到MⅡ中期重構(gòu)胚代孕母牛生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的個體重組細胞供體細胞培養(yǎng)卵母細胞去核供體細胞注入去核的卵母細胞細胞培養(yǎng)細胞融合發(fā)育胚胎移植動物細胞核移植動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合早期胚胎培養(yǎng)供體：一般選用傳代10代以內(nèi)的細胞。該細胞具有優(yōu)良遺傳特性，遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性高①為何選用MⅡ卵母細胞?含有激發(fā)細胞核全能性表達的物質(zhì)；卵母細胞體積大，易操作；卵母細胞營養(yǎng)物質(zhì)豐富。②卵母細胞為什么要“去核”？保證核移植的胚胎或動物的核遺傳物質(zhì)全部來自供體細胞。2、體細胞核移植的過程取供體細胞取卵母細胞培養(yǎng)到MⅡ中期重構(gòu)胚代孕母牛生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的個體重組細胞供體細胞培養(yǎng)卵母細胞去核供體細胞注入去核的卵母細胞細胞培養(yǎng)細胞融合發(fā)育胚胎移植動物細胞核移植動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合早期胚胎培養(yǎng)③為什么不是取供體細胞核進行核移植操作，而是將供體細胞整個注入去核卵母細胞中？保證供核不被破壞，使克隆動物更像供體動物，操作也方便。三、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物④怎樣使重組細胞發(fā)育成重組胚？用物理或化學(xué)方法激活受體細胞，促進其完成分裂核發(fā)育過程（電脈沖/乙醇、鈣離子載體）⑤整個過程中用到的技術(shù)有哪些？動物細胞培養(yǎng)、核移植、動物細胞融合、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植2、體細胞核移植的過程⑥目前動物細胞核移植技術(shù)中普遍使用的去核方法是

。也有人采用梯度離心、紫外線短時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法。這些方法是在沒有穿透卵母細胞透明帶的情況下去核或使其中的

。顯微操作法DNA變性三、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物⑦克隆動物是供體細胞的完全復(fù)制嗎？⑧克隆動物的產(chǎn)生證明了什么？卵母細胞細胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)會對克隆動物的性狀產(chǎn)生影響，環(huán)境也會影響遺傳物質(zhì)的表達已經(jīng)分化的動物細胞的細胞核具有全能性⑨克隆動物的獲得過程