IICS01.040.65

CCSCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

枸杞葉及枸杞茶中黃酮類化合物

的測(cè)定

Determinationofflavonoidsinbarbarywolfberryleavesandbarbarywolfberrytea

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)發(fā)布

枸杞葉及枸杞茶中黃酮類化合物的測(cè)定

1范圍

本文件規(guī)定了枸杞葉及枸杞茶中總黃酮含量的分光光度計(jì)測(cè)定方法和枸杞葉及枸杞茶中黃酮類

化合物含量的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于枸杞葉及枸杞茶中總黃酮及黃酮類化合物含量的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

第一法分光光度法測(cè)定枸杞中總黃酮的含量

4原理

試樣中的黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)上具有鄰二酚羥基，可以在弱堿性條件下與鋁鹽絡(luò)合，形成

穩(wěn)定的紅色化合物，在可見光區(qū)域(510nm)顯色。在一定濃度范圍內(nèi)，該化合物的吸光度值與總黃酮

含量成正比，符合郎伯-比爾定律。

5試劑與材料

除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純和GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

5.1試劑

5.1.1無水乙醇：CH3CH2OH，CAS號(hào)：64-17-5

5.1.2亞硝酸鈉：NaNO2，CAS號(hào)：7632-00-0

5.1.3硝酸鋁：Al（NO3）3，CAS號(hào)：7784-27-25.1.4氫氧化鈉：NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2

5.2溶液的配制

5.2.160%乙醇溶液：量取60mL無水乙醇加入到30mL純化水中，混勻備用。

5.2.270%乙醇溶液：量取70mL無水乙醇加入到30mL純化水中，混勻備用。

5.2.35%亞硝酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取5.00g亞硝酸鈉于100mL容量瓶中，加適量水溶解，加水定容至刻

1

度，搖勻、備用。

5.2.410%硝酸鋁溶液：準(zhǔn)確稱取10.00g硝酸鋁于100mL容量瓶中，加適量水溶解，加水定容至刻度，

搖勻、備用。

5.2.54%氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取8.00g氫氧化鈉于200mL容量瓶中，加適量水溶解，用水定容至刻

度，搖勻、備用。

5.3標(biāo)準(zhǔn)品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（C27H30O16，CAS號(hào)153-18-4）：純度≥98.0%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書

的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6.70mg（精確至0.0001g）至25mL容量瓶中，加乙醇溶液（5.2.2）適量并超

聲使溶解，定容至刻度，搖勻，配制成0.268mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

6儀器與設(shè)備

6.1紫外分光光度計(jì)。

6.2分析天平，感量0.00001g。

6.3粉碎機(jī)。

6.4超聲波清洗器。

6.5超純水機(jī)。

6.6水浴鍋。

7試樣制備

取枸杞葉（枸杞茶）樣品，粉碎，過3號(hào)篩，置干燥器中保存，待用。

取枸杞葉（枸杞茶）約1g（精確至0.0001g），置三角瓶中，加50mL70%的乙醇溶液（5.2.2）

冷浸30min，水浴回流提取1h，濾過，分取濾液，藥渣再加30mL70%的乙醇溶液（5.2.2），水浴

回流提取1h，過濾，合并濾液，用乙醇溶液（5.2.2）洗滌濾渣并定容至100mI的量瓶中．搖勻，作

為試液，待用。

8分析步驟

8.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4）0mL、0.1mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL置于10

mL容量瓶中，分別加水使成2.4mL，各加5％亞硝酸鈉溶液（5.2.3）0.4mL，搖勻，放置6min，

加10%硝酸鋁溶液（5.2.4）0.4mL，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液（5.2.5）1mL，加水至

刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑作空白，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度ρ

(ug/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2

8.2測(cè)定步驟

精密量?。?）待測(cè)液1.0mL，加5％亞硝酸鈉溶液（5.2.3）0.4mL，搖勻，放置6min，加10%硝

酸鋁溶液（5.2.4）0.4mL，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液（5.2.5）1mL，加水至刻度，搖

勻，放置15min，試樣于波長(zhǎng)509nm處測(cè)定，以測(cè)得吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查的試樣待測(cè)液中總黃酮的

含量，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

9結(jié)果計(jì)算和表達(dá)

試樣中總黃酮含量以蘆丁的含量以百分含量計(jì)，按公式（1）計(jì)算：

(ρ?ρ0)×V1×V3

ω=????????????????（1）

m×V2×1000

式（1）中：

ω——試樣中總黃酮含量的數(shù)值，單位為毫克每克（mg/g）

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣待測(cè)液中總黃酮的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為毫克每升（g/mL）

ρ0——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得空白待測(cè)液中總黃酮的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為毫克每升（g/mL）

V1——試樣中加入并定容的提取溶液體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）

V3——試樣的最終定容體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）

m——試樣的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）

V2——提取液的分取體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）

測(cè)定結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10精密度

在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的10%。

第二法高效液相色譜法測(cè)定黃酮類化合物的含量

11原理

枸杞茶和枸杞葉中的蘆丁經(jīng)乙醇溶液提取后得到游離的黃酮類化合物，用C18柱分離，用紫外檢

測(cè)器在波長(zhǎng)357nm處測(cè)定，外標(biāo)法定量。

12試劑與材料

除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純和GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

12.1試劑

12.1.1無水乙醇：CH3CH2OH，CAS號(hào)：64-17-5。

12.1.2甲醇：CH3OH，CAS號(hào)：67-56-1，色譜純。

3

12.1.3冰醋酸：CH3COOH，64-19-7，色譜純。

12.2溶液配制

12.2.170%乙醇溶液：量取70mL無水乙醇加入到30mL純化水中，混勻備用。

12.2.21%冰醋酸溶液：量取1mL冰醋酸于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻、備用。

12.3標(biāo)準(zhǔn)品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（C27H30O16，CAS號(hào)153-18-4）：純度≥98.0%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書

的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

12.4材料

微孔濾膜：0.45μm，有機(jī)系。

12.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

同（5.4）。

13儀器與設(shè)備

13.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器。

13.2分析天平，感量0.00001g。

13.3粉碎機(jī)。

13.4超聲波清洗器。

13.5超純水機(jī)。

13.6水浴鍋。

14試樣制備

同（7）。

15分析步驟

15.1高效液相色譜參考條件

色譜柱：C18柱，長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm，或相當(dāng)者。

柱溫：20℃。

流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸（32：68）。

檢測(cè)波長(zhǎng)：357nm。

流速：1.0mL/min。

進(jìn)樣量：10μL。

15.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用乙醇溶液（5.2.2）分別將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到系列濃度為0μg/mL、50μg/mL、80

μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以

4

蘆丁質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸

方程。

15.3定量測(cè)定

在相同的色譜條件下，取等體積的試樣待測(cè)液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行色譜分析，以保

留時(shí)間定性，色譜峰面積外標(biāo)法定量。試樣待測(cè)液中黃酮類化合物的響應(yīng)值均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，

超過線性范圍時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)定濃度進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再進(jìn)行分析。

16結(jié)果計(jì)算和表達(dá)

試樣中蘆丁的含量按公式（2）計(jì)算：

ρ×V

ω=……………（2）

m×1000

式（2）中：

ω——試樣中蘆丁含量的數(shù)值，單位為毫克每克（mg/g）；

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣待測(cè)液中蘆丁的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為毫克每升（mg/L）；

m—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

V——試樣中加入并定容的提取溶液體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；

測(cè)定結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

17精密度

在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的10%。

18其他

本文件方法的檢出限和定量限見附錄B。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、試樣色譜圖見附錄A。

5

附錄A

（資料性附錄）

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及枸杞葉、枸杞茶試樣色譜圖

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及枸杞葉、枸杞茶試樣溶液的HPLC色譜圖見圖A.1-A.3。

圖A.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖A.2枸杞葉中蘆丁組分色譜圖

圖A.3枸杞茶中蘆丁組分色譜圖

6

附錄B

（規(guī)范性附錄）

方法的檢測(cè)限和定量限

方法的檢測(cè)限和定量限見表B.1。

表B.1方法的檢測(cè)限和定量限

名稱定量限（μg/mL）檢測(cè)限（μg/mL）

蘆丁0.1010.030

7

前言

本文件按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。

本文件由寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院（國(guó)家枸杞產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（寧夏））提出。

本文件由寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)歸口。

本文件起草單位：寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院（國(guó)家枸杞產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（寧夏））、

中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、寧夏食品藥品檢驗(yàn)研究院。

本文件主要起草人：馬玲、雷艷、王忠強(qiáng)、劉淑瑛、王寧麗、鄭國(guó)保、馬小榮、趙茜、吳少濤、

馬宗衛(wèi)、王英華。

本文件為首次發(fā)布。

I

枸杞葉及枸杞茶中黃酮類化合物的測(cè)定

1范圍

本文件規(guī)定了枸杞葉及枸杞茶中總黃酮含量的分光光度計(jì)測(cè)定方法和枸杞葉及枸杞茶中黃酮類

化合物含量的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于枸杞葉及枸杞茶中總黃酮及黃酮類化合物含量的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

第一法分光光度法測(cè)定枸杞中總黃酮的含量

4原理

試樣中的黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)上具有鄰二酚羥基，可以在弱堿性條件下與鋁鹽絡(luò)合，形成

穩(wěn)定的紅色化合物，在可見光區(qū)域(510nm)顯色。在一定濃度范圍內(nèi)，該化合物的吸光度值與總黃酮

含量成正比，符合郎伯-比爾定律。

5試劑與材料

除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純和GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

5.1試劑

5.1.1無水乙醇：CH3CH2OH，CAS號(hào)：64-17-5

5.1.2亞硝酸鈉：NaNO2，CAS號(hào)：7632-00-0

5.1.3硝酸鋁：Al（NO3）3，CAS號(hào)：7784-27-25.1.4氫氧化鈉：NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2

5.2溶液的配制

5.2.160%乙醇溶液：量取60mL無水乙醇加入到30mL純化水中，混勻備用。

5.2.270%乙醇溶液：量取70mL無水乙醇加入到30mL純化水中，混勻備用。

5.2.35%亞硝酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取5.00g亞硝酸鈉于100mL容量瓶中，加適量水溶解，加水定容至刻

1

度，搖勻、備用。

5.2.410%硝酸鋁溶液：準(zhǔn)確稱取10.00g硝酸鋁于100mL容量瓶中，加適量水溶解，加水定容至刻度，

搖勻、備用。

5.2.54%氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取8.00g氫氧化鈉于200mL容量瓶中，加適量水溶解，用水定容至刻

度，搖勻、備用。

5.3標(biāo)準(zhǔn)品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（C27H30O16，CAS號(hào)153-18-4）：純度≥98.0%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書

的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6.70mg（精確至0.0001g）至25mL容量瓶中，加乙醇溶液（5.2.2）適量并超

聲使溶解，定容至刻度，搖勻，配制成0.268mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

6儀器與設(shè)備

6.1紫外分光光度計(jì)。

6.2分析天平，感量0.00001g。

6.3粉碎機(jī)。

6.4超聲波清洗器。

6.5超純水機(jī)。

6.6水浴鍋。

7試樣制備

取枸杞葉（枸杞茶）樣品，粉碎，過3號(hào)篩，置干燥器中保存，待用。

取枸杞葉（枸杞茶）約1g（精確至0.0001g），置三角瓶中，加50mL70%的乙醇溶液（5.2.2）

冷浸30min，水浴回流提取1h，濾過，分取濾液，藥渣再加30mL70%的乙醇溶液（5.2.2），水浴

回流提取1h，過濾，合并濾液，用乙醇溶液（5.2.2）洗滌濾渣并定容至100mI的量瓶中．搖勻，作

為試液，待用。

8分析步驟

8.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4）0mL、0.1mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL置于10

mL容量瓶中，分別加水使成2.4mL，各加5％亞硝酸鈉溶液（5.2.3）0.4mL，搖勻，放置6min，

加10%硝酸鋁溶液（5.2.4）0.4mL，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液（5.2.5）1mL，加水至

刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑作空白，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度ρ

(ug/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2

8.2測(cè)定步驟

精密量?。?）待測(cè)液1.0mL，加5％亞硝酸鈉溶液（5.2.3）0.4mL，搖勻，放置6min，加10%硝

酸鋁溶液（5.2.4）0.4mL，搖勻，放置6min，加4％氫