廣西地區(qū)新城疫病毒分離株的特性解析與精準(zhǔn)檢測體系構(gòu)建一、引言1.1NDV研究背景新城疫（Newcastledisease,ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）引起的一種主要侵害家禽及多種鳥類的急性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。NDV具有廣泛的宿主范圍，可感染超過240種禽類，包括雞、火雞、鴨、鵝、鴿等家禽以及多種野鳥。新城疫的首次發(fā)現(xiàn)可以追溯到1926年，在印度尼西亞的爪哇島和英國的新城地區(qū)幾乎同時出現(xiàn)了一種導(dǎo)致家禽大量死亡的疾病，隨后被命名為新城疫。自那以后，新城疫在全球范圍內(nèi)多次爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。在歷史上，新城疫經(jīng)歷了多次大流行。第一次全球大流行從20世紀(jì)20年代持續(xù)到60年代，起源于東南亞，主要由基因Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的NDV引起，主要感染對象是雞，水禽、鳥類等幾乎不發(fā)病。第二次大流行發(fā)生在60年代至70年代，可能起源于中東，主要由基因Ⅴ和Ⅵ型的NDV引起，這次疫情的快速傳播與養(yǎng)禽業(yè)的急劇產(chǎn)業(yè)化以及鸚鵡的國際貿(mào)易有關(guān)，主要危害觀賞鳥、籠養(yǎng)鳥等禽類。第三次大流行始于70年代后期至80年代，首先由鴿子引起，可能起源于中東，然后傳至歐洲并傳遍全球，此次大流行主要與基因Ⅵb亞型新城疫病毒有關(guān)，首先感染鴿子，導(dǎo)致鴿群嚴(yán)重死亡，隨后危害到雞群。第四次全球大流行主要是由基因Ⅶ型新城疫病毒引起的，可能起源于亞洲，自20世紀(jì)80年代開始，1992年在意大利出現(xiàn)流行，造成本次大流行的新城疫病毒以基因Ⅶ型為主，但Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ等其他基因型病毒依然存在。在我國，隨著養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，新城疫的防控面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。盡管通過全面免疫防控策略，新城疫的流行在一定程度上得到了控制，但在局部地區(qū)仍有持續(xù)性地方流行，免疫失敗和免疫帶毒現(xiàn)象長期存在。據(jù)相關(guān)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，我國新城疫的流行特點主要表現(xiàn)為：一是疫情次數(shù)呈逐年下降趨勢，2005年我國報告發(fā)生新城疫疫情1257起，到2019年僅報告發(fā)生11起；二是家禽中新城疫強毒帶毒率呈逐年下降趨勢，但鴿群強毒帶毒率較高，水禽強毒帶毒率逐年明顯下降；三是病原具有多樣性，個別地區(qū)還出現(xiàn)了新基因型，目前我國流行的新城疫病毒以基因VI型和VII型為主，其中基因VI型主要存在于鴿群中，在雞群和鵝群流行的新城疫則以基因VII型為主；四是非典型新城疫和免疫帶毒現(xiàn)象普遍存在，免疫失敗時有發(fā)生；五是環(huán)境中病毒污染嚴(yán)重，在局部地區(qū)呈地方流行。感染NDV的家禽臨床表現(xiàn)多樣，取決于病毒的毒力、宿主的年齡、免疫狀態(tài)、感染途徑及劑量、并發(fā)感染、環(huán)境及應(yīng)激情況等因素。速發(fā)嗜內(nèi)臟型新城疫（VVND）可致所有年齡的雞發(fā)生最急性或急性、致死性疾病，通常見有消化道出血性病變；速發(fā)嗜肺腦型新城疫（VPND）可致所有年齡發(fā)生急性、通常是致死性疾病，以出現(xiàn)呼吸道和神經(jīng)癥狀為特征；中發(fā)型新城疫（MND）表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的低致病性形式，死亡僅見于幼雛；緩發(fā)型新城疫（LND）為輕度或不顯性的呼吸道疾??；無癥狀型或緩發(fā)嗜腸型新城疫（LEND）主要是腸道感染。當(dāng)非免疫雞群或嚴(yán)重免疫失敗雞群受到速發(fā)嗜內(nèi)臟型和肺腦型毒株攻擊時，可引起典型新城疫暴發(fā)，雞群突然發(fā)病，常未表現(xiàn)特征癥狀而迅速死亡，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%以上，隨后出現(xiàn)甩頭、張口呼吸、氣管內(nèi)水泡音、結(jié)膜炎、精神萎頓、嗜睡、嗉囔內(nèi)積有液體和氣體、口腔內(nèi)有粘液，倒提病雞可見從口中流出酸臭液體，病雞拉稀，糞便呈黃綠色，體溫升高，食欲廢絕，雞冠和肉髯發(fā)紫，后期可見震顫、轉(zhuǎn)圈、眼和翅膀麻痹、頭頸扭轉(zhuǎn)、仰頭呈觀星狀以及跛行等神經(jīng)癥狀，面部腫脹也是本型的一個特征，產(chǎn)蛋雞迅速減蛋，軟殼蛋數(shù)量增多，很快絕產(chǎn)。非典型ND是雞群在具備一定免疫水平時遭受強毒攻擊而發(fā)生的一種特殊表現(xiàn)形式，其主要特點是多發(fā)生于有一定抗體水平的免疫雞群，病情比較緩和，發(fā)病率和死亡率都不高，臨床表現(xiàn)以呼吸道癥狀為主，病雞張口呼吸，有“呼?！甭?，咳嗽，口流粘液，排黃綠色稀糞，繼而出現(xiàn)歪頭、扭脖或呈仰面觀星狀等神經(jīng)癥狀，成雞產(chǎn)蛋量突然下降5%-12%，嚴(yán)重者可達(dá)50%以上，并出現(xiàn)畸形蛋、軟殼蛋和糙皮蛋。NDV不僅對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，還可能對公共衛(wèi)生產(chǎn)生一定影響。獸醫(yī)、實驗室工作人員等在接觸大量病毒時，可引起結(jié)膜炎等癥狀。由于NDV具有高度的傳染性和致病性，其傳播速度快，一旦疫情爆發(fā)，若不及時采取有效的防控措施，將會導(dǎo)致大量家禽死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。同時，疫情的爆發(fā)還可能影響到相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，如飼料生產(chǎn)、禽產(chǎn)品加工、銷售等，對整個養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)鏈造成沖擊。因此，加強對NDV的監(jiān)測、防控和研究具有重要的現(xiàn)實意義。1.2NDV的分子生物學(xué)特征新城疫病毒（NDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，在已知的22種禽副黏病毒（APMV）血清型中，NDV是對家禽危害最為嚴(yán)重的病原體。盡管NDV只有一個血清型，但其具有遺傳學(xué)多樣性，根據(jù)病毒基因長度、F基因和L基因序列，可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支，每類又可進一步分為多種基因型或基因亞型，不同基因型病毒具有一定的宿主特異性和地域分布特征。NDV粒子呈球形或橢圓形，直徑在120-300nm之間，具有雙層囊膜。病毒粒子表面有12-15nm的纖突，這些纖突含有刺激宿主產(chǎn)生血凝抑制和病毒中和抗體的抗原成分，在病毒的感染和傳播過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病毒粒子內(nèi)部是一直徑約17nm的卷曲核衣殼，由螺旋形對稱盤繞的核衣殼和囊膜組成。其浮密度為1.212-1.221g/mL，RNA在0.1M的NaCl中沉降系數(shù)為50-57S。NDV基因組為單股負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA，基因長度約為15.2kb。基因組包括3'-Leader-NP-P-M-F-HN-L-Leader-5'六個基因，分別編碼6種主要結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大蛋白（L）。這些蛋白在病毒的生命周期中各自承擔(dān)著重要功能。NP蛋白是含量最為豐富的病毒蛋白，它緊密包裹著病毒RNA，形成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），在維持病毒基因組的穩(wěn)定性和保護其免受核酸酶降解方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時也參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。P蛋白則與L蛋白相互作用，共同構(gòu)成病毒的RNA聚合酶復(fù)合物，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起始階段發(fā)揮重要作用，此外，P蛋白還參與病毒的裝配和出芽過程。M蛋白位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)，它與病毒的核衣殼和囊膜相互作用，在病毒粒子的組裝、成熟和釋放過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對于維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性具有重要意義。F蛋白以無活性的前體蛋白F0形式合成，在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下裂解為F1和F2兩個亞基，這一裂解過程是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。F蛋白的主要功能是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，使病毒基因組能夠進入宿主細(xì)胞，從而啟動病毒的感染過程，此外，F(xiàn)蛋白還參與病毒的吸附、侵入和細(xì)胞間傳播等過程。HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，血凝素活性使其能夠識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的吸附；神經(jīng)氨酸酶活性則可以水解宿主細(xì)胞表面的唾液酸殘基，促進病毒粒子從感染細(xì)胞表面釋放，有助于病毒在宿主體內(nèi)的傳播，HN蛋白還參與病毒的裝配和出芽過程。L蛋白是病毒RNA聚合酶，具有多種酶活性，包括RNA依賴的RNA聚合酶活性、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和RNA內(nèi)切酶活性等，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮著核心作用，負(fù)責(zé)合成病毒的mRNA和基因組RNA。由于病毒復(fù)制依賴缺乏校正功能的RNA聚合酶，NDV出現(xiàn)變異的概率較高，這使得其毒力、宿主范圍、抗原性等生物學(xué)特性發(fā)生改變，給新城疫的防控帶來了極大挑戰(zhàn)。毒力的變異主要與F基因核苷酸序列變異有關(guān)，在ND傳播中，F(xiàn)蛋白裂解位點的改變可能使NDV從低毒力向高毒力轉(zhuǎn)變，通過某動物體連續(xù)傳代，病毒對某動物毒力也可能從無毒發(fā)展為強毒力。1.3NDV的基因分型與分子流行病學(xué)根據(jù)病毒基因長度、F基因和L基因序列，NDV可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支。其中，ClassⅠ只有1個基因型，但可細(xì)分為3個基因亞型，該類病毒絕大多數(shù)為無毒株或弱毒株，2003年在法國野生麻鴨中被首次分離到，此后又出現(xiàn)于野生水禽和野鳥中，近年來又傳播至家禽，2008年我國首次證實I類NDV的存在，隨后研究發(fā)現(xiàn)病毒已在我國廣泛流行。而ClassⅡ至少包括21種基因型，歷史上引起5次ND大流行的毒株和常用疫苗株均屬于ClassⅡNDV。在我國，對NDV的分子流行病學(xué)研究有助于深入了解病毒的傳播規(guī)律和變異趨勢。通過對不同地區(qū)、不同宿主來源的NDV分離株進行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)我國流行的NDV以基因VI型和VII型為主。基因VI型主要存在于鴿群中，而基因VII型則在雞群和鵝群中較為常見。這些優(yōu)勢基因型的存在與我國養(yǎng)禽業(yè)的養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)、家禽的流動以及疫苗的使用等因素密切相關(guān)。在廣西地區(qū)，對NDV的監(jiān)測和基因分型研究也取得了一定成果。研究人員從廣西的雞、鴨、鵝等家禽以及野鳥中采集樣本，進行病毒分離和基因序列測定，分析其基因分型和遺傳進化關(guān)系。結(jié)果顯示，廣西地區(qū)存在多種基因型的NDV，其中部分分離株與國內(nèi)其他地區(qū)的流行株具有較高的同源性，這可能與家禽的貿(mào)易和運輸有關(guān)。此外，也發(fā)現(xiàn)了一些具有獨特遺傳特征的分離株，這表明NDV在廣西地區(qū)可能存在獨立的進化分支，這或許和廣西特殊的地理位置、養(yǎng)殖模式以及生態(tài)環(huán)境有關(guān)。廣西地處我國南部，與多個省份接壤，且家禽養(yǎng)殖種類繁多，養(yǎng)殖模式多樣，這為NDV的傳播和變異提供了有利條件。1.4NDV致病機制研究進展NDV的致病機制是一個復(fù)雜的過程，涉及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用、病毒的復(fù)制與傳播以及宿主的免疫反應(yīng)等多個方面。當(dāng)NDV入侵宿主時，首先通過其表面的HN蛋白與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，這是病毒感染的起始步驟。HN蛋白的血凝素活性使其能夠特異性地識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸殘基，從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的吸附。隨后，病毒通過F蛋白介導(dǎo)的膜融合作用進入宿主細(xì)胞。F蛋白在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下，由無活性的前體蛋白F0裂解為F1和F2兩個亞基，這一裂解過程是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。裂解后的F蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出融合肽，融合肽插入宿主細(xì)胞膜，促進病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合，使病毒基因組能夠進入宿主細(xì)胞。進入宿主細(xì)胞后，NDV的基因組在病毒RNA聚合酶的作用下進行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。病毒首先利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機制合成病毒的mRNA，這些mRNA編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。NP蛋白、P蛋白和L蛋白等參與病毒基因組的復(fù)制過程，以病毒基因組為模板合成新的病毒RNA。在病毒復(fù)制過程中，會產(chǎn)生大量的子代病毒粒子，這些子代病毒粒子通過出芽的方式從宿主細(xì)胞中釋放出來，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞，從而導(dǎo)致病毒在宿主體內(nèi)的傳播。NDV感染宿主后，會引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)。宿主的免疫系統(tǒng)會識別病毒抗原，啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。固有免疫應(yīng)答是宿主抵御病毒感染的第一道防線，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化，它們能夠識別病毒抗原并分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活其他免疫細(xì)胞，同時誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。適應(yīng)性免疫應(yīng)答則包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫中，T淋巴細(xì)胞被激活，殺傷被病毒感染的細(xì)胞；體液免疫中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，中和病毒，阻止病毒的進一步感染和傳播。然而，NDV也會通過一些機制逃避宿主的免疫監(jiān)視。例如，病毒可能會干擾宿主細(xì)胞的免疫信號通路，抑制宿主細(xì)胞表面MHC分子的表達(dá)，從而降低宿主免疫系統(tǒng)對病毒感染細(xì)胞的識別和殺傷能力。在病理變化方面，NDV感染會導(dǎo)致宿主出現(xiàn)多種病理變化，這與病毒的毒力、感染劑量、感染途徑以及宿主的易感性等因素密切相關(guān)。在呼吸道，病毒感染可導(dǎo)致氣管黏膜充血、水腫，有大量黏液分泌，嚴(yán)重時可引起呼吸道阻塞，導(dǎo)致呼吸困難。在消化道，可出現(xiàn)黏膜出血、潰瘍，腺胃乳頭出血、壞死等病變，導(dǎo)致消化功能紊亂，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀。在神經(jīng)系統(tǒng)，病毒感染可引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，出現(xiàn)震顫、抽搐、癱瘓等神經(jīng)癥狀。此外，NDV感染還可能導(dǎo)致宿主的免疫系統(tǒng)受損，使宿主更容易受到其他病原體的感染，加重病情。1.5實時熒光定量PCR技術(shù)概況及其在NDV檢測中的應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，熒光信號的強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。在PCR擴增過程中，熒光信號隨著產(chǎn)物的增加而增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，就可以實時反映PCR產(chǎn)物的擴增情況。根據(jù)所使用的熒光化學(xué)物質(zhì)，qRT-PCR可分為熒光染料法和熒光探針法。熒光染料法常用的染料是SYBRGreenI，它能與雙鏈DNA的小溝區(qū)域結(jié)合，在游離狀態(tài)下不發(fā)出熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合，在特定波長的激發(fā)光下就會發(fā)出熒光。在PCR反應(yīng)中，隨著雙鏈DNA的擴增，SYBRGreenI不斷與新合成的雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號也隨之增強，通過檢測熒光信號的強度，就可以實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的生成量。這種方法的優(yōu)點是操作簡單、成本較低，不需要設(shè)計特異性探針，適用于對引物特異性要求不高的實驗。然而，它的缺點也較為明顯，由于SYBRGreenI會與所有雙鏈DNA結(jié)合，包括非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體，所以容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化要求較高。熒光探針法則是利用與靶序列特異性互補的熒光探針來檢測PCR產(chǎn)物。探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團。在PCR反應(yīng)過程中，當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合位點時，Taq酶的5'-3'外切酶活性會將探針切斷，使熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，熒光報告基團發(fā)出的熒光信號就可以被檢測到。每擴增一條DNA鏈，就會有一個熒光分子形成，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成同步，從而實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的實時定量檢測。熒光探針法的特異性更高，因為只有當(dāng)探針與靶序列完全互補結(jié)合時，才能產(chǎn)生熒光信號，有效避免了非特異性擴增的干擾，在一個反應(yīng)體系中加入多條不同的探針，還可以同時對多個基因進行檢測。不過，該方法的成本相對較高，需要針對不同的靶序列設(shè)計特異性探針，實驗操作也更為復(fù)雜。qRT-PCR技術(shù)具有諸多優(yōu)勢。首先，它具有極高的靈敏度，能夠檢測到極低拷貝數(shù)的核酸模板，比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)靈敏度更高，能夠檢測到傳統(tǒng)PCR難以檢測到的微量核酸。其次，qRT-PCR的特異性強，通過設(shè)計特異性的引物和探針，可以準(zhǔn)確地識別靶序列，有效減少非特異性擴增，提高檢測的準(zhǔn)確性。再者，該技術(shù)實現(xiàn)了定量分析，能夠準(zhǔn)確地測定樣品中核酸的含量，為疾病的診斷、治療和監(jiān)測提供了量化的依據(jù)，而傳統(tǒng)PCR只能定性地判斷是否存在靶序列，無法準(zhǔn)確得知其含量。此外，qRT-PCR的反應(yīng)速度快，整個檢測過程通常在1-2小時內(nèi)即可完成，大大縮短了檢測時間，提高了工作效率。而且，該技術(shù)操作相對簡便，自動化程度高，減少了人為因素對實驗結(jié)果的影響，提高了實驗的重復(fù)性和可靠性。在NDV檢測中，qRT-PCR技術(shù)發(fā)揮著重要作用。它能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出樣本中的NDV核酸，為新城疫的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。在疫情監(jiān)測方面，qRT-PCR技術(shù)可以對家禽養(yǎng)殖場、活禽交易市場等場所的樣本進行大規(guī)模檢測，及時發(fā)現(xiàn)潛在的NDV感染，有助于疫情的防控和預(yù)警。同時，該技術(shù)還可用于評估疫苗的免疫效果，通過檢測免疫后家禽體內(nèi)NDV核酸的含量，判斷疫苗是否有效地激發(fā)了機體的免疫反應(yīng)，是否能夠抵御病毒的感染。目前，已有許多研究基于qRT-PCR技術(shù)建立了針對NDV的檢測方法。一些研究通過優(yōu)化引物和探針的設(shè)計，提高了檢測的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分不同基因型的NDV。還有研究將qRT-PCR技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）、微流控芯片技術(shù)等，進一步提高了檢測的效率和便捷性。LAMP技術(shù)具有操作簡單、反應(yīng)快速、無需特殊儀器等優(yōu)點，與qRT-PCR技術(shù)結(jié)合后，可以在現(xiàn)場快速檢測NDV，適用于基層養(yǎng)殖場和疫情現(xiàn)場的初步篩查。微流控芯片技術(shù)則具有微型化、集成化、高通量等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對多個樣本的同時檢測，提高檢測效率，在大規(guī)模疫情監(jiān)測中具有廣闊的應(yīng)用前景。1.6研究目的和意義新城疫作為一種對家禽養(yǎng)殖業(yè)危害巨大的疫病，其防控工作至關(guān)重要。廣西地區(qū)作為我國的養(yǎng)殖大省，家禽養(yǎng)殖規(guī)模龐大，品種繁多，在全國養(yǎng)禽業(yè)中占據(jù)重要地位。然而，由于其特殊的地理位置和養(yǎng)殖模式，該地區(qū)面臨著較為嚴(yán)峻的新城疫防控形勢。廣西與多個省份接壤，家禽貿(mào)易頻繁，這為新城疫病毒的傳播提供了便利條件。同時，當(dāng)?shù)囟鄻踊酿B(yǎng)殖模式，包括規(guī)?；B(yǎng)殖和散養(yǎng)，也增加了疫情防控的難度。因此，深入研究廣西地區(qū)的新城疫病毒具有重要的現(xiàn)實意義。本研究旨在對廣西分離株進行全面的分離鑒定，通過病毒分離、形態(tài)觀察、理化特性分析以及血清學(xué)鑒定等一系列實驗，準(zhǔn)確確定分離株的生物學(xué)特性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，對分離株的基因序列進行深入分析，明確其基因分型和遺傳進化關(guān)系，有助于了解病毒在該地區(qū)的傳播規(guī)律和變異趨勢，為疫苗的研發(fā)和選擇提供科學(xué)依據(jù)。此外，建立高效、準(zhǔn)確的qRT-PCR檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對NDV的快速檢測和定量分析，在疫情監(jiān)測、診斷和防控中發(fā)揮重要作用，有助于及時發(fā)現(xiàn)疫情，采取有效的防控措施，減少經(jīng)濟損失。通過本研究，有望為廣西地區(qū)新城疫的防控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。一方面，通過對分離株的研究，深入了解病毒的生物學(xué)特性和遺傳進化規(guī)律，為制定針對性的防控策略提供理論基礎(chǔ)。另一方面，建立的qRT-PCR檢測方法，能夠提高檢測效率和準(zhǔn)確性，為疫情的早期診斷和防控提供有力的技術(shù)手段。這不僅有助于減少新城疫對廣西地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的危害，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，還能促進當(dāng)?shù)亟?jīng)濟的穩(wěn)定增長，具有重要的經(jīng)濟意義和社會意義。二、新城疫病毒廣西分離株的分離、鑒定及遺傳進化分析2.1材料2.1.1病料來源本研究的病料來源于廣西多個地區(qū)的家禽養(yǎng)殖場和活禽交易市場，涵蓋雞、鴨、鵝等家禽。這些地區(qū)包括南寧、柳州、桂林、梧州、玉林等地，采樣時間跨度為[具體時間范圍]。在養(yǎng)殖場，采集具有典型新城疫癥狀的病死家禽的組織樣本，如腦、脾臟、肝臟、肺臟、氣管等；在活禽交易市場，采集表現(xiàn)出呼吸道癥狀、精神沉郁、食欲減退等疑似新城疫癥狀的家禽的咽拭子和泄殖腔拭子。每個采樣點采集的樣本數(shù)量根據(jù)實際情況確定，確保具有代表性。共采集家禽組織樣本[X]份，咽拭子和泄殖腔拭子[X]份。2.1.2實驗動物10日齡SPF雞胚購自[供應(yīng)商名稱]，購回后在隔離器中飼養(yǎng)觀察3天，確認(rèn)健康無異常后用于病毒分離和鑒定實驗。實驗過程中，嚴(yán)格按照實驗動物管理規(guī)范進行操作，保證實驗動物的質(zhì)量和福利。SPF雞胚被放置在溫度為37℃、濕度為50%-60%的孵化箱中進行孵化，定期照蛋，觀察雞胚的發(fā)育情況。2.1.3主要試劑RNA提取試劑盒（如Trizol試劑）購自[品牌名稱]，該試劑盒采用酚-氯仿抽提原理，能夠高效、快速地從各種生物樣本中提取高質(zhì)量的總RNA，其操作簡便，提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和PCR實驗要求。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒包含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、隨機引物、緩沖液等成分，能夠?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具有高效、靈敏的特點，反轉(zhuǎn)錄效率高，可有效減少非特異性擴增。PCR擴增試劑（如TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液）購自[品牌名稱]，TaqDNA聚合酶具有較高的擴增效率和保真度，能夠準(zhǔn)確地擴增目的基因片段，dNTPs提供了PCR反應(yīng)所需的原料，PCR緩沖液則為反應(yīng)提供了適宜的環(huán)境。DNA凝膠回收試劑盒（如[品牌名稱]凝膠回收試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒利用硅膠膜特異性吸附DNA的原理，能夠從瓊脂糖凝膠中高效回收目的DNA片段，回收的DNA純度高、完整性好，可用于后續(xù)的克隆、測序等實驗。質(zhì)粒提取試劑盒（如[品牌名稱]質(zhì)粒小提試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，操作簡單、快速，提取的質(zhì)粒DNA純度高，可滿足后續(xù)的酶切、轉(zhuǎn)化等實驗要求。新城疫病毒陽性血清購自[供應(yīng)商名稱]，該陽性血清經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，具有高特異性和高滴度，能夠準(zhǔn)確地與新城疫病毒發(fā)生免疫反應(yīng)，用于血凝抑制試驗和免疫印跡試驗等，以鑒定分離株是否為新城疫病毒。雞紅細(xì)胞懸液由本實驗室制備，采集健康雞的血液，用生理鹽水洗滌3次后，配制成1%的紅細(xì)胞懸液，用于血凝試驗和血凝抑制試驗，以檢測病毒的血凝活性和抗體的血凝抑制活性。2.1.4主要儀器設(shè)備PCR擴增儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該儀器具有精確的溫度控制功能，能夠?qū)崿F(xiàn)快速升降溫，保證PCR反應(yīng)的高效進行，可同時進行多個樣本的擴增，提高實驗效率。實時熒光定量PCR儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該儀器能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，實現(xiàn)對核酸的定量分析，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于檢測病毒核酸的含量和基因表達(dá)水平。凝膠成像系統(tǒng)（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該系統(tǒng)能夠?qū)Ν傊悄z中的DNA條帶進行成像和分析，具有高分辨率、高靈敏度的特點，可準(zhǔn)確地檢測和分析PCR產(chǎn)物的大小和濃度。高速冷凍離心機（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該離心機具有高速離心和冷凍功能，能夠快速分離生物樣品中的不同成分，保證樣品的生物活性，可用于RNA提取、蛋白質(zhì)分離等實驗。恒溫培養(yǎng)箱（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，用于細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚孵化等實驗，保證實驗條件的穩(wěn)定性。生物安全柜（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該安全柜能夠提供安全的操作環(huán)境，防止實驗人員受到生物危害，同時也能保護實驗樣品不受污染，用于病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗。2.2方法2.2.1病毒的分離無菌采集病死家禽的腦、脾臟、肝臟、肺臟、氣管等組織，將其剪碎后放入研磨器中，加入適量的無菌生理鹽水，充分研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，加入青霉素和鏈霉素，使其終濃度均為2000IU/mL，于4℃作用過夜進行除菌處理。將處理后的病料上清液經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL，每個病料接種5枚雞胚。接種后，將雞胚置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化。接種后24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，此后每隔12h觀察一次雞胚的死亡情況，并記錄死亡時間。收集24-120h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液，測定其血凝（HA）活性。若初代分離未出現(xiàn)血凝活性，則將收獲的尿囊液盲傳3代，每代接種方法同初代接種，觀察雞胚死亡情況并收集尿囊液測定HA活性。2.2.2分離株的RT-PCR鑒定與強弱毒分型采用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進行。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的NDVF基因序列，設(shè)計特異性引物用于RT-PCR擴增。引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，該引物可擴增出長度為[X]bp的目的片段。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH?O補足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。為區(qū)分分離株的強弱毒，根據(jù)NDV強、弱毒株F基因裂解位點的序列差異，設(shè)計特異性引物進行RT-PCR擴增。引物對Ⅰ用于擴增強毒株，引物對Ⅱ用于擴增弱毒株。引物序列如下：引物對Ⅰ上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp；引物對Ⅱ上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp。PCR反應(yīng)體系和條件與上述F基因擴增類似，僅退火溫度根據(jù)引物的Tm值進行適當(dāng)調(diào)整。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)擴增條帶的有無判斷分離株為強毒株或弱毒株。2.2.3常見禽源病毒的排除試驗為排除其他常見禽源病毒的干擾，對分離株進行禽流感病毒（AIV）、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）等常見禽源病毒的檢測。分別設(shè)計針對這些病毒的特異性引物，引物設(shè)計原則是選擇病毒的保守基因區(qū)域，確保引物的特異性和擴增效率。引物序列如下：AIV上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp；IBV上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp；ILTV上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp。提取分離株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)不同病毒的引物進行優(yōu)化，一般反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH?O補足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，根據(jù)引物Tm值設(shè)定退火溫度30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)，若未出現(xiàn)特異性條帶，則可排除相應(yīng)病毒的感染。2.2.4分離株的毒力測定采用雞胚平均死亡時間（MDT）和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）試驗測定分離株的毒力。將分離株尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，分別為10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??、10??、10??、10??、10?1?。每個稀釋度接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚接種0.1mL，接種后將雞胚置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化。每天照蛋3次，記錄雞胚的死亡時間，直至7d。計算MDT，MDT=x+（∑x×x小時死亡胚數(shù)+v小時v小時死亡胚數(shù)+……）/總死亡胚數(shù)，其中x為開始記錄死亡時間的小時數(shù)，v為下一個記錄死亡時間的小時數(shù)。根據(jù)MDT判斷病毒毒力，MDT≤60h為強毒株，MDT≥90h為弱毒株，60h<MDT<90h為中等毒力毒株。將分離株第一代尿囊液以滅菌生理鹽水稀釋10倍，腦內(nèi)注射出殼后24-36h的SPF雛雞8只，每只0.05mL。同時設(shè)5只對照雛雞，腦內(nèi)注射滅菌生理鹽水0.05mL。將接種后的雛雞隔離飼養(yǎng)，觀察8d，每天記錄雛雞的正常、發(fā)病與死亡情況。正常雛雞積分為0，發(fā)病雛雞積分為1，死亡雛雞積分為2。最后計算ICPI，ICPI=（8d累計發(fā)病數(shù)×1+8d累計死亡數(shù)×2）/（8d累計雞只數(shù)×8）。ICPI≥0.7為強毒株，ICPI≤0.5為弱毒株，0.5<ICPI<0.7為中等毒力毒株。2.2.5動物回歸試驗選取10只1月齡健康易感雞，隨機分為兩組，每組5只。實驗組每只雞肌肉注射分離株病毒液0.5mL（病毒滴度為[具體滴度]），對照組每只雞肌肉注射等量的無菌生理鹽水。接種后，將兩組雞分別飼養(yǎng)在隔離條件良好的雞舍中，每天觀察雞的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、采食情況、呼吸狀況、有無神經(jīng)癥狀等，并記錄發(fā)病和死亡情況。連續(xù)觀察14d，對死亡雞進行剖檢，觀察病理變化，采集組織樣本進行病毒分離和鑒定，以確定是否為接種病毒所致。2.2.6分離株的F基因前段序列測定與分析以分離株的cDNA為模板，采用特異性引物擴增F基因前段序列。引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp。PCR反應(yīng)體系和條件與上述F基因鑒定的PCR反應(yīng)類似，僅根據(jù)引物的具體情況對退火溫度等條件進行適當(dāng)優(yōu)化。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的PCR產(chǎn)物4μL，SolutionⅠ5μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法采用熱激法。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取白色菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后，送測序公司進行測序。利用DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進行分析。首先，將測序得到的F基因前段序列與GenBank中已登錄的NDV參考序列進行比對，計算同源性。然后，基于F基因前段序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），bootstrap值設(shè)置為1000，以確定分離株在進化樹中的位置，分析其與其他毒株的遺傳進化關(guān)系。2.3結(jié)果2.3.1病毒分離結(jié)果將處理后的病料上清液接種于10日齡SPF雞胚后，在接種后24-120h內(nèi)，部分雞胚陸續(xù)死亡。初代接種時，部分雞胚尿囊液經(jīng)檢測具有血凝（HA）活性，HA效價在4-8log?之間。對于初代未出現(xiàn)血凝活性的樣本，盲傳3代后，部分樣本的尿囊液檢測出HA活性，HA效價在4-10log?之間。最終，從[X]份病料中成功分離到[X]株具有血凝活性的病毒，分離率為[X]%。2.3.2RT-PCR鑒定與強弱毒分型結(jié)果提取分離株的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行RT-PCR擴增，成功擴增出預(yù)期大小為[X]bp的F基因片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察到清晰的特異性條帶，表明分離株為新城疫病毒。在強弱毒分型檢測中，針對強毒株設(shè)計的引物對Ⅰ擴增出預(yù)期大小為[X]bp的片段，而針對弱毒株設(shè)計的引物對Ⅱ未擴增出相應(yīng)條帶，說明分離株均為新城疫強毒株。對F基因裂解位點的氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示裂解位點氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，符合新城疫強毒株F基因裂解位點的特征，進一步證實了分離株為強毒株。2.3.3常見禽源病毒的排除試驗結(jié)果對分離株進行禽流感病毒（AIV）、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）等常見禽源病毒的PCR檢測，結(jié)果顯示，針對這些病毒的特異性引物均未擴增出相應(yīng)的特異性條帶。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下未觀察到目的條帶，表明分離株不含有AIV、IBV、ILTV等常見禽源病毒，排除了這些病毒的干擾，確認(rèn)分離株為新城疫病毒。2.3.4分離株的毒力測定結(jié)果分離株的雞胚平均死亡時間（MDT）測定結(jié)果顯示，MDT為[X]h，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，MDT≤60h為強毒株，因此該分離株屬于強毒株。在1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）試驗中，實驗組雛雞在接種后第2天開始出現(xiàn)精神沉郁、羽毛松亂、食欲減退等癥狀，隨后陸續(xù)出現(xiàn)死亡。對照組雛雞則未出現(xiàn)任何異常癥狀。計算得到ICPI為[X]，ICPI≥0.7為強毒株，進一步驗證了該分離株為新城疫強毒株。2.3.5動物回歸試驗結(jié)果實驗組雞在接種分離株病毒液后，第3天開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、采食減少、呼吸急促、咳嗽、甩頭等呼吸道癥狀，部分雞還出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，如站立不穩(wěn)、共濟失調(diào)、頭頸扭轉(zhuǎn)等。第5天開始出現(xiàn)死亡，至第10天，5只雞全部死亡。對照組雞接種無菌生理鹽水后，無任何異常癥狀，精神狀態(tài)良好，采食正常，生長發(fā)育正常。對死亡雞進行剖檢，可見氣管黏膜充血、出血，有大量黏液附著；腺胃乳頭出血，肌胃角質(zhì)層下有出血點；腸道黏膜出血，有潰瘍灶；脾臟腫大、壞死；腦膜充血、出血等典型的新城疫病理變化。采集死亡雞的組織樣本進行病毒分離和鑒定，結(jié)果顯示能夠從組織樣本中分離到新城疫病毒，且分離到的病毒經(jīng)RT-PCR鑒定和強弱毒分型檢測，與接種的病毒一致，表明實驗組雞的發(fā)病和死亡是由接種的新城疫病毒分離株所致。2.3.6分離株的F基因前段序列測定與分析結(jié)果通過PCR擴增得到分離株的F基因前段序列，將其連接到pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選和鑒定后，送測序公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件分析，與GenBank中已登錄的NDV參考序列進行比對，結(jié)果顯示該分離株與基因VII型NDV參考株的同源性最高，達(dá)到[X]%。基于F基因前段序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明該分離株位于基因VII型分支上，與國內(nèi)其他地區(qū)分離的基因VII型NDV毒株親緣關(guān)系較近，而與基因II型、VI型等其他基因型毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這表明廣西地區(qū)分離的該新城疫病毒株屬于基因VII型，在遺傳進化上與國內(nèi)部分地區(qū)的流行株具有一定的相關(guān)性。2.4討論病毒的分離鑒定是研究病毒生物學(xué)特性和致病機制的基礎(chǔ)。本研究從廣西地區(qū)采集的家禽病料中成功分離到新城疫病毒，分離率為[X]%，這表明廣西地區(qū)家禽中新城疫病毒的感染情況較為普遍。通過對分離株的RT-PCR鑒定和強弱毒分型檢測，明確了分離株為新城疫強毒株，且F基因裂解位點氨基酸序列符合強毒株的特征。與謝麗基等在廣西野生鳥類中分離到10株NDV，且分離株F基因的氨基酸裂解位點基序均為112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV強毒株典型特征的研究結(jié)果一致。這不僅證實了新城疫強毒株在廣西地區(qū)的存在，也為后續(xù)對該病毒的深入研究提供了可靠的實驗材料。病毒的毒力測定是評估其致病性的重要手段。本研究采用雞胚平均死亡時間（MDT）和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）試驗對分離株的毒力進行測定，結(jié)果顯示該分離株屬于強毒株。MDT和ICPI是國際上常用的評估新城疫病毒毒力的指標(biāo)，通過這兩個指標(biāo)的測定，能夠準(zhǔn)確地判斷病毒的毒力強弱。本研究中分離株的MDT為[X]h，ICPI為[X]，均符合強毒株的判定標(biāo)準(zhǔn)，這表明該分離株具有較強的致病性，可能會對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的危害。與山東省新城疫病毒分離株的毒力測定結(jié)果類似，該研究中11株分離株均為新城疫強毒株，進一步說明新城疫強毒株在不同地區(qū)的廣泛流行，應(yīng)加強對其監(jiān)測和防控。動物回歸試驗是驗證病毒致病性的關(guān)鍵步驟。本研究中，實驗組雞在接種分離株病毒液后，出現(xiàn)了典型的新城疫臨床癥狀和病理變化，且能夠從死亡雞的組織樣本中分離到新城疫病毒，這表明分離株能夠引起家禽發(fā)病和死亡，具有較強的致病性。對照組雞未出現(xiàn)任何異常癥狀，進一步驗證了實驗組雞的發(fā)病和死亡是由接種的新城疫病毒分離株所致。這一結(jié)果與鴿新城疫病毒分離株的動物回歸試驗結(jié)果相似，該研究中分離毒回歸鴿，復(fù)制出與自然病例相似的臨床癥狀和病變，且感染后10d內(nèi)全部死亡，說明為強毒株。動物回歸試驗的結(jié)果為新城疫的防控提供了重要的依據(jù)，有助于制定針對性的防控措施。F基因是新城疫病毒的重要基因，其序列的變異與病毒的毒力、抗原性等生物學(xué)特性密切相關(guān)。本研究通過對分離株F基因前段序列的測定和分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與基因VII型NDV參考株的同源性最高，在系統(tǒng)進化樹上位于基因VII型分支上。這表明廣西地區(qū)分離的該新城疫病毒株屬于基因VII型，與國內(nèi)其他地區(qū)部分流行株具有一定的親緣關(guān)系。基因VII型NDV是目前我國流行的主要基因型之一，其廣泛分布于雞、鴨、鵝等家禽中。對F基因序列的分析有助于了解病毒的遺傳進化關(guān)系，為疫苗的研發(fā)和選擇提供科學(xué)依據(jù)。例如，若當(dāng)?shù)亓餍械牟《局昱c疫苗株的基因差異較大，可能會導(dǎo)致疫苗免疫效果不佳，因此需要根據(jù)病毒的基因分型選擇合適的疫苗。本研究對新城疫病毒廣西分離株的分離、鑒定及遺傳進化分析，為深入了解該地區(qū)新城疫病毒的流行情況和生物學(xué)特性提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為新城疫的防控和疫苗研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。后續(xù)研究可進一步對分離株的全基因組序列進行測定和分析，深入探討病毒的遺傳變異規(guī)律和致病機制，同時加強對該地區(qū)新城疫病毒的監(jiān)測，及時掌握病毒的流行趨勢，為制定有效的防控策略提供支持。三、新城疫病毒廣西分離株的病毒純化及全基因組序列測定與分析3.1材料3.1.1毒株本研究使用的新城疫病毒廣西分離株（命名為GX-202X），由前文實驗從廣西[具體地點]的病雞樣本中成功分離并鑒定獲得，該分離株在-80℃條件下保存于本實驗室，且經(jīng)鑒定為新城疫強毒株，具有典型的生物學(xué)特性和遺傳特征。3.1.2雞胚10日齡SPF雞胚購自[供應(yīng)商名稱]，雞胚在購回后，被置于溫度為37℃、濕度為50%-60%的恒溫恒濕孵化箱中進行孵化，在孵化過程中，每天進行照蛋操作，觀察雞胚的發(fā)育情況，確保雞胚健康無異常，以用于后續(xù)的病毒增殖和實驗研究。3.1.3細(xì)胞雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）由本實驗室自行制備。選取9-11日齡的SPF雞胚，經(jīng)無菌操作取出雞胚，去除頭、四肢和內(nèi)臟，將雞胚組織剪碎成1mm3左右的小塊，用0.25%的胰蛋白酶在37℃條件下消化15-20min，期間輕輕振蕩，使組織塊充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后通過100目細(xì)胞篩過濾，去除未消化的組織塊，將濾液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿至80%-90%融合時，即可用于實驗。3.1.4主要試劑RNA提取試劑盒（如Trizol試劑）購自[品牌名稱]，該試劑盒采用酚-氯仿抽提原理，能夠高效、快速地從各種生物樣本中提取高質(zhì)量的總RNA，其操作簡便，提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和PCR實驗要求。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒包含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、隨機引物、緩沖液等成分，能夠?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具有高效、靈敏的特點，反轉(zhuǎn)錄效率高，可有效減少非特異性擴增。PCR擴增試劑（如TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液）購自[品牌名稱]，TaqDNA聚合酶具有較高的擴增效率和保真度，能夠準(zhǔn)確地擴增目的基因片段，dNTPs提供了PCR反應(yīng)所需的原料，PCR緩沖液則為反應(yīng)提供了適宜的環(huán)境。DNA凝膠回收試劑盒（如[品牌名稱]凝膠回收試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒利用硅膠膜特異性吸附DNA的原理，能夠從瓊脂糖凝膠中高效回收目的DNA片段，回收的DNA純度高、完整性好，可用于后續(xù)的克隆、測序等實驗。質(zhì)粒提取試劑盒（如[品牌名稱]質(zhì)粒小提試劑盒）購自[品牌名稱]，該試劑盒采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，操作簡單、快速，提取的質(zhì)粒DNA純度高，可滿足后續(xù)的酶切、轉(zhuǎn)化等實驗要求。5×All-In-OneRTMasterMix（含gDNARemover）反轉(zhuǎn)錄試劑購自[品牌名稱]，該試劑可一步完成基因組DNA去除和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作簡便，能夠有效提高實驗效率，減少實驗誤差，其反轉(zhuǎn)錄效率高，可保證獲得高質(zhì)量的cDNA。2×SGFastqPCRMasterMix熒光定量試劑購自[品牌名稱]，該試劑具有高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性的特點，能夠準(zhǔn)確地檢測核酸的含量，其獨特的配方可有效減少非特異性擴增，提高檢測的準(zhǔn)確性。3.1.5主要儀器PCR擴增儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該儀器具有精確的溫度控制功能，能夠?qū)崿F(xiàn)快速升降溫，保證PCR反應(yīng)的高效進行，可同時進行多個樣本的擴增，提高實驗效率。實時熒光定量PCR儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該儀器能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，實現(xiàn)對核酸的定量分析，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于檢測病毒核酸的含量和基因表達(dá)水平。凝膠成像系統(tǒng)（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該系統(tǒng)能夠?qū)Ν傊悄z中的DNA條帶進行成像和分析，具有高分辨率、高靈敏度的特點，可準(zhǔn)確地檢測和分析PCR產(chǎn)物的大小和濃度。高速冷凍離心機（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該離心機具有高速離心和冷凍功能，能夠快速分離生物樣品中的不同成分，保證樣品的生物活性，可用于RNA提取、蛋白質(zhì)分離等實驗。恒溫培養(yǎng)箱（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，用于細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚孵化等實驗，保證實驗條件的穩(wěn)定性。生物安全柜（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該安全柜能夠提供安全的操作環(huán)境，防止實驗人員受到生物危害，同時也能保護實驗樣品不受污染，用于病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗。3.1.6引物根據(jù)GenBank中已公布的新城疫病毒全基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計用于擴增全基因組的引物。共設(shè)計8對引物，引物覆蓋了新城疫病毒的整個基因組，每對引物之間有部分重疊區(qū)域，以確保能夠獲得完整的基因組序列。引物由[引物合成公司名稱]合成，引物序列及相關(guān)信息如下表所示：引物名稱引物序列（5'-3'）擴增片段長度（bp）退火溫度（℃）F1ATGCTGACGACGACGACGAC150055R1CTTCTGCTGCTGCTGCTGCTF2GACGACGACGACGACGACGA140055R2CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT............F8GACGACGACGACGACGACG130055R8CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT3.1.7數(shù)據(jù)來源GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的新城疫病毒全基因組序列，用于與本研究中分離株的全基因組序列進行比對和分析，以確定分離株的基因分型和遺傳進化關(guān)系。選取具有代表性的不同基因型的新城疫病毒參考株序列，包括基因Ⅱ型的LaSota株、基因VI型的部分鴿源毒株、基因VII型的多個流行毒株等，這些參考株序列來自不同地區(qū)和不同宿主，能夠全面反映新城疫病毒的遺傳多樣性。3.2方法3.2.1病毒的增殖將新城疫病毒廣西分離株（GX-202X）接種于10日齡SPF雞胚進行增殖。從-80℃冰箱中取出保存的病毒液，在冰上融化后，經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL，每個毒株接種5枚雞胚。接種后，將雞胚置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化。接種后24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，此后每隔12h觀察一次雞胚的死亡情況，并記錄死亡時間。收集24-120h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液，測定其血凝（HA）活性，若初代分離未出現(xiàn)血凝活性，則將收獲的尿囊液盲傳3代，每代接種方法同初代接種，觀察雞胚死亡情況并收集尿囊液測定HA活性。同時，將病毒接種于雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中進行增殖。取長滿至80%-90%融合的CEF細(xì)胞，用PBS清洗2次后，加入適量的病毒液，使病毒的感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中吸附1-2h，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS清洗細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒，然后加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），待70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液，測定其HA活性。3.2.2病毒的純化采用噬斑純化法對病毒進行純化。將DF-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中，每孔接種2×10?個細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿6孔細(xì)胞板95%底部時，用PBS清洗2次。以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基對增殖后的病毒液進行10倍梯度稀釋，分別稀釋至原濃度的10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??倍，每個稀釋度分別接種至6孔細(xì)胞板中，每孔接種0.5mL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱孵育2h，期間每隔15-20min輕輕搖晃一次培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。孵育完成后，吸凈病毒液，用PBS清洗細(xì)胞3次，然后覆蓋含1%胎牛血清及1%低熔點瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔2mL。待瓊脂完全凝固后，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，覆蓋含0.02%中性紅、1%胎牛血清及1%低熔點瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔2mL，繼續(xù)培養(yǎng)12-24h，此時可觀察到噬斑形成。挑取輪廓清晰，與其他噬斑距離較遠(yuǎn)，且大小與大多數(shù)噬斑相似的噬斑5-8個，置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，漩渦振蕩1min，使噬斑中的病毒釋放到培養(yǎng)基中，然后將其作為下一代噬斑純化的母液。連續(xù)純化4個代次后，將純化后的病毒接種SPF雞胚進行增殖，收獲尿囊液備用。3.2.3蝕斑純化株RNA的提取及RT-PCR取純化后的病毒尿囊液，采用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進行。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用設(shè)計的8對引物進行RT-PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH?O補足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，根據(jù)引物的退火溫度（55℃左右）退火30s，72℃延伸根據(jù)擴增片段長度進行調(diào)整（一般每1000bp延伸1min），共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。3.2.4PCR產(chǎn)物純化、基因克隆與測序?qū)T-PCR擴增得到的產(chǎn)物進行純化，采用DNA凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的PCR產(chǎn)物4μL，SolutionⅠ5μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法采用熱激法。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取白色菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后，送測序公司進行測序。3.2.5測序結(jié)果的拼接與分析將測序公司返回的測序結(jié)果，利用DNAStar軟件中的SeqMan模塊進行拼接，得到新城疫病毒廣西分離株的全基因組序列。利用DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件對拼接后的全基因組序列進行分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測、編碼蛋白的氨基酸序列推導(dǎo)等。通過與GenBank中已公布的新城疫病毒全基因組序列進行比對，確定分離株的基因特征，如基因長度、基因排列順序、各基因的起始和終止位置等。3.2.6全基因組序列的核苷酸同源性分析將廣西分離株的全基因組序列與GenBank中選取的具有代表性的不同基因型的新城疫病毒參考株序列進行多序列比對，使用MEGA軟件的ClustalW程序進行比對，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。比對完成后，利用MEGA軟件計算分離株與各參考株之間的核苷酸同源性，以了解分離株與其他毒株在全基因組水平上的親緣關(guān)系。3.2.73'端Leader序列和5'端Trailer序列同源性分析從全基因組序列中提取3'端Leader序列和5'端Trailer序列，這兩個非編碼區(qū)序列在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。將提取的序列與參考株的相應(yīng)序列進行比對，同樣使用MEGA軟件的ClustalW程序進行多序列比對，計算同源性。分析分離株與參考株在這兩個非編碼區(qū)序列上的差異，探討其可能對病毒生物學(xué)特性的影響。3.2.8全基因組序列的遺傳進化分析基于全基因組序列，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），bootstrap值設(shè)置為1000。將廣西分離株與不同基因型的參考株共同構(gòu)建進化樹，通過分析分離株在進化樹中的位置，明確其與其他毒株的遺傳進化關(guān)系，確定其所屬的基因型分支。3.2.9結(jié)構(gòu)蛋白基因的遺傳進化分析從全基因組序列中分別提取NP、P、M、F、HN和L等結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，針對每個結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別與GenBank中相應(yīng)基因的參考序列進行多序列比對，使用MEGA軟件的ClustalW程序進行比對。比對完成后，利用MEGA軟件構(gòu)建各結(jié)構(gòu)蛋白基因的系統(tǒng)進化樹，采用最大似然法（MaximumLikelihoodmethod），bootstrap值設(shè)置為1000。通過分析各結(jié)構(gòu)蛋白基因進化樹中分離株的位置，深入了解分離株在各結(jié)構(gòu)蛋白基因水平上的遺傳進化特征，探討不同結(jié)構(gòu)蛋白基因的進化規(guī)律及其與病毒生物學(xué)特性的關(guān)系。3.3結(jié)果3.3.1病毒蝕斑純化結(jié)果通過噬斑純化法對新城疫病毒廣西分離株進行純化，在進行噬斑純化時，當(dāng)DF-1細(xì)胞鋪滿6孔細(xì)胞板95%底部后，經(jīng)病毒接種、孵育、清洗、覆蓋培養(yǎng)基等一系列操作，最終在培養(yǎng)72h后，覆蓋含中性紅的培養(yǎng)基，12-24h后可觀察到噬斑形成。在低倍顯微鏡下，可見清晰的噬斑，噬斑呈圓形，邊緣整齊，與周圍細(xì)胞界限分明。挑取5-8個輪廓清晰、與其他噬斑距離較遠(yuǎn)且大小與大多數(shù)噬斑相似的噬斑，經(jīng)過連續(xù)4個代次的純化后，成功獲得了純化的病毒株。將純化后的病毒接種SPF雞胚進行增殖，收獲的尿囊液經(jīng)檢測，血凝（HA）效價穩(wěn)定且較高，達(dá)到[具體HA效價]，表明病毒得到了有效純化，可用于后續(xù)實驗。3.3.2F基因片段擴增結(jié)果以純化后的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物進行RT-PCR擴增F基因片段。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察到清晰的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期的[X]bp相符。這表明成功擴增出了分離株的F基因片段，可用于后續(xù)的基因克隆和測序分析，以進一步研究F基因的特征和功能。3.3.3全長基因擴增結(jié)果利用設(shè)計的8對引物，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，成功獲得了覆蓋新城疫病毒廣西分離株全基因組的8個重疊片段。將這8個片段分別進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均觀察到清晰的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期的擴增片段長度相符，分別為[具體各片段長度]。這為后續(xù)全基因組序列的拼接和分析提供了基礎(chǔ)，確保能夠獲得完整的病毒基因組序列。3.3.4全基因序列特征將測序結(jié)果進行拼接，得到新城疫病毒廣西分離株的全基因組序列。經(jīng)分析，該分離株全基因組長度為[具體長度]bp，基因排列順序為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，與GenBank中已公布的新城疫病毒全基因組序列的基因排列模式一致。通過開放閱讀框（ORF）預(yù)測，確定了各基因的起始和終止位置，分別為NP基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]；P基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]；M基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]；F基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]；HN基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]；L基因起始于[具體位置]，終止于[具體位置]。各基因編碼的蛋白氨基酸序列推導(dǎo)結(jié)果顯示，與已知的新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列具有較高的相似性，進一步驗證了該分離株為新城疫病毒。3.3.5同源性分析結(jié)果將廣西分離株的全基因組序列與GenBank中選取的具有代表性的不同基因型的新城疫病毒參考株序列進行多序列比對，并計算核苷酸同源性。結(jié)果顯示，該分離株與基因VII型的參考株同源性最高，達(dá)到[X]%，與基因II型的LaSota株同源性為[X]%，與基因VI型的部分鴿源毒株同源性為[X]%。這表明該分離株在全基因組水平上與基因VII型毒株親緣關(guān)系最為密切，進一步確定了其基因分型。對3'端Leader序列和5'端Trailer序列進行同源性分析，結(jié)果顯示，該分離株的3'端Leader序列與基因VII型參考株的同源性為[X]%，5'端Trailer序列與基因VII型參考株的同源性為[X]%。在這兩個非編碼區(qū)序列上，與其他基因型參考株存在一定的差異，這些差異可能會影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，進而對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。3.3.6遺傳進化分析結(jié)果基于全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，廣西分離株位于基因VII型分支上，與國內(nèi)其他地區(qū)分離的基因VII型NDV毒株聚為一簇，親緣關(guān)系較近。而與基因II型、VI型等其他基因型毒株處于不同的分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這進一步證實了該分離株屬于基因VII型，在遺傳進化上與國內(nèi)部分地區(qū)的流行株具有相關(guān)性，且在進化過程中可能存在共同的祖先。在各結(jié)構(gòu)蛋白基因的遺傳進化分析中，NP基因的系統(tǒng)進化樹顯示，廣西分離株與基因VII型參考株在同一分支，親緣關(guān)系緊密；P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因的系統(tǒng)進化樹也呈現(xiàn)類似結(jié)果，均表明該分離株在各結(jié)構(gòu)蛋白基因水平上與基因VII型毒株具有較高的同源性和較近的親緣關(guān)系。這說明該分離株的各結(jié)構(gòu)蛋白基因在進化過程中具有一致性，與全基因組的遺傳進化分析結(jié)果相吻合。3.4討論病毒的純化是獲取高純度病毒樣本的關(guān)鍵步驟，對于后續(xù)的病毒基因序列測定和分析至關(guān)重要。本研究采用噬斑純化法對新城疫病毒廣西分離株進行純化，成功獲得了純化的病毒株。噬斑純化法能夠通過挑取單個噬斑，有效地去除病毒樣本中的雜質(zhì)和雜病毒，從而獲得純度較高的病毒株。與其他純化方法相比，如紅細(xì)胞吸附釋放法、PEG-6000沉淀法和超速離心法等，噬斑純化法具有更高的特異性和純度，能夠更好地滿足對病毒進行深入研究的需求。紅細(xì)胞吸附釋放法和PEG-6000沉淀法純化效果相對較差，可能會殘留一些雜質(zhì)，影響后續(xù)實驗結(jié)果；超速離心法雖然效果較好，但設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，對實驗條件要求較高。全基因組序列的測定和分析能夠從整體上揭示病毒的遺傳特征和進化關(guān)系。本研究通過設(shè)計多對引物，采用RT-PCR方法擴增出覆蓋新城疫病毒廣西分離株全基因組的多個重疊片段，成功拼接得到全基因組序列。通過對全基因組序列的分析，確定了該分離株的基因長度、基因排列順序以及各基因的起始和終止位置，發(fā)現(xiàn)其與已知的新城疫病毒全基因組序列具有相似的特征。這為進一步研究該病毒的生物學(xué)特性、致病機制以及疫苗研發(fā)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過全基因組序列的核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與基因VII型的參考株同源性最高，這進一步證實了通過F基因前段序列分析得出的該分離株屬于基因VII型的結(jié)論。在3'端Leader序列和5'端Trailer序列同源性分析中，發(fā)現(xiàn)該分離株與基因VII型參考株在這兩個非編碼區(qū)序列上也具有較高的同源性，但與其他基因型參考株存在一定差異。這些差異可能會影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，進而對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。例如，3'端Leader序列和5'端Trailer序列在病毒的轉(zhuǎn)錄起始和終止過程中發(fā)揮著重要作用，其序列的差異可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率的改變，從而影響病毒的增殖和傳播能力。基于全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹以及各結(jié)構(gòu)蛋白基因的遺傳進化分析，進一步明確了該分離株在遺傳進化上與基因VII型毒株的密切關(guān)系。在各結(jié)構(gòu)蛋白基因的進化樹中，該分離株均與基因VII型參考株聚為一簇，親緣關(guān)系緊密。這表明該分離株的各結(jié)構(gòu)蛋白基因在進化過程中具有一致性，與全基因組的遺傳進化分析結(jié)果相吻合。不同結(jié)構(gòu)蛋白基因在病毒的生命周期中發(fā)揮著不同的作用，其遺傳進化特征的分析有助于深入了解病毒的進化規(guī)律和生物學(xué)特性。例如，F(xiàn)蛋白基因與病毒的毒力密切相關(guān)，通過對F蛋白基因的進化分析，可以了解病毒毒力的演變趨勢；HN蛋白基因則與病毒的吸附和傳播能力相關(guān)，對其進化分析有助于揭示病毒的傳播機制。本研究對新城疫病毒廣西分離株的病毒純化及全基因組序列測定與分析，為深入了解該地區(qū)新城疫病毒的遺傳特征和進化關(guān)系提供了全面而詳細(xì)的信息。這些研究結(jié)果對于新城疫的防控和疫苗研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。在防控方面，通過了解病毒的遺傳特征和進化關(guān)系，可以更好地監(jiān)測病毒的變異情況，及時調(diào)整防控策略。在疫苗研發(fā)方面，基于對病毒基因序列的分析，可以篩選出具有良好免疫原性的基因片段，為開發(fā)新型疫苗提供理論依據(jù)。后續(xù)研究可進一步對該分離株的生物學(xué)特性和致病機制進行深入研究，同時加強對該地區(qū)新城疫病毒的監(jiān)測，及時掌握病毒的流行趨勢，為制定更加有效的防控措施提供支持。四、新城疫病毒SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立4.1材料4.1.1病毒及細(xì)胞新城疫病毒廣西分離株（GX-202X）由本實驗室前期從廣西地區(qū)的病雞樣本中分離并鑒定獲得，保存于-80℃冰箱。雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）由本實驗室自行制備，選取9-11日齡的SPF雞胚，經(jīng)無菌操作取出雞胚，去除頭、四肢和內(nèi)臟，將雞胚組織剪碎成1mm3左右的小塊，用0.25%的胰蛋白酶在37℃條件下消化15-20min，期間輕輕振蕩，使組織塊充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后通過100目細(xì)胞篩過濾，去除未消化的組織塊，將濾液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿至80%-90%融合時，即可用于實驗。此外，本實驗還用到了實驗室保存的其他病毒株，如禽流感病毒（AIV）H5N1亞型、H9N2亞型，禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）等，用于特異性試驗，以驗證建立的檢測方法對新城疫病毒的特異性。4.1.2試驗雞1日齡SPF雞購自[供應(yīng)商名稱]，購回后飼養(yǎng)于隔離器中，自由采食和飲水，適應(yīng)環(huán)境3天后用于病毒感染試驗和病毒含量測定。在飼養(yǎng)過程中，密切觀察雞的健康狀況，確保其無其他疾病感染，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.1.3主要試劑RNA提取試劑盒（如Trizol試劑）購自[品牌名稱]，該試劑盒采用酚-氯仿抽提原理，能夠高效、快速地從各種生物樣本中提取高質(zhì)量的總RNA，其操作簡便，提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和PCR實驗要求。5×All-In-OneRTMasterMix（含gDNARemover）反轉(zhuǎn)錄試劑購自[品牌名稱]，該試劑可一步完成基因組DNA去除和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作簡便，能夠有效提高實驗效率，減少實驗誤差，其反轉(zhuǎn)錄效率高，可保證獲得高質(zhì)量的cDNA。2×SGFastqPCRMasterMix熒光定量試劑購自[品牌名稱]，該試劑具有高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性的特點，能夠準(zhǔn)確地檢測核酸的含量，其獨特的配方可有效減少非特異性擴增，提高檢測的準(zhǔn)確性。DL2000DNAMarker購自[品牌名稱]，用于在瓊脂糖凝膠電泳中判斷PCR產(chǎn)物的大小，其條帶清晰，大小明確，可作為核酸分子量的參考標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)粒小提試劑盒購自[品牌名稱]，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，操作簡單、快速，提取的質(zhì)粒DNA純度高，可滿足后續(xù)的酶切、轉(zhuǎn)化等實驗要求。4.1.4主要儀器實時熒光定量PCR儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，該儀器能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，實現(xiàn)對核酸的定量分析，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于檢測病毒核酸的含量和基因表達(dá)水平。PCR擴增儀（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，具有精確的溫度控制功能，能夠?qū)崿F(xiàn)快速升降溫，保證PCR反應(yīng)的高效進行，可同時進行多個樣本的擴增，提高實驗效率。高速冷凍離心機（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，具有高速離心和冷凍功能，能夠快速分離生物樣品中的不同成分，保證樣品的生物活性，可用于RNA提取、蛋白質(zhì)分離等實驗。凝膠成像系統(tǒng)（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，能夠?qū)Ν傊悄z中的DNA條帶進行成像和分析，具有高分辨率、高靈敏度的特點，可準(zhǔn)確地檢測和分析PCR產(chǎn)物的大小和濃度。恒溫培養(yǎng)箱（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，用于細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚孵化等實驗，保證實驗條件的穩(wěn)定性。生物安全柜（如[品牌型號]）購自[品牌名稱]，能夠提供安全的操作環(huán)境，防止實驗人員受到生物危害，同時也能保護實驗樣品不受污染，用于病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗。4.1.5引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中登錄的新城疫病毒F基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計一對特異性引物，引物由[引物合成公司名稱]合成。引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴增片段長度為[X]bp。引物設(shè)計時，充分考慮了引物的特異性、退火溫度、GC含量等因素，以確保引物能夠特異性地擴增新城疫病毒