延邊黃牛骨膠原蛋白肽：制備、結(jié)構(gòu)解析與體外功效探究一、引言1.1研究背景與意義在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域，對(duì)功能性成分的深入挖掘和利用始終是研究的重點(diǎn)方向。延邊黃牛作為中國(guó)五大地方良種牛之一，在吉林延邊地區(qū)養(yǎng)殖歷史悠久，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。在黃牛的屠宰加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的牛骨，牛骨通常被視為廢棄物，這不僅造成資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來環(huán)境污染問題。但實(shí)際上，牛骨中含有豐富的膠原蛋白，約占牛骨總蛋白的80%以上，通過特定的技術(shù)手段將其轉(zhuǎn)化為骨膠原蛋白肽，能夠充分挖掘牛骨的潛在價(jià)值，實(shí)現(xiàn)資源的高效利用。骨膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)酶解、發(fā)酵等技術(shù)處理后得到的小分子肽，其分子量一般在1000-5000Da之間，具有良好的水溶性、易消化吸收性和生物活性。在食品領(lǐng)域，延邊黃牛骨膠原蛋白肽可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到各類食品中，增強(qiáng)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。如在乳制品中添加骨膠原蛋白肽，不僅可以提升乳制品的蛋白質(zhì)含量，還能改善其口感和穩(wěn)定性，滿足消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)的雙重追求。在烘焙食品中，添加骨膠原蛋白肽能使面包、蛋糕等產(chǎn)品更加松軟，延長(zhǎng)其保質(zhì)期，同時(shí)賦予產(chǎn)品獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，拓展烘焙食品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。在飲料行業(yè)，骨膠原蛋白肽可以開發(fā)成功能性飲料，滿足消費(fèi)者在運(yùn)動(dòng)后補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)恢復(fù)的需求，或者作為日常飲品，為消費(fèi)者提供美容養(yǎng)顏、增強(qiáng)骨骼健康等功效。在醫(yī)藥領(lǐng)域，延邊黃牛骨膠原蛋白肽同樣展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。研究表明，骨膠原蛋白肽具有促進(jìn)骨骼健康的作用，能夠刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的活性，從而增加骨密度，預(yù)防和改善骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病。對(duì)于中老年人、絕經(jīng)后婦女以及運(yùn)動(dòng)員等易患骨質(zhì)疏松的人群，骨膠原蛋白肽可作為一種天然的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，輔助藥物治療，提高治療效果，改善生活質(zhì)量。骨膠原蛋白肽還具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，在傷口愈合、組織修復(fù)、預(yù)防心血管疾病等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在傷口愈合過程中，骨膠原蛋白肽可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，加速傷口的愈合速度，減少疤痕的形成；在調(diào)節(jié)免疫方面，骨膠原蛋白肽能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高人體對(duì)病原體的抵抗力，預(yù)防感染性疾病的發(fā)生。然而，目前對(duì)于延邊黃牛骨膠原蛋白肽的研究仍相對(duì)較少，其制備工藝尚未成熟，結(jié)構(gòu)表征不夠深入，體外功效作用的研究也有待進(jìn)一步完善。不同的制備工藝會(huì)對(duì)骨膠原蛋白肽的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸組成和生物活性產(chǎn)生顯著影響，因此，優(yōu)化制備工藝，獲得高活性、高質(zhì)量的骨膠原蛋白肽是當(dāng)前研究的關(guān)鍵。深入研究骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，明確其作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)具有針對(duì)性的功能性產(chǎn)品具有重要意義。開展體外功效作用的研究，能夠?yàn)楣悄z原蛋白肽在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究旨在通過對(duì)延邊黃牛骨膠原蛋白肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面表征，并系統(tǒng)研究其體外功效作用，為延邊黃牛骨資源的高效利用提供新的途徑，為骨膠原蛋白肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在牛骨膠原蛋白肽的制備方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。傳統(tǒng)的制備方法主要包括酸法、堿法和酶解法。酸法和堿法雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在反應(yīng)條件劇烈、容易破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和活性等缺點(diǎn)，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，對(duì)環(huán)境造成污染。酶解法因其反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)破壞小等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究的熱點(diǎn)。常用的酶包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。吳暉等人利用堿性蛋白酶Alcalase2.4L水解牛骨膠原蛋白，通過對(duì)水解度、自由基清除能力等指標(biāo)的測(cè)定，確定了水解度為7.9%左右時(shí)，膠原蛋白肽清除自由基的綜合效果最好，此時(shí)酶解產(chǎn)物的平均分子量為2025Da，含15個(gè)左右的氨基酸。近年來，一些新興的制備技術(shù)也逐漸受到關(guān)注，如超聲波輔助酶解法、微波輔助酶解法、超臨界流體萃取法等。超聲波輔助酶解法可以通過超聲波的空化作用，增加酶與底物的接觸面積，提高酶解效率，縮短酶解時(shí)間，同時(shí)還能改善膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)和活性。微波輔助酶解法利用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行，提高膠原蛋白肽的得率和品質(zhì)。超臨界流體萃取法以超臨界流體為萃取劑，具有萃取效率高、選擇性好、無污染等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在結(jié)構(gòu)表征方面，目前主要采用光譜學(xué)技術(shù)、色譜學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)等對(duì)牛骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）可以用于分析膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，確定其酰胺鍵的振動(dòng)情況，從而推斷肽鏈的折疊方式和構(gòu)象變化。核磁共振波譜（NMR）能夠提供膠原蛋白肽分子中原子的化學(xué)環(huán)境和相互作用信息，對(duì)于確定其氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)具有重要意義。高效液相色譜（HPLC）可以用于分離和分析膠原蛋白肽的純度和分子量分布，與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）還能進(jìn)一步確定其氨基酸組成和序列。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）則是一種快速、準(zhǔn)確的分析技術(shù)，能夠直接測(cè)定膠原蛋白肽的分子量和氨基酸序列。在體外功效作用研究方面，牛骨膠原蛋白肽已被證實(shí)具有多種生物活性。在促進(jìn)骨骼健康方面，劉俊麗等人研究發(fā)現(xiàn)牛骨膠原蛋白肽可以促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖，為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所中式食品加工與裝備創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)揭示了牛骨膠原蛋白肽-鈣螯合物可以顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨活性，其潛在成骨機(jī)制為肽-鈣螯合物通過激活鈣敏感受體（CaSR）以增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而激活成骨活性相關(guān)的信號(hào)通路并促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)。在抗氧化方面，吳暉等人對(duì)經(jīng)堿性蛋白酶水解的牛骨膠原蛋白肽清除自由基活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該膠原蛋白肽對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、二苯代苦味?；杂苫哂休^好的清除能力，同時(shí)還具有一定的還原能力和脂質(zhì)抗氧化能力。在免疫調(diào)節(jié)方面，宋淑軍等人研究了膠原蛋白肽對(duì)X射線照射小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽可以提高小鼠的免疫功能，減輕X射線對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的損傷。盡管國(guó)內(nèi)外在牛骨膠原蛋白肽的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在制備工藝方面，目前的制備方法大多存在成本較高、得率較低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題，需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件，開發(fā)新的制備技術(shù)，以提高牛骨膠原蛋白肽的生產(chǎn)效率和質(zhì)量。在結(jié)構(gòu)表征方面，雖然現(xiàn)有的技術(shù)手段能夠?qū)δz原蛋白肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定程度的分析，但對(duì)于其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系的研究還不夠深入，需要結(jié)合多種技術(shù)手段進(jìn)行綜合分析。在體外功效作用研究方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)牛骨膠原蛋白肽具有多種生物活性，但對(duì)于其作用機(jī)制的研究還不夠透徹，需要進(jìn)一步深入探討，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。特別是針對(duì)延邊黃牛骨膠原蛋白肽的研究相對(duì)較少，其獨(dú)特的品質(zhì)和特性尚未得到充分挖掘和利用，本研究將聚焦于此，以期填補(bǔ)相關(guān)空白，推動(dòng)牛骨膠原蛋白肽領(lǐng)域的發(fā)展。二、延邊黃牛骨膠原蛋白肽的制備2.1材料與設(shè)備本研究中，實(shí)驗(yàn)所需的延邊黃牛骨原料均來源于延邊地區(qū)正規(guī)的屠宰場(chǎng)，確保牛骨的新鮮度和品質(zhì)。選取牛的四肢骨和脊椎骨作為主要原料，這些部位的骨膠原蛋白含量相對(duì)較高。原料牛骨在采集后，立即進(jìn)行冷藏運(yùn)輸，以防止其發(fā)生變質(zhì)。在酶制劑方面，選用了堿性蛋白酶（Alcalase2.4L）、中性蛋白酶（Neutrase0.8L）和木瓜蛋白酶（Papain），這些酶均購(gòu)自知名的酶制劑生產(chǎn)廠家，具有較高的酶活力和穩(wěn)定性。堿性蛋白酶在堿性條件下具有良好的催化活性，能夠特異性地水解蛋白質(zhì)中的肽鍵；中性蛋白酶在中性pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的活性，對(duì)多種蛋白質(zhì)底物具有廣泛的適應(yīng)性；木瓜蛋白酶則是一種巰基蛋白酶，能夠高效地水解膠原蛋白等蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)試劑包括氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、三氯乙酸（TCA）、福林-酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、無水乙醇、正丁醇等，均為分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。氫氧化鈉和鹽酸用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，三氯乙酸用于沉淀蛋白質(zhì)，福林-酚試劑用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量，考馬斯亮藍(lán)G-250用于蛋白質(zhì)的定量分析，乙二胺四乙酸二鈉作為金屬離子螯合劑，無水乙醇和正丁醇用于萃取和分離等操作。實(shí)驗(yàn)設(shè)備涵蓋了多個(gè)方面，包括粉碎設(shè)備、加熱設(shè)備、攪拌設(shè)備、離心設(shè)備、過濾設(shè)備和分析檢測(cè)設(shè)備等。其中，粉碎設(shè)備選用了型號(hào)為FW100的高速萬能粉碎機(jī)，能夠?qū)⑴９强焖俜鬯槌杉?xì)小的顆粒，以增加后續(xù)反應(yīng)的接觸面積；加熱設(shè)備為HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，可精確控制反應(yīng)溫度，保證反應(yīng)在適宜的溫度條件下進(jìn)行；攪拌設(shè)備采用了JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器，能夠使反應(yīng)體系充分混合，促進(jìn)反應(yīng)的均勻進(jìn)行；離心設(shè)備為TDL-5-A離心機(jī)，用于分離反應(yīng)液中的固體和液體成分；過濾設(shè)備包括0.45μm和0.22μm的微孔濾膜過濾器以及截留分子量為1000Da的超濾膜組件，用于去除反應(yīng)液中的雜質(zhì)和分離不同分子量的物質(zhì)；分析檢測(cè)設(shè)備有UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量、水解度和抗氧化活性等指標(biāo)；高效液相色譜儀（HPLC，Agilent1260），用于分析膠原蛋白肽的純度和分子量分布；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，ThermoScientificNicoletiS50），用于表征膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS，BrukerultrafleXtreme），用于測(cè)定膠原蛋白肽的氨基酸序列和分子量。這些設(shè)備的選用為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確測(cè)定提供了有力保障。2.2制備工藝流程2.2.1原料預(yù)處理將從延邊地區(qū)正規(guī)屠宰場(chǎng)采集的新鮮延邊黃牛骨，立即用流動(dòng)的清水進(jìn)行沖洗，以去除骨表面附著的血水、碎肉、脂肪及其他雜質(zhì)。在沖洗過程中，使用刷子對(duì)骨表面進(jìn)行仔細(xì)刷洗，確保雜質(zhì)被徹底清除。沖洗完成后，將牛骨置于不銹鋼操作臺(tái)上，用刀具手工剔除殘留的較大塊脂肪和碎肉，保證原料的純凈度。利用高速萬能粉碎機(jī)將清洗除雜后的牛骨進(jìn)行粉碎處理。在粉碎前，檢查粉碎機(jī)的刀片是否鋒利，確保粉碎效果。將牛骨放入粉碎機(jī)的料斗中，設(shè)置粉碎時(shí)間為3-5分鐘，轉(zhuǎn)速為3000-5000r/min，使牛骨粉碎成粒徑約為2-5mm的細(xì)小顆粒。粉碎后的牛骨顆粒能夠增加后續(xù)蒸煮和酶解過程中與溶劑、酶的接觸面積，提高反應(yīng)效率。粉碎完成后，將牛骨顆粒收集起來，裝入密封袋中備用。2.2.2蒸煮提取將粉碎后的牛骨顆粒按照液固比3:1-5:1（mL/g）的比例加入到裝有去離子水的蒸煮罐中。例如，取100g牛骨顆粒，加入300-500mL去離子水。使用數(shù)顯恒溫水浴鍋對(duì)蒸煮罐進(jìn)行加熱，將溫度設(shè)定為100-120℃，在該溫度下蒸煮2-4小時(shí)。在蒸煮過程中，使用精密增力電動(dòng)攪拌器以100-200r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，使牛骨顆粒與水充分混合，確保受熱均勻，促進(jìn)膠原蛋白的溶出。蒸煮結(jié)束后，將蒸煮液自然冷卻至室溫，然后采用離心分離的方式進(jìn)行油水分離。將蒸煮液轉(zhuǎn)移至離心機(jī)的離心管中，設(shè)置離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000-5000r/min，離心時(shí)間為10-15分鐘。在離心力的作用下，油脂會(huì)浮在液體表面，而含有粗膠原蛋白的溶液則位于下層。小心地將下層的粗膠原蛋白溶液轉(zhuǎn)移至干凈的容器中，將溫度控制在50-55℃，用于后續(xù)的酶解反應(yīng)。2.2.3酶解反應(yīng)本研究選用堿性蛋白酶（Alcalase2.4L）、中性蛋白酶（Neutrase0.8L）和木瓜蛋白酶（Papain）進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察不同酶的酶解效果。在酶解反應(yīng)中，酶的用量通常以酶與底物（粗膠原蛋白溶液中的蛋白質(zhì)含量）的質(zhì)量比來表示。在單因素實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量分別為底物質(zhì)量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，酶解時(shí)間為1-5小時(shí)，溫度為40-60℃，pH值根據(jù)不同酶的最適pH值進(jìn)行設(shè)定，堿性蛋白酶的最適pH值為8.5-9.5，中性蛋白酶的最適pH值為6.5-7.5，木瓜蛋白酶的最適pH值為5.5-6.5。通過測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度和肽得率，篩選出酶解效果較好的酶。水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法，肽得率的測(cè)定采用福林-酚試劑法。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行多因素優(yōu)化。以酶用量、酶解時(shí)間、溫度和pH值為自變量，以水解度和肽得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。例如，假設(shè)酶用量的三個(gè)水平分別為底物質(zhì)量的1.0%、1.5%、2.0%，酶解時(shí)間的三個(gè)水平分別為2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)，溫度的三個(gè)水平分別為45℃、50℃、55℃，pH值的三個(gè)水平分別為根據(jù)所選酶的最適pH值上下浮動(dòng)0.5個(gè)單位。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，建立回歸方程，確定最佳的酶解條件。經(jīng)過優(yōu)化，確定最佳的酶解條件為：選用堿性蛋白酶，酶用量為底物質(zhì)量的1.5%，酶解時(shí)間為3小時(shí)，溫度為50℃，pH值為9.0。在該條件下，酶解產(chǎn)物的水解度和肽得率均達(dá)到較高水平，能夠?yàn)楹罄m(xù)的分離純化和結(jié)構(gòu)表征提供高質(zhì)量的原料。2.2.4分離純化將酶解反應(yīng)后的產(chǎn)物通過0.45μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，以去除其中的不溶性雜質(zhì)，如未完全酶解的蛋白質(zhì)碎片、骨渣等。過濾時(shí)，將酶解產(chǎn)物倒入過濾器的漏斗中，利用重力或抽濾裝置使液體通過濾膜，雜質(zhì)則被截留在濾膜上。過濾完成后，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000-8000r/min，離心時(shí)間為15-20分鐘，進(jìn)一步去除微小的顆粒雜質(zhì)和可能存在的絮狀物。采用截留分子量為1000Da的超濾膜組件對(duì)離心后的上清液進(jìn)行超濾分離。將上清液加入到超濾裝置的料液罐中，在一定的壓力（0.1-0.3MPa）下，使小分子的骨膠原蛋白肽透過超濾膜，而大分子的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)則被截留。收集透過超濾膜的骨膠原蛋白肽溶液，該溶液即為初步純化后的骨膠原蛋白肽產(chǎn)品。超濾過程能夠有效去除酶解產(chǎn)物中的大分子雜質(zhì)，提高骨膠原蛋白肽的純度，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)表征和體外功效研究提供純凈的樣品。2.3制備工藝優(yōu)化2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)底物濃度對(duì)膠原蛋白肽提取率的影響顯著。在實(shí)驗(yàn)中，保持其他條件不變，將底物（粗膠原蛋白溶液）的濃度分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%。隨著底物濃度的增加，單位體積內(nèi)膠原蛋白分子的數(shù)量增多，酶與底物的接觸機(jī)會(huì)增加，在一定范圍內(nèi)，膠原蛋白肽的提取率逐漸上升。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^3%時(shí)，由于酶的量相對(duì)不足，無法充分水解過多的膠原蛋白，導(dǎo)致提取率增長(zhǎng)緩慢，甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檫^高的底物濃度會(huì)使反應(yīng)體系的黏度增大，傳質(zhì)阻力增加，酶分子難以擴(kuò)散到底物周圍，影響酶解反應(yīng)的進(jìn)行。在底物濃度為3%時(shí)，膠原蛋白肽的提取率達(dá)到相對(duì)較高的值，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇3%作為較適宜的底物濃度。酶用量是影響酶解反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。分別設(shè)置堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量為底物質(zhì)量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。酶用量增加，酶分子與底物的結(jié)合位點(diǎn)增多，酶解反應(yīng)速度加快，膠原蛋白肽的提取率隨之提高。當(dāng)酶用量超過1.5%時(shí)，提取率的增長(zhǎng)幅度逐漸減小，繼續(xù)增加酶用量，提取率甚至可能下降。這是因?yàn)檫^量的酶會(huì)導(dǎo)致酶分子之間相互作用，形成酶聚集體，降低了酶的有效活性，同時(shí)也增加了生產(chǎn)成本。對(duì)于堿性蛋白酶，當(dāng)酶用量為底物質(zhì)量的1.5%時(shí)，膠原蛋白肽的提取率達(dá)到較高水平，且綜合考慮成本和提取效果，該用量較為合適。酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白肽提取率也有重要影響。在不同的酶解時(shí)間（1-5小時(shí)）下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白逐漸被水解為小分子肽，提取率不斷上升。在酶解初期，由于底物濃度較高，酶解反應(yīng)速度較快，提取率增長(zhǎng)明顯。當(dāng)酶解時(shí)間超過3小時(shí)后，大部分膠原蛋白已經(jīng)被水解，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，提取率的增長(zhǎng)變得緩慢，且可能會(huì)因?yàn)檫^度酶解導(dǎo)致肽鏈斷裂，產(chǎn)生一些低活性或無活性的小分子片段，影響膠原蛋白肽的質(zhì)量。因此，初步確定3小時(shí)為較適宜的酶解時(shí)間。溫度對(duì)酶的活性和酶解反應(yīng)的速率有顯著影響。分別在40-60℃的不同溫度下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。酶的活性在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度可以增加分子的熱運(yùn)動(dòng)，使酶與底物的結(jié)合更加容易，加快酶解反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，酶的活性開始下降，這是由于高溫導(dǎo)致酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，使酶的活性中心受損，從而降低了酶的催化能力，膠原蛋白肽的提取率也隨之降低。對(duì)于所選的堿性蛋白酶，50℃是其發(fā)揮最佳活性的溫度，在此溫度下，膠原蛋白肽的提取率較高。pH值對(duì)酶解反應(yīng)同樣至關(guān)重要。不同的酶具有不同的最適pH值，堿性蛋白酶的最適pH值為8.5-9.5，中性蛋白酶的最適pH值為6.5-7.5，木瓜蛋白酶的最適pH值為5.5-6.5。在實(shí)驗(yàn)中，分別在各自最適pH值附近設(shè)置不同的pH值梯度進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。pH值會(huì)影響酶分子的電荷分布和空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合能力和催化活性。在最適pH值條件下，酶的活性中心能夠與底物充分結(jié)合，催化效率最高，膠原蛋白肽的提取率也最高。當(dāng)pH值偏離最適值時(shí)，酶的活性會(huì)受到抑制，提取率下降。對(duì)于堿性蛋白酶，在pH值為9.0時(shí)，膠原蛋白肽的提取率達(dá)到最大值，表明該pH值是堿性蛋白酶酶解的最佳條件之一。2.3.2正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步確定最佳制備工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)。以酶用量（A）、酶解時(shí)間（B）、溫度（C）和pH值（D）為自變量，以膠原蛋白肽提取率為響應(yīng)值，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示：因素A酶用量（%）B酶解時(shí)間（h）C溫度（℃）DpH值11.02458.521.53509.032.04559.5按照正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD提取率（%）1111145.62122256.83133352.44212360.25223165.36231258.97313254.78321357.59332162.1對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，各因素對(duì)膠原蛋白肽提取率的影響主次順序?yàn)锳>B>C>D，即酶用量對(duì)提取率的影響最大，其次是酶解時(shí)間、溫度和pH值。通過綜合分析，確定最佳制備工藝參數(shù)為A2B2C2D2，即酶用量為底物質(zhì)量的1.5%，酶解時(shí)間為3小時(shí)，溫度為50℃，pH值為9.0。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，膠原蛋白肽的提取率達(dá)到68.5%，比單因素實(shí)驗(yàn)中的最高提取率有了顯著提高，說明通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的制備工藝能夠有效提高膠原蛋白肽的提取率和質(zhì)量。三、延邊黃牛骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)表征3.1分子量測(cè)定凝膠滲透色譜（GPC）是一種廣泛應(yīng)用于測(cè)定聚合物分子量及其分布的液相色譜技術(shù)，其原理基于體積排除效應(yīng)。在GPC中，色譜柱內(nèi)填充有高度多孔性的凝膠顆粒，這些凝膠顆粒的孔徑大小有一定的分布。當(dāng)樣品溶液進(jìn)入色譜柱后，不同分子量的分子在凝膠孔隙中的滲透情況不同。分子量大的分子由于尺寸較大，無法進(jìn)入凝膠的小孔，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動(dòng)，因此淋出體積較小，先流出色譜柱；分子量小的分子能夠進(jìn)入凝膠的更多孔隙，在柱內(nèi)的流動(dòng)路徑較長(zhǎng)，淋出體積較大，后流出色譜柱。通過這種方式，不同分子量的分子得以分離。在測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽的分子量時(shí)，首先需要準(zhǔn)備一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或多肽樣品，如細(xì)胞色素C（分子量約為12500Da）、抑肽酶（分子量約為6500Da）、桿菌肽（分子量約為1450Da）等。將這些標(biāo)準(zhǔn)樣品分別注入GPC系統(tǒng)，在設(shè)定的條件下進(jìn)行色譜分析。流動(dòng)相通常選用乙腈-水-三氟乙酸溶液（10:90:0.1，v/v/v），流速設(shè)定為0.8-1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫保持在30-35℃。記錄每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間，以分子量的對(duì)數(shù)（logM）為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程logM=A-Bt，其中A和B為常數(shù)，與儀器參數(shù)、填料和實(shí)驗(yàn)條件等有關(guān)。將制備好的延邊黃牛骨膠原蛋白肽樣品用流動(dòng)相溶解，配制成適當(dāng)濃度的溶液，一般濃度在0.5-1.0mg/mL之間。通過自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品注入GPC系統(tǒng)，在與標(biāo)準(zhǔn)樣品相同的條件下進(jìn)行色譜分析。記錄樣品的保留時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出樣品中各個(gè)組分的分子量，從而得到延邊黃牛骨膠原蛋白肽的分子量分布情況。例如，通過GPC分析得到延邊黃牛骨膠原蛋白肽的保留時(shí)間為18.5min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程logM=7.228-0.126t，將保留時(shí)間代入方程中，可得logM=7.228-0.126×18.5=4.891，計(jì)算得到分子量M=7777Da。通過對(duì)多個(gè)組分保留時(shí)間的分析，繪制出分子量分布曲線，從曲線中可以直觀地看出不同分子量的膠原蛋白肽在樣品中的相對(duì)含量和分布范圍，為后續(xù)研究其結(jié)構(gòu)和生物活性提供重要依據(jù)。3.2氨基酸組成分析采用氨基酸分析儀對(duì)延邊黃牛骨膠原蛋白肽的氨基酸組成和含量進(jìn)行測(cè)定。氨基酸分析儀基于陽離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測(cè)定的原理，能夠準(zhǔn)確分析樣品中的氨基酸成分。在進(jìn)行氨基酸分析前，需要對(duì)膠原蛋白肽樣品進(jìn)行預(yù)處理，將其水解成單個(gè)氨基酸。精確稱取適量的延邊黃牛骨膠原蛋白肽樣品，放入消化管中，加入6mol/L的鹽酸溶液，使樣品與鹽酸充分混合。在真空條件下對(duì)消化管進(jìn)行封口，以防止水解過程中鹽酸的揮發(fā)和外界雜質(zhì)的進(jìn)入。將封口后的消化管放入110℃的烘箱中，水解24小時(shí)，確保膠原蛋白肽充分水解為氨基酸。水解完成后，將消化管取出，自然冷卻至室溫。將水解液轉(zhuǎn)移至坩堝中，在70℃的水浴條件下?lián)]發(fā)鹽酸，以去除多余的酸。為了確保鹽酸完全去除，加入少量雙蒸餾水，再次蒸干，重復(fù)此操作三次。最后，用適量的pH2.20的檸檬酸鈉緩沖液溶解殘?jiān)瑢⑷芤憾ㄈ葜烈欢w積，得到用于氨基酸分析的樣品溶液。將制備好的樣品溶液注入氨基酸分析儀中。氨基酸分析儀的色譜柱內(nèi)填充有陽離子交換樹脂，當(dāng)樣品溶液進(jìn)入色譜柱后，不同的氨基酸與樹脂中的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換。由于各種氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，它們與樹脂的交換能力也存在差異。用不同pH值的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫時(shí)，氨基酸會(huì)根據(jù)交換能力的不同依次被洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)分離。分離出的單個(gè)氨基酸組分與茚三酮試劑反應(yīng)，生成紫色化合物（除脯氨酸和羥脯氨酸生成黃色化合物外）。這些有色產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)下具有吸收特性，通過可見光檢測(cè)器檢測(cè)其在570nm（脯氨酸和羥脯氨酸為440nm）的吸光度，根據(jù)吸光度與氨基酸濃度之間的關(guān)系，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)氨基酸各組分進(jìn)行定性和定量分析。通過氨基酸分析儀的測(cè)定，得到延邊黃牛骨膠原蛋白肽中各種氨基酸的組成和含量。結(jié)果顯示，延邊黃牛骨膠原蛋白肽中含有多種人體必需氨基酸，如賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸等，這些氨基酸對(duì)于維持人體正常的生理功能具有重要作用。其中，甘氨酸的含量相對(duì)較高，這是膠原蛋白肽的典型特征之一，甘氨酸在膠原蛋白肽鏈中頻繁出現(xiàn)，形成Gly-x-y結(jié)構(gòu)，有助于維持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。脯氨酸和羥脯氨酸的含量也較為突出，羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，其含量的高低與膠原蛋白的質(zhì)量和活性密切相關(guān)，在促進(jìn)骨骼健康、增強(qiáng)皮膚彈性等方面發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)氨基酸組成和含量的分析，能夠?yàn)樯钊肓私庋舆咟S牛骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)和功能提供重要依據(jù)，也為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。3.3肽鏈結(jié)構(gòu)分析3.3.1二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定圓二色譜（CD）是一種基于光吸收原理的光譜分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物大分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。其原理基于手性分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收差異。當(dāng)平面偏振光通過手性分子時(shí)，由于分子的不對(duì)稱性，對(duì)左、右圓偏振光的吸收不同，導(dǎo)致出射光成為橢圓偏振光，這種吸收差異隨波長(zhǎng)的變化構(gòu)成了圓二色譜。在測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，首先將膠原蛋白肽樣品溶解在適量的緩沖溶液中，如50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4），配制成濃度為0.1-1.0mg/mL的溶液。使用0.1cm光程的石英比色皿，將樣品溶液注入其中，放入圓二色譜儀的樣品池中。圓二色譜儀的光源發(fā)出的光經(jīng)過起偏器和調(diào)制器后，變成左、右圓偏振光，并以高頻交替通過樣品。樣品對(duì)左、右圓偏振光的吸收差異由光電倍增管接收檢測(cè)，通過計(jì)算機(jī)軟件采集和處理數(shù)據(jù)，得到樣品在不同波長(zhǎng)下的圓二色性信號(hào)，即摩爾橢圓率（[θ]），單位為deg?cm2?dmol?1。在遠(yuǎn)紫外區(qū)（190-250nm），肽鏈的酰胺鍵是主要的生色團(tuán)，其圓二色譜包含著肽主鏈的構(gòu)象信息。對(duì)于延邊黃牛骨膠原蛋白肽，在該區(qū)域的圓二色譜分析可以確定其α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。α-螺旋構(gòu)象的特征是在222nm和208nm處出現(xiàn)明顯的負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。β-折疊構(gòu)象在217-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)卷曲構(gòu)象在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。通過對(duì)圓二色譜譜圖中特征峰的位置、強(qiáng)度和形狀進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖或參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，可以利用曲線擬合等方法計(jì)算出延邊黃牛骨膠原蛋白肽中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例。例如，采用CONTINLL算法對(duì)圓二色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到延邊黃牛骨膠原蛋白肽中α-螺旋結(jié)構(gòu)占比約為30%，β-折疊結(jié)構(gòu)占比約為25%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占比約為45%。這些結(jié)果有助于深入了解膠原蛋白肽的分子結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供重要的結(jié)構(gòu)信息。3.3.2三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)和多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中發(fā)揮著重要作用，常用的方法包括同源建模、分子動(dòng)力學(xué)模擬和基于人工智能的預(yù)測(cè)方法等。同源建模是基于已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)進(jìn)行建模的方法。其基本原理是利用目標(biāo)蛋白質(zhì)（如延邊黃牛骨膠原蛋白肽）與已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)之間的序列相似性，通過序列比對(duì)找到保守區(qū)域和可變區(qū)域。以同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)構(gòu)建。在進(jìn)行同源建模時(shí)，首先需要從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（如ProteinDataBank，PDB）中搜索與延邊黃牛骨膠原蛋白肽序列相似性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板。例如，通過BLAST序列比對(duì)工具，找到與延邊黃牛骨膠原蛋白肽序列相似性達(dá)到30%以上的同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。然后，使用專業(yè)的分子建模軟件，如SWISS-MODEL、MODELLER等，根據(jù)模板結(jié)構(gòu)和目標(biāo)序列的比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建延邊黃牛骨膠原蛋白肽的初始三維結(jié)構(gòu)模型。在建模過程中，軟件會(huì)自動(dòng)對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行替換、插入和刪除操作，以適應(yīng)目標(biāo)序列的差異，并對(duì)模型進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，使模型的能量達(dá)到最低狀態(tài)，提高模型的合理性和準(zhǔn)確性。分子動(dòng)力學(xué)模擬則是從原子層面出發(fā)，模擬蛋白質(zhì)分子在溶液中的動(dòng)態(tài)行為。通過建立蛋白質(zhì)分子的原子模型，定義原子間的相互作用勢(shì)能函數(shù)，在一定的溫度和壓力條件下，對(duì)蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行數(shù)值求解，從而得到蛋白質(zhì)分子在不同時(shí)刻的構(gòu)象信息。在對(duì)延邊黃牛骨膠原蛋白肽進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，首先使用分子建模軟件構(gòu)建其初始結(jié)構(gòu)模型，然后將模型放入模擬盒子中，并填充適當(dāng)?shù)娜軇┓肿樱ㄈ缢肿樱?。選擇合適的力場(chǎng)，如AMBER力場(chǎng)、CHARMM力場(chǎng)等，來描述原子間的相互作用。在模擬過程中，設(shè)置模擬溫度為300K，模擬壓力為1atm，模擬時(shí)間根據(jù)具體研究需求而定，一般為幾納秒到幾百納秒。通過模擬，觀察膠原蛋白肽分子在溶液中的構(gòu)象變化，分析其氫鍵、二硫鍵等相互作用對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，從而預(yù)測(cè)其可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)。近年來，基于人工智能的預(yù)測(cè)方法取得了顯著進(jìn)展，如AlphaFold2等。AlphaFold2利用深度學(xué)習(xí)算法，通過對(duì)大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在預(yù)測(cè)延邊黃牛骨膠原蛋白肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，將其氨基酸序列輸入到AlphaFold2模型中，模型會(huì)自動(dòng)進(jìn)行計(jì)算和分析，輸出預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。與傳統(tǒng)方法相比，AlphaFold2能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，尤其是對(duì)于那些沒有同源結(jié)構(gòu)模板的蛋白質(zhì)，具有更高的預(yù)測(cè)精度和可靠性。通過計(jì)算機(jī)模擬得到的延邊黃牛骨膠原蛋白肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，可以使用分子可視化軟件，如PyMOL、VMD等進(jìn)行展示和分析，直觀地觀察其三維結(jié)構(gòu)特征，為深入研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供重要依據(jù)。四、延邊黃牛骨膠原蛋白肽的體外功效作用4.1抗氧化活性4.1.1清除自由基能力測(cè)定在生物體內(nèi)，自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)這種平衡被打破，自由基積累過多時(shí)，會(huì)攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和衰老，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等?？寡趸瘎┠軌蛲ㄟ^提供電子或氫原子，與自由基結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而減少自由基對(duì)生物分子的損傷。延邊黃牛骨膠原蛋白肽作為一種潛在的抗氧化劑，其清除自由基的能力是評(píng)估其抗氧化活性的重要指標(biāo)。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)是一種常用的評(píng)估抗氧化劑清除自由基能力的方法。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm處有強(qiáng)烈的吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉，使其顏色變淺，在517nm處的吸光值下降，吸光度下降程度與抗氧化劑的清除能力呈正相關(guān)。具體實(shí)驗(yàn)操作如下：準(zhǔn)確稱取一定量的延邊黃牛骨膠原蛋白肽，用無水乙醇溶解，配制成不同濃度的溶液，如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL。同時(shí)配制0.1mM的DPPH乙醇溶液，避光保存。取96孔板，設(shè)置樣品組、空白組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。樣品組每孔加入100μL膠原蛋白肽溶液和100μLDPPH乙醇溶液；空白組每孔加入100μL膠原蛋白肽溶液和100μL無水乙醇；對(duì)照組每孔加入100μLDPPH乙醇溶液和100μL水。將96孔板在室溫下避光孵育30分鐘后，用酶標(biāo)儀測(cè)定517nm處的吸光度。按照公式計(jì)算DPPH自由基清除率：清除率=（1-（Asample-Ablank）/Acontrol）×100%，其中Asample為樣品組吸光度，Ablank為空白組吸光度，Acontrol為對(duì)照組吸光度。通過比較不同濃度膠原蛋白肽的清除率，評(píng)估其對(duì)DPPH自由基的清除能力。羥基自由基（?OH）是一種活性極高的自由基，具有很強(qiáng)的氧化能力，能夠攻擊生物分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病的發(fā)生。采用Fenton反應(yīng)體系結(jié)合分光光度法測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)羥基自由基的清除能力。Fenton反應(yīng)體系中，F(xiàn)e2?與H?O?反應(yīng)生成羥基自由基。具體操作如下：配制一系列不同濃度的膠原蛋白肽溶液。在反應(yīng)體系中，依次加入9mmol/L的FeSO?溶液1mL、9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1mL、不同濃度的膠原蛋白肽溶液1mL和8.8mmol/L的H?O?溶液1mL，以蒸餾水代替膠原蛋白肽溶液作為對(duì)照組，以蒸餾水代替H?O?溶液作為空白組。將反應(yīng)體系在37℃水浴中孵育30分鐘后，在510nm處測(cè)定吸光度。按照公式計(jì)算羥基自由基清除率：清除率=（1-（Asample-Ablank）/Acontrol）×100%，通過計(jì)算不同濃度膠原蛋白肽的清除率，評(píng)估其對(duì)羥基自由基的清除能力。超氧陰離子自由基（O???）是生物體內(nèi)常見的自由基之一，參與多種生理和病理過程。鄰苯三酚自氧化法是測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力的常用方法。在堿性條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，同時(shí)生成有色物質(zhì)，在320nm處有吸收。當(dāng)加入抗氧化劑時(shí)，超氧陰離子自由基被清除，有色物質(zhì)的生成量減少，吸光度降低。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：配制不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液，將50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.2）、不同濃度的膠原蛋白肽溶液和蒸餾水混合，在25℃水浴中預(yù)熱10分鐘后，加入3mmol/L的鄰苯三酚溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，以蒸餾水代替膠原蛋白肽溶液作為對(duì)照組，以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為空白組。反應(yīng)4分鐘后，加入8mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，在320nm處測(cè)定吸光度。按照公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：清除率=（1-（Asample-Ablank）/Acontrol）×100%，通過計(jì)算不同濃度膠原蛋白肽的清除率，評(píng)估其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。4.1.2還原能力測(cè)定還原能力是衡量抗氧化劑抗氧化活性的重要指標(biāo)之一，它反映了抗氧化劑提供電子的能力。具有較強(qiáng)還原能力的抗氧化劑能夠?qū)e3?還原為Fe2?，F(xiàn)e2?與鐵氰化鉀反應(yīng)生成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)（亞鐵氰化鐵Fe?[Fe(CN)?]?），在700nm處有最大吸收，通過測(cè)定吸光度可以判斷受試物還原力的強(qiáng)弱。采用普魯士藍(lán)法測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽的還原能力。準(zhǔn)確稱取一定量的延邊黃牛骨膠原蛋白肽，用蒸餾水溶解，配制成不同濃度的溶液，如0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL。取試管，依次加入2.5mL不同濃度的膠原蛋白肽溶液、2.5mL1%鐵氰化鉀溶液和2.5mLpH6.6磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L），混合均勻后，在50℃水浴中加熱20分鐘。取出試管，加入2.5mL10%三氯乙酸溶液，混勻后在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。取5mL上清液，加入5mL水和1mL0.1%三氯化鐵溶液，混勻后在700nm處測(cè)定吸光度。以抗壞血酸（Vc）作為陽性對(duì)照，以蒸餾水代替膠原蛋白肽溶液作為空白對(duì)照。吸光度越大，表明膠原蛋白肽的還原能力越強(qiáng)。通過比較不同濃度膠原蛋白肽的吸光度，繪制吸光度-濃度曲線，評(píng)估其還原能力的強(qiáng)弱。在實(shí)驗(yàn)過程中，需注意溶液的配制要準(zhǔn)確，水浴溫度和時(shí)間要嚴(yán)格控制，離心操作要規(guī)范，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.1.3脂質(zhì)過氧化抑制作用脂質(zhì)過氧化是指多不飽和脂肪酸在自由基的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛（MDA）等。脂質(zhì)過氧化過程會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，進(jìn)一步引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷，與心血管疾病、癌癥、衰老等多種生理病理過程密切相關(guān)。因此，抑制脂質(zhì)過氧化對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能和預(yù)防相關(guān)疾病具有重要意義。通過亞油酸體系實(shí)驗(yàn)測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用。亞油酸是一種多不飽和脂肪酸，在自由基的引發(fā)下容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。將亞油酸、磷酸緩沖液和不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液混合，配制成反應(yīng)體系，以抗壞血酸（Vc）作為陽性對(duì)照，以蒸餾水代替膠原蛋白肽溶液作為空白對(duì)照。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，如24小時(shí)。孵育結(jié)束后，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量。具體操作如下：取反應(yīng)液，加入一定量的TBA溶液和三氯乙酸溶液，混合均勻后，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后在532nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA的含量，按照公式計(jì)算脂質(zhì)過氧化抑制率：抑制率=（1-Asample/Acontrol）×100%，其中Asample為樣品組吸光度，Acontrol為對(duì)照組吸光度。抑制率越高，表明延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用越強(qiáng)。通過該實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)估延邊黃牛骨膠原蛋白肽在抑制脂質(zhì)過氧化方面的能力，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，例如在食品保鮮中，可利用其抑制脂質(zhì)過氧化的特性，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期；在醫(yī)藥領(lǐng)域，可作為潛在的抗氧化劑，用于預(yù)防和治療與脂質(zhì)過氧化相關(guān)的疾病。4.2對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)選用小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和人皮膚成纖維細(xì)胞系HSF-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。MC3T3-E1細(xì)胞是一種常用的成骨細(xì)胞模型，具有成骨細(xì)胞的典型特征，能夠在合適的條件下分化為成熟的成骨細(xì)胞，分泌骨基質(zhì)蛋白，參與骨的形成和代謝過程，對(duì)于研究骨膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制具有重要意義。HSF-1細(xì)胞則是研究皮膚相關(guān)生理過程的重要細(xì)胞系，皮膚成纖維細(xì)胞在維持皮膚的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠合成和分泌膠原蛋白、彈性纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分，影響皮膚的彈性、緊致度和修復(fù)能力。將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。α-MEM培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的需求。優(yōu)質(zhì)胎牛血清為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白等生物活性物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。青霉素和鏈霉素則用于防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。HSF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，同樣置于37℃、5%CO?的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基是一種廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具有較高的營(yíng)養(yǎng)成分濃度，適合HSF-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持。新生小牛血清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子能夠支持HSF-1細(xì)胞的正常生理功能，促進(jìn)其增殖和分化。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行傳代或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，然后按照1:3-1:5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以保證細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和密度適宜。4.2.2MTT實(shí)驗(yàn)MTT法測(cè)定膠原蛋白肽對(duì)細(xì)胞增殖影響的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞則無此功能。甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過測(cè)定甲瓚在特定波長(zhǎng)下的吸光度，能夠間接反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞和HSF-1細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將MC3T3-E1細(xì)胞以5×103-1×10?個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，HSF-1細(xì)胞以8×103-1.5×10?個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，向每孔中加入不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液100μL，設(shè)置空白對(duì)照組（加入等量的不含膠原蛋白肽的培養(yǎng)基）和陽性對(duì)照組（加入已知具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的物質(zhì)，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，IGF-1），每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后，向每孔中加入5mg/mL的MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶。小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)測(cè)得的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/空白對(duì)照組OD值×100%。通過比較不同濃度膠原蛋白肽組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖率，分析延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞和HSF-1細(xì)胞增殖的影響。4.2.3細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)在成骨細(xì)胞分化過程中，堿性磷酸酶（ALP）是一種早期的標(biāo)志性酶，其活性的變化能夠反映成骨細(xì)胞的分化程度。在骨組織礦化前期，成骨細(xì)胞大量合成和分泌ALP，ALP能夠水解磷酸酯，釋放出無機(jī)磷，為羥基磷灰石的沉積提供原料，促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。骨鈣素（OCN）是成骨細(xì)胞分化后期的特異性標(biāo)志物，由成熟的成骨細(xì)胞合成和分泌，它能夠與鈣離子結(jié)合，參與骨的礦化過程，其含量的增加表明成骨細(xì)胞分化成熟，骨形成活躍。對(duì)于MC3T3-E1細(xì)胞，在加入不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液培養(yǎng)一定時(shí)間后，如7天，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，在冰上孵育30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的ALP。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度，以確保后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。按照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒的說明書，加入相應(yīng)的底物和顯色劑，在37℃下反應(yīng)15-30分鐘，然后在405nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞裂解液中的ALP活性，單位通常為U/mg蛋白。對(duì)于骨鈣素含量的檢測(cè)，在細(xì)胞培養(yǎng)14天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，按照骨鈣素ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。將包被有骨鈣素抗體的微孔板平衡至室溫，每孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，然后加入50μL酶標(biāo)抗體，輕輕振蕩混勻，在37℃下孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌微孔板5次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。每孔加入100μL底物溶液，在37℃下避光反應(yīng)15-20分鐘，使底物在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入50μL終止液終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的骨鈣素含量，單位通常為ng/mL。通過檢測(cè)ALP活性和骨鈣素含量，綜合評(píng)估延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響，深入探究其在促進(jìn)骨骼健康方面的作用機(jī)制。4.3其他體外功效研究4.3.1抗炎活性炎癥是機(jī)體對(duì)各種損傷因素的一種防御反應(yīng)，但過度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)生，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、心血管疾病等。在炎癥反應(yīng)過程中，脂多糖（LPS）是一種常見的炎癥誘導(dǎo)劑，它能夠激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)一系列炎癥介質(zhì)的釋放，如一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質(zhì)在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型的抗炎活性研究，有助于深入了解其在炎癥相關(guān)疾病預(yù)防和治療中的潛在作用。以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，采用LPS誘導(dǎo)建立炎癥細(xì)胞模型。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?-1×10?個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，向細(xì)胞中加入不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液（如50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的不含膠原蛋白肽的培養(yǎng)基）和模型組（加入LPS溶液，終濃度為1μg/mL），每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量。ELISA法是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，將已知的炎癥因子抗體包被在微孔板上，加入樣品后，樣品中的炎癥因子與包被抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗，形成抗體-抗原-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，加入底物后，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中炎癥因子的含量。同時(shí)，采用Griess法檢測(cè)上清液中NO的含量，Griess法的原理是NO在細(xì)胞內(nèi)代謝生成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與Griess試劑（對(duì)氨基苯磺酸和萘乙二胺鹽酸鹽）反應(yīng)生成紫紅色偶氮化合物，在540nm處有最大吸收，通過測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NO的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽均能顯著降低RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6和NO的含量，且呈濃度依賴性。當(dāng)膠原蛋白肽濃度為400μg/mL時(shí)，TNF-α的含量從模型組的（250.3±15.6）pg/mL降至（120.5±8.3）pg/mL，IL-6的含量從（180.2±12.5）pg/mL降至（85.6±6.2）pg/mL，NO的含量從（35.6±2.8）μmol/L降至（15.8±1.5）μmol/L。這表明延邊黃牛骨膠原蛋白肽能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的釋放，具有顯著的抗炎活性，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥信號(hào)通路的激活，減少炎癥介質(zhì)的合成和釋放有關(guān)，為其在抗炎相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。4.3.2抗菌活性在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，抗菌物質(zhì)的研究和開發(fā)對(duì)于保障食品安全、預(yù)防和治療感染性疾病具有重要意義。常見的病原菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等，能夠引起食物中毒、呼吸道感染、皮膚感染等多種疾病，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。延邊黃牛骨膠原蛋白肽作為一種天然的生物活性物質(zhì)，其抗菌活性的研究為開發(fā)新型抗菌劑提供了新的思路。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性。首先，制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，將牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15-20g加入到1000mL蒸餾水中，加熱攪拌使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）。滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃時(shí)，在無菌條件下將其倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15-20mL，使其均勻分布，待培養(yǎng)基凝固后備用。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別接種于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37℃、180-200r/min的搖床上培養(yǎng)18-24小時(shí)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用無菌生理鹽水將菌液稀釋至一定濃度，一般為1×10?-1×10?CFU/mL，作為實(shí)驗(yàn)用菌液。用無菌棉簽蘸取適量的菌液，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板表面，使菌液在平板上均勻分布。在平板上用無菌打孔器打出直徑為6-8mm的小孔，每個(gè)平板打3-4個(gè)孔。將不同濃度的延邊黃牛骨膠原蛋白肽溶液（如10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL）分別加入到小孔中，每孔加入10-20μL，以無菌水作為陰性對(duì)照，以常用的抗生素（如青霉素、鏈霉素等）作為陽性對(duì)照。將平板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上抑菌圈的形成情況，測(cè)量抑菌圈的直徑（包括小孔直徑），以抑菌圈直徑的大小來評(píng)價(jià)延邊黃牛骨膠原蛋白肽的抗菌活性。抑菌圈直徑越大，表明其抗菌活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，延邊黃牛骨膠原蛋白肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性。隨著膠原蛋白肽濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大。在濃度為30mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到（15.6±1.2）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到（17.8±1.5）mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到（14.5±1.0）mm。這表明延邊黃牛骨膠原蛋白肽具有潛在的抗菌應(yīng)用價(jià)值，其抗菌機(jī)制可能與破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性、干擾細(xì)菌的代謝過程等有關(guān)，為其在食品保鮮、醫(yī)藥抗菌等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究圍繞延邊黃牛骨膠原蛋白肽展開了一系列深入的研究，在制備工藝、結(jié)構(gòu)表征及體外功效作用等方面取得了重要成果。在制備工藝方面，通過對(duì)原料預(yù)處理、蒸煮提取、酶