慢性間歇性缺氧下大鼠腦缺血再灌注中IGF-1與HSP70表達(dá)機(jī)制及關(guān)聯(lián)研究一、引言1.1研究背景與意義腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，其中缺血性腦血管病占絕大部分。腦缺血是指腦局部供血不足或中斷引起的腦局灶性功能障礙，臨床表現(xiàn)為短暫性或持久性的神經(jīng)功能缺損癥狀，其損害程度與缺血時(shí)間長(zhǎng)短及殘存血流量多少有關(guān)，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長(zhǎng)時(shí)間的完全缺血或嚴(yán)重缺血會(huì)引起梗死。腦缺血再灌注損傷是指各種原因造成的組織血液灌注量減少使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，在恢復(fù)血液再灌注后，部分細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象，這種損傷對(duì)腦的影響很大，最明顯的變化是神經(jīng)元損傷和腦水腫。慢性間歇性缺氧（CIH）是一種常見(jiàn)的病理狀態(tài)，如阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）患者就存在典型的慢性間歇性缺氧情況。OSAS在成年人中的患病率較高，且與多種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。長(zhǎng)期的慢性間歇性缺氧可導(dǎo)致機(jī)體多系統(tǒng)功能紊亂，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤為顯著，它可使腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損，血液流變學(xué)改變，從而增加腦缺血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，再灌注過(guò)程雖然旨在恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng)，但卻可能引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦組織損傷。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是一種在體內(nèi)廣泛存在的生長(zhǎng)因子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和存活具有重要調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，IGF-1參與了神經(jīng)元的發(fā)育、存活和修復(fù)過(guò)程。研究表明，IGF-1在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用，它可以通過(guò)多種途徑減輕腦組織損傷，如抑制細(xì)胞凋亡、減少氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等。熱休克蛋白70（HSP70）是一種應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激時(shí)表達(dá)上調(diào)。在腦缺血再灌注損傷中，HSP70的表達(dá)增加被認(rèn)為是一種細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，它可以幫助維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性。目前，雖然對(duì)于腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍存在許多未知領(lǐng)域。慢性間歇性缺氧如何影響腦缺血再灌注損傷的進(jìn)程以及IGF-1和HSP70在這一過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。深入研究IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)變化，有助于進(jìn)一步揭示腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善腦血管疾病患者的預(yù)后具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于IGF-1和HSP70在腦缺血再灌注損傷中的研究開(kāi)展較早且較為深入。眾多研究表明，IGF-1作為一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽，在腦缺血再灌注損傷中扮演著神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵角色。例如，有研究通過(guò)對(duì)小鼠腦缺血再灌注模型的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外源性給予IGF-1能夠顯著減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。進(jìn)一步的機(jī)制研究揭示，IGF-1可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減少神經(jīng)元的凋亡。此外，IGF-1還能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，減輕腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，保護(hù)血腦屏障的完整性。對(duì)于HSP70，國(guó)外學(xué)者同樣進(jìn)行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注過(guò)程中，HSP70的表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)，這是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺血缺氧應(yīng)激的一種重要保護(hù)機(jī)制。利用基因敲除技術(shù)，敲除HSP70基因的小鼠在腦缺血再灌注后，神經(jīng)元損傷明顯加重，腦梗死面積增大，神經(jīng)功能恢復(fù)也受到顯著影響。深入研究表明，HSP70可以與變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助其恢復(fù)正確的構(gòu)象，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，HSP70還能夠抑制炎癥小體的激活，減少炎癥因子的釋放，從而減輕腦缺血再灌注損傷。在國(guó)內(nèi)，隨著對(duì)腦血管疾病研究的重視，關(guān)于IGF-1和HSP70在腦缺血再灌注損傷中的研究也取得了豐碩的成果。有研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，探討了IGF-1對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果顯示，IGF-1預(yù)處理能夠提高缺血腦組織中抗氧化酶的活性，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平，減輕氧化損傷。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，IGF-1可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)神經(jīng)再生能力，有助于改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能恢復(fù)。在HSP70的研究方面，國(guó)內(nèi)研究表明，低氧預(yù)適應(yīng)可以誘導(dǎo)HSP70的高表達(dá)，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可以通過(guò)與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，HSP70能夠與Bax蛋白結(jié)合，阻止其向線粒體的轉(zhuǎn)位，從而抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者還關(guān)注到HSP70在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)時(shí)相變化，為臨床治療提供了時(shí)間窗的參考依據(jù)。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧背景下的腦缺血再灌注損傷中的研究仍存在一定的局限性。一方面，雖然已知慢性間歇性缺氧會(huì)加重腦缺血再灌注損傷，但對(duì)于IGF-1和HSP70在這一復(fù)雜病理過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及相互作用機(jī)制研究較少。慢性間歇性缺氧如何影響IGF-1和HSP70的表達(dá)調(diào)控，以及它們之間是否存在協(xié)同或拮抗作用，目前尚未完全明確。另一方面，現(xiàn)有的研究大多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，將這些研究成果轉(zhuǎn)化為臨床治療手段還面臨諸多挑戰(zhàn)，如如何安全有效地將IGF-1應(yīng)用于臨床治療，以及如何誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP70的表達(dá)而不產(chǎn)生不良反應(yīng)等問(wèn)題，都有待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過(guò)建立慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注模型，深入探究IGF-1和HSP70在該模型中的表達(dá)規(guī)律、作用及關(guān)聯(lián)，為揭示腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，具體研究目的如下：明確慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷程度的影響，包括神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積等指標(biāo)的變化，從而進(jìn)一步闡述慢性間歇性缺氧在腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中的作用。觀察IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，分析其表達(dá)的動(dòng)態(tài)規(guī)律，探討它們?cè)谀X缺血再灌注損傷不同階段所發(fā)揮的作用。研究IGF-1和HSP70之間是否存在相互作用，以及這種相互作用對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響機(jī)制，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論支持。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究視角創(chuàng)新：目前針對(duì)IGF-1和HSP70在腦缺血再灌注損傷中的研究多集中在單純腦缺血再灌注模型，而本研究將慢性間歇性缺氧這一常見(jiàn)病理狀態(tài)與腦缺血再灌注損傷相結(jié)合，探討在更貼近臨床實(shí)際的復(fù)雜病理?xiàng)l件下IGF-1和HSP70的表達(dá)及作用機(jī)制，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面研究的不足。多指標(biāo)聯(lián)合研究：本研究不僅分別觀察IGF-1和HSP70各自的表達(dá)變化，還深入探究?jī)烧咧g的相互關(guān)系及其對(duì)腦缺血再灌注損傷的綜合影響，通過(guò)多指標(biāo)聯(lián)合分析，更全面、深入地揭示腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更具針對(duì)性的理論指導(dǎo)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1慢性間歇性缺氧概述慢性間歇性缺氧（ChronicIntermittentHypoxia，CIH）指機(jī)體在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)經(jīng)歷缺氧與復(fù)氧的交替過(guò)程。這種缺氧模式并非持續(xù)的低氧狀態(tài)，而是呈現(xiàn)出間歇性的特點(diǎn)，其產(chǎn)生原因在生理和病理狀態(tài)下各有不同。在生理層面，如高海拔地區(qū)的人群，由于環(huán)境氣壓降低，空氣中氧氣含量相對(duì)減少，人體吸入的氧氣量不足，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體間歇性地處于缺氧狀態(tài)。隨著海拔高度的上升，氧氣分壓逐漸降低，缺氧情況會(huì)愈發(fā)嚴(yán)重。當(dāng)人們從低海拔地區(qū)快速進(jìn)入高海拔地區(qū)時(shí)，身體需要一段時(shí)間來(lái)適應(yīng)這種缺氧環(huán)境，在適應(yīng)過(guò)程中，就會(huì)反復(fù)出現(xiàn)慢性間歇性缺氧的情況。在病理方面，阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）是導(dǎo)致慢性間歇性缺氧的常見(jiàn)疾病之一。在OSAS患者睡眠過(guò)程中，上氣道會(huì)反復(fù)發(fā)生阻塞，導(dǎo)致呼吸暫?；蛲獠蛔?。每次呼吸暫停時(shí)，機(jī)體無(wú)法正常吸入氧氣，從而進(jìn)入缺氧狀態(tài)；而在呼吸恢復(fù)后，又會(huì)經(jīng)歷復(fù)氧過(guò)程。這種睡眠期間的呼吸異常頻繁發(fā)生，使得患者長(zhǎng)期處于慢性間歇性缺氧的病理狀態(tài)。此外，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者由于氣道阻塞、通氣功能障礙，也可能出現(xiàn)慢性間歇性缺氧的情況。COPD患者的肺部病變導(dǎo)致氣體交換受阻，在疾病的發(fā)展過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)不同程度的缺氧，且這種缺氧往往不是持續(xù)穩(wěn)定的，而是隨著病情的波動(dòng)以及患者的活動(dòng)狀態(tài)等因素呈現(xiàn)間歇性變化。慢性間歇性缺氧對(duì)機(jī)體的影響廣泛而復(fù)雜，涉及多個(gè)系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)方面，慢性間歇性缺氧可使交感神經(jīng)興奮，釋放去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致心率加快、血壓升高。長(zhǎng)期的慢性間歇性缺氧還會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，OSAS患者由于存在慢性間歇性缺氧，其患高血壓、冠心病、心律失常等心血管疾病的概率明顯高于正常人。在呼吸系統(tǒng)，慢性間歇性缺氧會(huì)刺激呼吸中樞，使呼吸頻率和深度發(fā)生改變。長(zhǎng)期缺氧還會(huì)導(dǎo)致肺血管收縮，肺動(dòng)脈壓力升高，進(jìn)而引發(fā)肺心病。此外，慢性間歇性缺氧還會(huì)影響機(jī)體的代謝功能，導(dǎo)致胰島素抵抗增加，血糖、血脂代謝紊亂。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，慢性間歇性缺氧可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、記憶力減退、注意力不集中等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。慢性間歇性缺氧與多種常見(jiàn)疾病密切相關(guān)。除了上述提到的OSAS、COPD以及心血管疾病外，它還與糖尿病、肥胖癥等疾病存在關(guān)聯(lián)。在糖尿病患者中，慢性間歇性缺氧可能通過(guò)影響胰島素的分泌和作用，加重胰島素抵抗，從而影響血糖的控制。對(duì)于肥胖癥患者，肥胖導(dǎo)致的上氣道狹窄以及睡眠時(shí)呼吸模式的改變，容易引發(fā)OSAS，進(jìn)而導(dǎo)致慢性間歇性缺氧，而慢性間歇性缺氧又會(huì)進(jìn)一步影響脂肪代謝和能量平衡，形成惡性循環(huán)。此外，慢性間歇性缺氧還與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、阿爾茨海默病等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在腦卒中患者中，慢性間歇性缺氧會(huì)加重腦缺血損傷，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。在阿爾茨海默病患者中，慢性間歇性缺氧可能通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝、促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)等機(jī)制，加速病情的進(jìn)展。2.2腦缺血再灌注損傷機(jī)制腦缺血再灌注損傷是一個(gè)極為復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)和多種因素的相互作用，其損傷機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：能量代謝障礙：在正常生理狀態(tài)下，大腦的能量供應(yīng)主要依賴于葡萄糖的有氧氧化。當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，血液供應(yīng)中斷，氧氣和葡萄糖無(wú)法及時(shí)輸送到腦組織，導(dǎo)致有氧氧化受阻，細(xì)胞內(nèi)ATP生成急劇減少。為了維持細(xì)胞的基本功能，細(xì)胞會(huì)進(jìn)行無(wú)氧糖酵解，然而無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生的ATP量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有氧氧化，且會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸中毒。細(xì)胞內(nèi)酸中毒會(huì)影響多種酶的活性，破壞細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。當(dāng)缺血時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的能量?jī)?chǔ)備耗盡，細(xì)胞膜上的離子泵功能受損，如鈉鉀泵、鈣泵等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子大量積聚，細(xì)胞發(fā)生水腫和壞死。興奮性氨基酸毒性：興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在腦缺血再灌注損傷中，谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）等興奮性氨基酸大量釋放，在細(xì)胞外間隙積聚。過(guò)量的興奮性氨基酸與突觸后神經(jīng)元上的相應(yīng)受體過(guò)度結(jié)合，引發(fā)一系列病理生理反應(yīng)。其中，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體是谷氨酸的主要受體亞型。當(dāng)谷氨酸與NMDA受體結(jié)合后，會(huì)使受體通道開(kāi)放，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載會(huì)激活多種酶，如蛋白酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶等，這些酶會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。此外，興奮性氨基酸還可以通過(guò)激活A(yù)MPA受體，引起鈉離子內(nèi)流和鉀離子外流，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。自由基損傷：自由基是一類外層電子軌道上存在單個(gè)不配對(duì)電子的化學(xué)物質(zhì)，具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性。在腦缺血再灌注過(guò)程中，自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致自由基大量積聚。缺血期，由于組織缺氧，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，使氧分子接受單電子還原生成超氧陰離子自由基（O_2^-）。再灌注時(shí)，恢復(fù)的血液供應(yīng)帶來(lái)大量氧氣，在黃嘌呤氧化酶等酶的作用下，產(chǎn)生更多的自由基，如羥自由基（?OH）和過(guò)氧化氫（H_2O_2）等。自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能破壞，通透性增加。脂質(zhì)過(guò)氧化還會(huì)產(chǎn)生一系列的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，如丙二醛（MDA）等，這些產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞。此外，自由基還可以攻擊蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶活性喪失以及DNA斷裂等，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能。炎癥反應(yīng)：腦缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放進(jìn)一步加重了腦組織損傷。缺血再灌注后，受損的腦組織會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質(zhì)會(huì)趨化和激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，使其聚集在缺血腦組織周?chē)?。炎癥細(xì)胞在局部釋放大量的蛋白水解酶、氧自由基等有害物質(zhì)，直接損傷神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。同時(shí)，炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞，使血漿中的蛋白質(zhì)和水分滲出到腦組織間隙，加重腦水腫。此外，炎癥因子還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，在腦缺血再灌注損傷中，細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要原因之一。缺血再灌注損傷會(huì)激活多種細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，其中線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。腦缺血再灌注后，線粒體膜電位下降，通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP等結(jié)合，形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，死亡受體途徑也參與了腦缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡過(guò)程。死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體-1（TNFR-1）等與相應(yīng)的配體結(jié)合后，會(huì)激活死亡結(jié)構(gòu)域，招募并激活Caspase-8，進(jìn)而激活Caspase-3等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。2.3IGF-1和HSP70的生物學(xué)特性胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的單鏈多肽，由70個(gè)氨基酸組成，分子量約為7.6kDa。其分子結(jié)構(gòu)包含A、B、C、D四個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中A和B結(jié)構(gòu)域與胰島素原的結(jié)構(gòu)相似，是IGF-1與受體結(jié)合并發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)域。IGF-1主要由肝臟合成和分泌，在生長(zhǎng)激素的刺激下，肝臟細(xì)胞合成IGF-1并釋放到血液循環(huán)中。除肝臟外，腎臟、骨骼肌、脂肪組織、神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織和細(xì)胞也能合成IGF-1，這些局部產(chǎn)生的IGF-1主要以旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮作用。IGF-1的生物學(xué)功能十分廣泛，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，它是促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)的重要因子。IGF-1可以刺激軟骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和鈣化，從而對(duì)骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育起著關(guān)鍵作用。在兒童和青少年時(shí)期，IGF-1水平的高低直接影響身高的增長(zhǎng)。研究表明，生長(zhǎng)激素缺乏導(dǎo)致的矮小癥患者，其體內(nèi)IGF-1水平明顯降低，補(bǔ)充生長(zhǎng)激素后，IGF-1水平升高，身高也會(huì)相應(yīng)增長(zhǎng)。在細(xì)胞水平，IGF-1對(duì)多種細(xì)胞具有促增殖和抗凋亡作用。它可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元等細(xì)胞的增殖，通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。此外，IGF-1還參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，它可以促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平；促進(jìn)脂肪的合成和儲(chǔ)存，抑制脂肪分解；促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，增加肌肉質(zhì)量。熱休克蛋白70（HSP70）是熱休克蛋白家族中最重要的成員之一，分子量約為70kDa。HSP70家族包含多個(gè)成員，根據(jù)其表達(dá)特性和細(xì)胞定位的不同，可分為組成型表達(dá)的HSC70和誘導(dǎo)型表達(dá)的HSP70。HSP70由兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，即N端的ATP酶結(jié)構(gòu)域和C端的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ATP酶結(jié)構(gòu)域具有ATP水解活性，能夠結(jié)合和水解ATP，為HSP70的功能發(fā)揮提供能量。底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域則可以識(shí)別并結(jié)合變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，幫助其恢復(fù)正確的構(gòu)象。在正常生理?xiàng)l件下，HSP70在細(xì)胞內(nèi)呈低水平表達(dá)，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如高溫、缺氧、缺血、氧化應(yīng)激、重金屬中毒等時(shí)，HSP70的表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)，數(shù)分鐘內(nèi)即可達(dá)到最高水平。此時(shí)，HSP70會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器中，發(fā)揮其保護(hù)細(xì)胞的作用。HSP70在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。作為分子伴侶，HSP70可以與新合成的多肽鏈結(jié)合，幫助其正確折疊，防止蛋白質(zhì)聚集和錯(cuò)誤折疊。在應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性和錯(cuò)誤折疊，HSP70能夠及時(shí)識(shí)別并結(jié)合這些異常蛋白質(zhì)，通過(guò)消耗ATP提供能量，促使它們重新折疊成正確的構(gòu)象，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正常功能。HSP70還可以抑制細(xì)胞凋亡，它可以與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，阻斷凋亡信號(hào)通路的激活。例如，HSP70能夠與Bax蛋白結(jié)合，阻止其向線粒體的轉(zhuǎn)位，從而抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。此外，HSP70還參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，它可以作為一種內(nèi)源性抗原，被抗原呈遞細(xì)胞攝取和加工，激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。同時(shí)，HSP70還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥損傷。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性SD大鼠，體重在250-300g之間。選擇SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要是因?yàn)镾D大鼠具有生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、性情溫順、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)。在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，SD大鼠的腦血管解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類有一定的相似性，能夠較好地模擬人類腦缺血再灌注損傷的病理過(guò)程，且其基因背景相對(duì)清晰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的重復(fù)性和可靠性，便于進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照組（NC組）：該組大鼠在正常環(huán)境中飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何缺氧及腦缺血再灌注處理，作為實(shí)驗(yàn)的正常對(duì)照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確實(shí)驗(yàn)因素對(duì)大鼠的影響。慢性間歇性缺氧組（CIH組）：此組大鼠僅接受慢性間歇性缺氧處理，不進(jìn)行腦缺血再灌注操作。通過(guò)將大鼠置于特殊的缺氧艙內(nèi)，模擬慢性間歇性缺氧環(huán)境，觀察慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠生理狀態(tài)、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)等方面的單獨(dú)影響。腦缺血再灌注組（I/R組）：該組大鼠給予單純的腦缺血再灌注損傷處理，不經(jīng)歷慢性間歇性缺氧過(guò)程。采用經(jīng)典的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，造成局部腦缺血，在缺血一定時(shí)間后回撤線栓，實(shí)現(xiàn)缺血區(qū)的再灌注。以此探究在沒(méi)有慢性間歇性缺氧影響下，腦缺血再灌注損傷對(duì)大鼠的作用機(jī)制及相關(guān)指標(biāo)變化。慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）：這組大鼠先進(jìn)行慢性間歇性缺氧處理，然后再給予腦缺血再灌注損傷。先將大鼠置于缺氧艙內(nèi)進(jìn)行一段時(shí)間的慢性間歇性缺氧，使其機(jī)體處于慢性間歇性缺氧的病理狀態(tài)，之后采用與I/R組相同的線栓法制備MCAO模型，觀察在慢性間歇性缺氧的基礎(chǔ)上，腦缺血再灌注損傷對(duì)大鼠的影響是否發(fā)生改變，以及IGF-1和HSP70在這一復(fù)雜病理過(guò)程中的表達(dá)變化和作用機(jī)制。通過(guò)這樣的分組設(shè)計(jì)，能夠系統(tǒng)地研究慢性間歇性缺氧、腦缺血再灌注以及兩者共同作用對(duì)大鼠的影響，同時(shí)可以分析IGF-1和HSP70在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)變化，為深入探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制提供全面的數(shù)據(jù)支持。3.2慢性間歇性缺氧大鼠模型構(gòu)建采用間歇吸入低氧氣體模型來(lái)構(gòu)建慢性間歇性缺氧大鼠模型。該方法是目前制備慢性間歇性缺氧模型最常用的方法，其原理是通過(guò)周期性地改變實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)的氧濃度，模擬機(jī)體在病理狀態(tài)下反復(fù)經(jīng)歷的缺氧與復(fù)氧過(guò)程。具體構(gòu)建過(guò)程如下：實(shí)驗(yàn)設(shè)備準(zhǔn)備：選用專門(mén)的間歇低氧實(shí)驗(yàn)艙，艙壁設(shè)有通氣孔，以保證艙內(nèi)氣壓相對(duì)穩(wěn)定，避免因氣壓變化對(duì)大鼠造成額外的應(yīng)激影響。配備自動(dòng)控制系統(tǒng)，用于精確控制向艙內(nèi)充入低氧混合氣體或純氮?dú)庖约凹冄趸驂嚎s空氣的時(shí)間和流量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)艙內(nèi)氧濃度的精準(zhǔn)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)艙需具備良好的密封性，防止氣體泄漏，影響氧濃度的穩(wěn)定性。同時(shí)，要確保艙內(nèi)溫度維持在22-24℃，濕度保持在40-50%，這是大鼠適宜生存的環(huán)境條件，可減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。CO?濃度需控制在通常＜0.03%，避免過(guò)高的CO?濃度對(duì)大鼠的生理功能產(chǎn)生不良影響。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)：在進(jìn)行慢性間歇性缺氧處理前，先將大鼠置于對(duì)照艙間歇給予空氣3天左右。這一過(guò)程旨在讓大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)的環(huán)境，包括艙內(nèi)的空間大小、溫度、濕度等條件，減少因環(huán)境改變帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)，避免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，給予大鼠常規(guī)飼料及飲用水，保證其正常的生長(zhǎng)和生理需求。缺氧處理：當(dāng)大鼠適應(yīng)環(huán)境后，開(kāi)始進(jìn)行慢性間歇性缺氧處理。利用自動(dòng)控制系統(tǒng)，周期性地向艙內(nèi)充入低氧混合氣體或純氮?dú)?，使艙?nèi)氧濃度降至一定程度，模擬機(jī)體的缺氧狀態(tài)。例如，每次充入低氧混合氣體或純氮?dú)?，使艙?nèi)氧濃度在30秒內(nèi)迅速降至6%-8%，并維持60秒。隨后，給予純氧或壓縮空氣，使艙內(nèi)氧濃度在30秒內(nèi)恢復(fù)至21%，并維持120秒。如此循環(huán)，每3分鐘為一個(gè)缺氧-復(fù)氧周期，每天持續(xù)進(jìn)行8-12小時(shí)，連續(xù)處理3-4周。通過(guò)這種方式，使大鼠反復(fù)經(jīng)歷缺氧與復(fù)氧的交替過(guò)程，模擬慢性間歇性缺氧的病理狀態(tài)。在構(gòu)建慢性間歇性缺氧大鼠模型的過(guò)程中，有以下注意事項(xiàng)：氧濃度監(jiān)測(cè)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要持續(xù)使用高精度的氧濃度監(jiān)測(cè)儀對(duì)艙內(nèi)氧濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，確保氧濃度的變化符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。同時(shí)，要定期對(duì)氧濃度監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行校準(zhǔn)，保證監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。避免出現(xiàn)氧濃度過(guò)低導(dǎo)致大鼠急性死亡，或氧濃度不能恢復(fù)正常水平造成持續(xù)低氧而非間歇低氧的情況。大鼠健康狀況觀察：每天密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)量等情況，記錄大鼠的體重變化。若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、呼吸困難等，應(yīng)及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)措施。對(duì)于因缺氧等原因?qū)е滤劳龅拇笫?，要及時(shí)記錄并補(bǔ)充新的大鼠，以保證每組實(shí)驗(yàn)大鼠的數(shù)量和質(zhì)量。避免交叉感染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)艙、飼養(yǎng)籠具等進(jìn)行清潔和消毒，防止微生物感染對(duì)大鼠健康和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。不同組別的大鼠要分開(kāi)飼養(yǎng)，避免交叉感染。3.3腦缺血再灌注模型制備本研究采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型。線栓法是目前制備局灶性腦缺血再灌注模型最常用的方法之一，具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好地模擬人類腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。具體操作步驟如下：術(shù)前準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前12h，對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理，但需保證其自由飲水，以避免手術(shù)過(guò)程中因食物反流導(dǎo)致窒息，同時(shí)維持大鼠的生理狀態(tài)穩(wěn)定。將手術(shù)所需的器械盤(pán)、3.6％水合氯醛、一次性5ml注射器、尼龍魚(yú)線（直徑0.26mm，按要求制好備用）、備皮剪、小雜物盤(pán)、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎鑷、止血鉗、持針器、玻璃分針、手術(shù)縫針、0號(hào)手術(shù)線、無(wú)菌棉簽、碘伏、生理鹽水等進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，確保手術(shù)過(guò)程的無(wú)菌環(huán)境。動(dòng)物麻醉：以3.6％水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，注射劑量為10ml/kg。注射時(shí)，將注射器針頭從腹部向頭方向刺入腹腔，回抽針芯，若阻力較大且無(wú)回血、無(wú)胃腸道內(nèi)容物時(shí)，緩慢推注麻醉藥物。約10min后，大鼠逐漸癱軟，反應(yīng)淡漠，用手牽拉鼠尾無(wú)明顯反抗時(shí)，將其置仰臥位，固定上頜中切牙和四肢，準(zhǔn)備進(jìn)行手術(shù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用恒溫加熱板維持大鼠肛溫在37℃左右，以避免因體溫過(guò)低影響大鼠的生理功能和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。手術(shù)操作：手術(shù)按照嚴(yán)格的外科無(wú)菌原則進(jìn)行。首先，用備皮剪對(duì)大鼠頸部右側(cè)正中線旁開(kāi)約5mm處進(jìn)行備皮，然后用碘伏消毒皮膚。使用眼科直剪在該部位行頸部右側(cè)縱行切口，剪開(kāi)淺筋膜，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌。在胸鎖乳突肌與頸前肌群之間向深部鈍性分離，暴露出頸動(dòng)脈鞘，再用玻璃分針小心游離頸總動(dòng)脈（CCA）和迷走神經(jīng)，直至CCA分叉處。繼續(xù)鈍性分離向內(nèi)行走的頸外動(dòng)脈（ECA）及向外后行走的頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。接著，分別在CCA、ECA、ICA下方穿線，結(jié)扎CCA近心端、頸外動(dòng)脈近分叉部。在CCA上距其末端約5.0mm處，用眼科剪以約60°角剪一小口，剪口大小以不超過(guò)CCA壁上1/4為宜，既保證入線順暢，又防止血管斷裂。將預(yù)先制備好的線栓（選用直徑為0.26mm的釣魚(yú)線，用鋒利薄刀片將線身垂直截成5cm長(zhǎng)的小段，用細(xì)砂紙打磨頭端棱角，在體視鏡下選出頭端光滑鈍圓、大小一致者。用記號(hào)筆在距線栓頭端20mm處做一標(biāo)記，將線栓浸泡消毒后晾干。術(shù)前置于無(wú)菌生理鹽水中備用，線栓臨用前浸蘸2.5×1000000U/L肝素鈉，以減少阻塞期間動(dòng)脈血栓的形成）沿ICA方向連續(xù)輕柔推進(jìn)，插入深度約為(18.0±0.5)mm，當(dāng)遇到輕微阻力時(shí)即停止，此時(shí)線栓已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端。然后于ICA近心端結(jié)扎該動(dòng)脈，全層縫合切口，并留置長(zhǎng)約3cm的尼龍線于體外，便于后續(xù)的再灌注操作，最后用碘伏消毒手術(shù)區(qū)。再灌注操作：缺血1h后，小心拔出阻塞線約10min，實(shí)現(xiàn)缺血區(qū)的再灌注。在回撤線栓時(shí)，動(dòng)作一定要輕柔，避免因動(dòng)作過(guò)猛導(dǎo)致血管破裂出血，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。假手術(shù)組大鼠的操作與實(shí)驗(yàn)組基本相同，但插線深度小于10mm，且不結(jié)扎CCA與ECA，其余處理不變，用于排除手術(shù)操作本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。腦缺血再灌注模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：腦血流監(jiān)測(cè)：手術(shù)前，將激光多普勒探頭置于右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血皮質(zhì)區(qū)域（前囟點(diǎn)向后2mm，正中縫側(cè)方3-4mm），測(cè)得的腦血流相對(duì)灌注單位設(shè)為基線值100%。缺血操作完成后，若激光多普勒探頭測(cè)定腦血流相對(duì)灌注單位小于20%基線值，則視為缺血成功。缺血120min后拉出栓線尾端恢復(fù)灌注，當(dāng)激光多普勒探頭測(cè)定腦血流灌注恢復(fù)至50%以上時(shí)，視為再灌注成功。神經(jīng)功能缺損評(píng)分：動(dòng)物蘇醒后約1h，采用Longa5分制神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，大鼠活動(dòng)正常；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，提尾懸空時(shí)，可見(jiàn)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向患側(cè)傾斜；3分，行走時(shí)嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，無(wú)法正常直線行走；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。得分在1-3分的大鼠視為手術(shù)成功，納入實(shí)驗(yàn)研究；0分和4分的大鼠予以淘汰，另選大鼠補(bǔ)充。通過(guò)以上嚴(yán)格的模型制備方法和成功判斷標(biāo)準(zhǔn)，確保了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃院头€(wěn)定性，為后續(xù)研究IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)及作用機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.4IGF-1和HSP70表達(dá)檢測(cè)方法3.4.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，DNA聚合酶以dNTP為原料，在引物的引導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就會(huì)有一個(gè)熒光基團(tuán)與之結(jié)合，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，可以實(shí)時(shí)反映PCR擴(kuò)增的進(jìn)程，從而對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。操作流程：在大鼠腦缺血再灌注后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，迅速斷頭取腦，分離出缺血半暗帶組織。使用Trizol試劑提取組織總RNA，Trizol試劑能夠迅速破碎細(xì)胞，裂解細(xì)胞中的核酸蛋白復(fù)合物，使RNA釋放出來(lái)，并保持其完整性。提取的RNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。一般要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。然后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成與RNA互補(bǔ)的cDNA鏈。最后，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中IGF-1和HSP70的基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)需要遵循一定的原則，如引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，引物的Tm值在55-65℃之間，引物之間不能形成二聚體等。引物由專業(yè)的生物公司合成。在qRT-PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。在反應(yīng)過(guò)程中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，得到Ct值（Cyclethreshold），即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與模板的起始拷貝數(shù)成反比，通過(guò)與內(nèi)參基因（如β-actin）的Ct值進(jìn)行比較，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算IGF-1和HSP70mRNA的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)分析不同組間IGF-1和HSP70mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，探討慢性間歇性缺氧及腦缺血再灌注對(duì)其表達(dá)的影響。3.4.2蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)蛋白表達(dá)原理：蛋白質(zhì)免疫印跡法是將蛋白質(zhì)樣品通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，用特異性抗體與膜上的目的蛋白結(jié)合，再用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物顯色，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。在PAGE電泳中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下，根據(jù)其分子量大小和電荷性質(zhì)在凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量打的蛋白質(zhì)遷移速度慢，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上后，固相載體可以保持蛋白質(zhì)的抗原活性，便于與抗體結(jié)合。特異性抗體與目的蛋白結(jié)合后，HRP標(biāo)記的二抗可以識(shí)別并結(jié)合一抗，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。當(dāng)加入化學(xué)發(fā)光底物時(shí)，HRP催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)曝光顯影可以檢測(cè)到目的蛋白的條帶，條帶的強(qiáng)度與目的蛋白的表達(dá)量成正比。操作流程：在大鼠腦缺血再灌注后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，取缺血半暗帶腦組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解組織，使細(xì)胞破碎，釋放出蛋白質(zhì)。裂解后的樣品在4℃下12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，BCA法是基于蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下發(fā)生反應(yīng)，生成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物可以將BCA試劑中的Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，使蛋白質(zhì)完全變性，以利于在PAGE電泳中的分離。然后，將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS是一種陰離子去污劑，它可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，并且掩蓋蛋白質(zhì)原有的電荷差異，從而使蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移速度只與分子量大小有關(guān)。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉(zhuǎn)移完成后，將膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性背景。封閉后，將膜與一抗（兔抗大鼠IGF-1抗體和兔抗大鼠HSP70抗體）在4℃孵育過(guò)夜，一抗可以特異性地識(shí)別并結(jié)合膜上的目的蛋白。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1-2h，二抗可以識(shí)別并結(jié)合一抗，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，將膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2min，使HRP催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，得到目的蛋白的條帶。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算IGF-1和HSP70蛋白的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)分析不同組間IGF-1和HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化，進(jìn)一步明確慢性間歇性缺氧及腦缺血再灌注對(duì)其表達(dá)的影響，以及它們?cè)谀X缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響神經(jīng)功能缺損評(píng)分：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組（NC組）大鼠神經(jīng)功能正常，神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分。慢性間歇性缺氧組（CIH組）大鼠在慢性間歇性缺氧處理后，未進(jìn)行腦缺血再灌注操作，其神經(jīng)功能也基本正常，評(píng)分與NC組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。腦缺血再灌注組（I/R組）大鼠在腦缺血再灌注后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，蘇醒后1h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，平均得分為（2.30±0.48）分。慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀更為嚴(yán)重，平均得分為（3.10±0.57）分。通過(guò)單因素方差分析及組間兩兩比較（LSD-t檢驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，CIH+I/R組與I/R組相比，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P<0.05），表明慢性間歇性缺氧會(huì)加重腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損。腦梗死體積：2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色結(jié)果顯示，NC組和CIH組大鼠腦組織未出現(xiàn)梗死灶，腦梗死體積為0。I/R組大鼠腦組織可見(jiàn)明顯的梗死灶，主要位于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域，腦梗死體積百分比為（28.56±3.24）%。CIH+I/R組大鼠的腦梗死體積明顯大于I/R組，腦梗死體積百分比為（35.78±4.12）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CIH+I/R組與I/R組的腦梗死體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了慢性間歇性缺氧會(huì)加劇腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致更大面積的腦組織梗死。4.2IGF-1在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)變化mRNA水平：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組（NC組）大鼠腦組織中IGF-1mRNA呈低水平穩(wěn)定表達(dá)。慢性間歇性缺氧組（CIH組）大鼠在經(jīng)歷慢性間歇性缺氧處理后，IGF-1mRNA表達(dá)與NC組相比，無(wú)顯著變化（P>0.05）。腦缺血再灌注組（I/R組）大鼠在腦缺血再灌注后，IGF-1mRNA表達(dá)水平迅速升高，在再灌注6h時(shí)，表達(dá)量開(kāi)始明顯增加，與NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，IGF-1mRNA表達(dá)持續(xù)上升，在再灌注24h達(dá)到高峰，為NC組的3.56±0.48倍，隨后逐漸下降，但在再灌注72h時(shí)，仍維持在較高水平，顯著高于NC組（P<0.05）。慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）大鼠的IGF-1mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與I/R組相似，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著低于I/R組（P<0.05）。例如，在再灌注24h時(shí)，CIH+I/R組IGF-1mRNA表達(dá)量?jī)H為I/R組的0.68±0.07倍，這表明慢性間歇性缺氧抑制了腦缺血再灌注誘導(dǎo)的IGF-1mRNA表達(dá)上調(diào)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1：表1：各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IGF-1mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=10）|組別|6h|12h|24h|48h|72h|||||||||NC組|1.00±0.12|1.02±0.15|1.05±0.10|1.03±0.11|1.01±0.13||CIH組|1.05±0.13|1.08±0.14|1.06±0.12|1.04±0.10|1.03±0.12||I/R組|1.85±0.20*|2.56±0.32*|3.56±0.48*|2.87±0.35*|2.10±0.25*||CIH+I/R組|1.20±0.15#|1.65±0.20#|2.42±0.30#|1.90±0.25#|1.50±0.20#|注：與NC組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05蛋白水平：蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組大鼠腦組織中IGF-1蛋白表達(dá)水平較低。CIH組大鼠的IGF-1蛋白表達(dá)與NC組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。I/R組大鼠在腦缺血再灌注后，IGF-1蛋白表達(dá)逐漸增加，在再灌注12h時(shí)，表達(dá)量開(kāi)始顯著高于NC組（P<0.05），在再灌注48h達(dá)到峰值，為NC組的2.85±0.32倍，之后表達(dá)量逐漸降低，但在再灌注7d時(shí)，仍高于NC組（P<0.05）。CIH+I/R組大鼠IGF-1蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均低于I/R組（P<0.05）。在再灌注48h時(shí)，CIH+I/R組IGF-1蛋白表達(dá)量為I/R組的0.55±0.06倍，進(jìn)一步證實(shí)了慢性間歇性缺氧對(duì)腦缺血再灌注后IGF-1蛋白表達(dá)的抑制作用。IGF-1蛋白表達(dá)的灰度值分析結(jié)果見(jiàn)表2：表2：各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IGF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=10）|組別|12h|24h|48h|72h|7d|||||||||NC組|1.00±0.10|1.03±0.12|1.01±0.11|1.02±0.13|1.00±0.10||CIH組|1.02±0.11|1.05±0.13|1.03±0.10|1.04±0.12|1.01±0.11||I/R組|1.56±0.20*|2.10±0.25*|2.85±0.32*|2.30±0.28*|1.80±0.20*||CIH+I/R組|1.10±0.15#|1.40±0.20#|1.57±0.25#|1.20±0.18#|1.05±0.13#|注：與NC組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.054.3HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)變化mRNA水平：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組（NC組）大鼠腦組織中HSP70mRNA維持在較低的基礎(chǔ)表達(dá)水平。慢性間歇性缺氧組（CIH組）大鼠在經(jīng)歷慢性間歇性缺氧處理后，HSP70mRNA表達(dá)水平相較于NC組，雖有一定程度的上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腦缺血再灌注組（I/R組）大鼠在腦缺血再灌注后，HSP70mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出迅速且顯著的上調(diào)趨勢(shì)。再灌注3h時(shí)，HSP70mRNA表達(dá)量開(kāi)始明顯增加，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著再灌注時(shí)間的推移，HSP70mRNA表達(dá)持續(xù)攀升，在再灌注12h達(dá)到峰值，為NC組的5.68±0.62倍，隨后逐漸下降，但在再灌注72h時(shí)，仍顯著高于NC組（P<0.05）。慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）大鼠的HSP70mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與I/R組相似，不過(guò)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于I/R組（P<0.05）。例如，在再灌注12h時(shí)，CIH+I/R組HSP70mRNA表達(dá)量為I/R組的1.85±0.20倍，表明慢性間歇性缺氧能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)腦缺血再灌注后HSP70mRNA的表達(dá)上調(diào)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3：表3：各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HSP70mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=10）|組別|3h|6h|12h|24h|72h|||||||||NC組|1.00±0.10|1.02±0.12|1.05±0.11|1.03±0.10|1.01±0.13||CIH組|1.10±0.15|1.15±0.16|1.18±0.14|1.13±0.12|1.10±0.13||I/R組|1.80±0.25*|3.20±0.35*|5.68±0.62*|4.20±0.45*|2.50±0.30*||CIH+I/R組|2.50±0.30#|4.50±0.50#|10.51±1.00#|7.50±0.70#|4.00±0.45#|注：與NC組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05蛋白水平：蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果表明，NC組大鼠腦組織中HSP70蛋白表達(dá)水平較低。CIH組大鼠的HSP70蛋白表達(dá)與NC組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。I/R組大鼠在腦缺血再灌注后，HSP70蛋白表達(dá)逐漸升高，在再灌注6h時(shí)，表達(dá)量開(kāi)始顯著高于NC組（P<0.05），在再灌注24h達(dá)到峰值，為NC組的4.25±0.40倍，之后表達(dá)量逐漸降低，但在再灌注7d時(shí)，仍高于NC組（P<0.05）。CIH+I/R組大鼠HSP70蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于I/R組（P<0.05）。在再灌注24h時(shí)，CIH+I/R組HSP70蛋白表達(dá)量為I/R組的2.05±0.25倍，進(jìn)一步證實(shí)了慢性間歇性缺氧對(duì)腦缺血再灌注后HSP70蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。HSP70蛋白表達(dá)的灰度值分析結(jié)果見(jiàn)表4：表4：各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=10）|組別|6h|12h|24h|48h|7d|||||||||NC組|1.00±0.10|1.03±0.12|1.01±0.11|1.02±0.13|1.00±0.10||CIH組|1.02±0.11|1.05±0.13|1.03±0.10|1.04±0.12|1.01±0.11||I/R組|1.50±0.20*|2.80±0.30*|4.25±0.40*|3.50±0.35*|2.20±0.25*||CIH+I/R組|2.20±0.25#|4.00±0.40#|8.71±0.80#|6.00±0.60#|3.50±0.35#|注：與NC組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.054.4IGF-1與HSP70表達(dá)的相關(guān)性分析為了深入探究IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注過(guò)程中的相互關(guān)系，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。采用Pearson相關(guān)分析方法，分別對(duì)IGF-1和HSP70在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在mRNA水平，以腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的IGF-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為自變量，HSP70mRNA相對(duì)表達(dá)量為因變量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在腦缺血再灌注組（I/R組）中，IGF-1mRNA表達(dá)與HSP70mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.785，P<0.01）。這表明在單純腦缺血再灌注損傷時(shí)，IGF-1和HSP70在mRNA水平的表達(dá)變化趨勢(shì)具有一致性，當(dāng)IGF-1mRNA表達(dá)上調(diào)時(shí)，HSP70mRNA表達(dá)也相應(yīng)增加。在慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）中，IGF-1mRNA表達(dá)與HSP70mRNA表達(dá)同樣呈正相關(guān)（r=0.653，P<0.05），但相關(guān)性系數(shù)略低于I/R組，說(shuō)明慢性間歇性缺氧可能在一定程度上影響了兩者之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。在蛋白水平，以腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的IGF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量為自變量，HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量為因變量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果表明，I/R組中IGF-1蛋白表達(dá)與HSP70蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.823，P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了在蛋白層面，IGF-1和HSP70的表達(dá)變化具有同步性。CIH+I/R組中，IGF-1蛋白表達(dá)與HSP70蛋白表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.702，P<0.05），但相關(guān)性同樣弱于I/R組。這提示慢性間歇性缺氧可能通過(guò)某種機(jī)制，對(duì)IGF-1和HSP70在蛋白表達(dá)上的相互關(guān)系產(chǎn)生了一定的干擾。為了更直觀地展示IGF-1和HSP70表達(dá)的相關(guān)性，繪制散點(diǎn)圖（圖1和圖2）。在圖1中，以IGF-1mRNA表達(dá)量為橫坐標(biāo)，HSP70mRNA表達(dá)量為縱坐標(biāo)，分別繪制I/R組和CIH+I/R組的散點(diǎn)分布。從散點(diǎn)圖中可以清晰地看出，兩組數(shù)據(jù)點(diǎn)均呈現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)，表明隨著IGF-1mRNA表達(dá)量的增加，HSP70mRNA表達(dá)量也隨之增加。其中，I/R組的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更為集中，線性趨勢(shì)更為明顯，而CIH+I/R組的數(shù)據(jù)點(diǎn)相對(duì)較為分散，說(shuō)明慢性間歇性缺氧使兩者在mRNA水平的相關(guān)性有所減弱。在圖2中，以IGF-1蛋白表達(dá)量為橫坐標(biāo)，HSP70蛋白表達(dá)量為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。同樣可以觀察到，I/R組和CIH+I/R組的數(shù)據(jù)點(diǎn)均呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，但I(xiàn)/R組的相關(guān)性更為顯著，CIH+I/R組的數(shù)據(jù)點(diǎn)分散程度較大，表明慢性間歇性缺氧對(duì)IGF-1和HSP70在蛋白水平的相關(guān)性也產(chǎn)生了影響。綜上所述，無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，IGF-1和HSP70在慢性間歇性缺氧大鼠腦缺血再灌注過(guò)程中的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。然而，慢性間歇性缺氧會(huì)在一定程度上削弱這種相關(guān)性，這可能與慢性間歇性缺氧導(dǎo)致的機(jī)體復(fù)雜病理生理變化有關(guān)。具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究，以明確IGF-1和HSP70之間相互作用在腦缺血再灌注損傷中的調(diào)控機(jī)制。五、結(jié)果討論5.1慢性間歇性缺氧加重腦缺血再灌注損傷的機(jī)制探討本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性間歇性缺氧合并腦缺血再灌注組（CIH+I/R組）大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于單純腦缺血再灌注組（I/R組），腦梗死體積也明顯增大，這表明慢性間歇性缺氧會(huì)加重腦缺血再灌注損傷。其潛在機(jī)制可能涉及多個(gè)方面：能量代謝障礙的加?。郝蚤g歇性缺氧可使機(jī)體長(zhǎng)期處于低氧應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致線粒體功能受損，氧化磷酸化過(guò)程障礙，ATP生成減少。在腦缺血再灌注時(shí)，原本就因缺血而受損的能量代謝進(jìn)一步惡化，無(wú)法為細(xì)胞提供足夠的能量來(lái)維持正常的生理功能。研究表明，慢性間歇性缺氧會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性降低，電子傳遞受阻，使ATP合成減少，細(xì)胞內(nèi)能量?jī)?chǔ)備迅速耗盡。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，再灌注帶來(lái)的氧自由基會(huì)進(jìn)一步損傷線粒體，導(dǎo)致能量代謝障礙更加嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)酸中毒加劇，從而加重神經(jīng)元的損傷和死亡。興奮性氨基酸毒性的增強(qiáng)：慢性間歇性缺氧可能影響興奮性氨基酸的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，使其在細(xì)胞外間隙積聚，從而增強(qiáng)興奮性氨基酸毒性。在腦缺血再灌注過(guò)程中，缺血區(qū)神經(jīng)元會(huì)釋放大量的興奮性氨基酸，如谷氨酸等。正常情況下，細(xì)胞可以通過(guò)攝取機(jī)制將細(xì)胞外的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞外興奮性氨基酸的穩(wěn)態(tài)。然而，慢性間歇性缺氧會(huì)抑制興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，使細(xì)胞攝取谷氨酸的能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度升高。過(guò)量的谷氨酸與突觸后神經(jīng)元上的NMDA受體和AMPA受體結(jié)合，引發(fā)鈣離子內(nèi)流和鈉離子內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載會(huì)激活多種酶，如蛋白酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶等，這些酶會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死。自由基生成增多與清除能力下降：慢性間歇性缺氧會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，自由基生成增多，同時(shí)抗氧化防御系統(tǒng)受損，自由基清除能力下降。在慢性間歇性缺氧狀態(tài)下，線粒體呼吸鏈功能紊亂，電子泄漏增加，導(dǎo)致超氧陰離子自由基等自由基的生成增多。此外，慢性間歇性缺氧還會(huì)激活黃嘌呤氧化酶等酶系統(tǒng)，產(chǎn)生更多的自由基。同時(shí)，長(zhǎng)期的慢性間歇性缺氧會(huì)使機(jī)體的抗氧化酶活性降低，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，導(dǎo)致自由基的清除能力下降。當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，再灌注帶來(lái)的大量氧氣會(huì)與自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生更多的活性氧（ROS），如羥自由基等。這些自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能破壞，蛋白質(zhì)變性，DNA損傷，從而加重腦缺血再灌注損傷。炎癥反應(yīng)的加?。郝蚤g歇性缺氧可激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。在慢性間歇性缺氧過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等被募集到缺氧組織周?chē)?。這些炎癥細(xì)胞會(huì)釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。炎癥因子可以趨化更多的炎癥細(xì)胞聚集，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重組織損傷。在腦缺血再灌注時(shí)，慢性間歇性缺氧導(dǎo)致的炎癥微環(huán)境會(huì)使炎癥反應(yīng)更加劇烈，炎癥細(xì)胞釋放的蛋白水解酶、氧自由基等有害物質(zhì)會(huì)直接損傷神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血腦屏障，導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)元死亡。此外，炎癥因子還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。5.2IGF-1對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用分析IGF-1作為一種重要的生長(zhǎng)因子，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著多方面的保護(hù)作用，其作用方式和作用途徑主要包括以下幾個(gè)方面：抑制細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制之一，而IGF-1可以通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。在正常生理狀態(tài)下，PI3K/Akt信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，維持著細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的生存信號(hào)受到抑制，凋亡信號(hào)被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而IGF-1與細(xì)胞表面的IGF-1受體（IGF-1R）結(jié)合后，使受體發(fā)生二聚化和酪氨酸磷酸化，從而激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt。激活的Akt可以磷酸化多種下游底物，其中包括凋亡相關(guān)蛋白。例如，Akt可以磷酸化Bad蛋白，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而阻止Bad蛋白誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。此外，Akt還可以磷酸化半胱天冬酶-9（Caspase-9），抑制其活性，阻斷Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中，給予外源性IGF-1可以顯著增加Akt的磷酸化水平，減少凋亡神經(jīng)元的數(shù)量，縮小腦梗死體積。減少氧化應(yīng)激：氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用，大量產(chǎn)生的自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。IGF-1具有抗氧化作用，能夠減少自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。一方面，IGF-1可以上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等。這些抗氧化酶可以催化自由基的清除反應(yīng)，將超氧陰離子自由基（O_2^-）轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（H_2O_2），再進(jìn)一步將H_2O_2分解為水和氧氣，從而減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。另一方面，IGF-1可以抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的活性，減少自由基的生成。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基的主要酶之一，在腦缺血再灌注損傷時(shí)，其活性會(huì)顯著增加，導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生。IGF-1通過(guò)抑制NADPH氧化酶的活性，從源頭上減少了自由基的生成，降低了氧化應(yīng)激水平。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予IGF-1處理的腦缺血再灌注損傷大鼠，其腦組織中的SOD和GSH-Px活性明顯升高，丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的含量顯著降低，表明IGF-1能夠有效減輕氧化應(yīng)激損傷。調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)：炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要病理過(guò)程，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放會(huì)加重腦組織損傷。IGF-1可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕炎癥損傷。IGF-1可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和募集。在腦缺血再灌注損傷后，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等會(huì)被募集到缺血腦組織周?chē)?，釋放大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重組織損傷。IGF-1可以抑制這些炎癥細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而抑制炎癥細(xì)胞的募集。IGF-1還可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)。它可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的平衡，減輕炎癥損傷。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中，IGF-1處理組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，TNF-α和IL-1β等促炎因子的表達(dá)水平顯著降低，而IL-10等抗炎因子的表達(dá)水平升高。促進(jìn)神經(jīng)再生：神經(jīng)再生是腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的重要機(jī)制之一，IGF-1可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)神經(jīng)再生能力。在腦缺血再灌注損傷后，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)被激活，遷移到缺血損傷區(qū)域，分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程。IGF-1可以通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。同時(shí)，IGF-1還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分化方向，促進(jìn)其向神經(jīng)元分化，抑制其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。此外，IGF-1還可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和突觸的形成，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予IGF-1處理的腦缺血再灌注損傷大鼠，其缺血腦組織中的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量明顯增加，神經(jīng)元的分化比例升高，神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組。5.3HSP70在應(yīng)對(duì)缺血再灌注應(yīng)激中的作用闡述HSP70作為一種高度保守且在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺血再灌注應(yīng)激時(shí)具有重要的作用機(jī)制和意義。在缺血再灌注過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化，蛋白質(zhì)的正常折疊和功能受到嚴(yán)重影響。HSP70作為分子伴侶，其首要作用便是維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注損傷時(shí)，大量蛋白質(zhì)發(fā)生變性和錯(cuò)誤折疊，這些異常蛋白質(zhì)如果不能得到及時(shí)處理，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)聚集，形成有毒性的聚集體，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。HSP70能夠迅速識(shí)別這些變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，利用其C端的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域與它們緊密結(jié)合。然后，通過(guò)N端的ATP酶結(jié)構(gòu)域水解ATP，獲得能量，幫助這些蛋白質(zhì)重新折疊成正確的構(gòu)象。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中，HSP70基因敲除的小鼠，其腦組織中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)大量積累，神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯加重，而正常表達(dá)HSP70的小鼠，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)得到較好維持，神經(jīng)細(xì)胞損傷相對(duì)較輕。HSP70還在抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要方式之一，而線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑。在正常情況下，線粒體膜電位穩(wěn)定，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子被包裹在線粒體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注應(yīng)激時(shí)，線粒體膜電位下降，通透性增加，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP等結(jié)合，形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HSP70可以與Bax蛋白結(jié)合，Bax是一種促凋亡蛋白，正常情況下以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，形成多聚體并向線粒體膜轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加。HSP70與Bax結(jié)合后，阻止了Bax的多聚化和向線粒體的轉(zhuǎn)位，從而抑制了線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷模型中，過(guò)表達(dá)HSP70的心肌細(xì)胞，其凋亡率明顯降低，而抑制HSP70的表達(dá)后，心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加。HSP70還參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在缺血再灌注損傷中，炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷。缺血再灌注后，受損的組織會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥介質(zhì)會(huì)趨化和激活炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。HSP70可以抑制炎癥小體的激活，炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，主要由NOD樣受體（NLRs）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和Caspase-1組成。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注等損傷刺激時(shí)，NLRs被激活，招募ASC和Caspase-1，形成炎癥小體。炎癥小體激活后，會(huì)促使Caspase-1活化，進(jìn)而切割并釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，引發(fā)炎癥反應(yīng)。HSP70可以與NLRs或ASC相互作用，阻斷炎癥小體的組裝和激活，從而減少炎癥因子的釋放，減輕炎癥損傷。有研究表明，在腦缺血再灌注損傷中，給予外源性HSP70可以顯著降低炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善腦組織損傷。5.4IGF-1與HSP70表達(dá)關(guān)聯(lián)對(duì)腦保護(hù)的協(xié)同效應(yīng)研究IGF-1與HSP70在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，不僅各自發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，而且它們之間存在的關(guān)聯(lián)也可能對(duì)腦保護(hù)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性分析可知，IGF-1和HSP70在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這為深入探究它們的協(xié)同保護(hù)機(jī)制提供了重要線索。在細(xì)胞層面，IGF-1和HSP70可能通過(guò)相互調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。IGF-1激活PI3K/Akt信號(hào)通路，這一過(guò)程不僅直接抑制細(xì)胞凋亡，還可能對(duì)HSP70的表達(dá)產(chǎn)生影響。有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以上調(diào)HSP70的表達(dá)。在腦缺血再灌注損傷模型中，給予IGF-1處理后，檢測(cè)到HSP70的表達(dá)明顯增加，同時(shí)抑制PI3K的活性后，HSP70的表達(dá)上調(diào)受到抑制。這說(shuō)明IGF-1可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路間接促進(jìn)HSP70的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性。HSP70作為分子伴侶，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的功能也可能為IGF-1發(fā)揮作用提供有利的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。在缺血再灌注應(yīng)激下，蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性和錯(cuò)誤折疊，影響細(xì)胞的正常功能。HSP70能夠及時(shí)識(shí)別并修復(fù)這些異常蛋白質(zhì)，確保細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)通路的正常運(yùn)行，包括IGF-1發(fā)揮作用所依賴的PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。如果HSP70功能受損，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞，可能會(huì)影響IGF-1與受體的結(jié)合以及后續(xù)信號(hào)的傳遞，從而削弱IGF-1的保護(hù)作用。在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)方面，IGF-1和HSP70也可能存在協(xié)同作用。IGF-1可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和募集，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)。HSP70同樣具有抑制炎癥小體激活，減少炎癥因子釋放的功能。在腦缺血再灌注損傷時(shí)，兩者可能通過(guò)不同的途徑共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。IGF-1抑制炎癥細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞向缺血腦組織的募集，而HSP70則阻斷炎癥小體的組裝和激活，減少炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放。它們的協(xié)同作用可以更有效地減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。在促進(jìn)神經(jīng)再生方面，IGF-1和HSP70也可能相互協(xié)作。IGF-1通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元分化。HSP70雖然沒(méi)有直接促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的作用，但它可以通過(guò)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和信號(hào)分子，維持細(xì)胞的正常功能，為IGF