慢病毒介導(dǎo)RNAi靶向DC-STAMP對人破骨細(xì)胞成熟的調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景骨組織作為人體的重要組成部分，處于不斷的新陳代謝過程中，這一過程主要依賴于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的精細(xì)平衡。破骨細(xì)胞是一種高度特化的多核巨細(xì)胞，在骨代謝中發(fā)揮著不可或缺的骨吸收作用。其通過分泌酸性物質(zhì)和多種蛋白水解酶，如組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶等，溶解骨礦物質(zhì)并降解骨基質(zhì)中的有機(jī)成分，從而實(shí)現(xiàn)對舊骨或受損骨組織的清除，為新骨的形成騰出空間，這一過程對于維持骨骼的正常結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度和代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在兒童生長發(fā)育階段，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的協(xié)同作用促進(jìn)了骨骼的塑形和生長；在成年人中，它們共同維持骨量的相對穩(wěn)定；而在骨折修復(fù)過程中，破骨細(xì)胞先清除受損的骨組織，隨后成骨細(xì)胞再進(jìn)行新骨的合成與重建。然而，當(dāng)破骨細(xì)胞的成熟過程出現(xiàn)異常時(shí)，這種平衡就會(huì)被打破，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重的骨相關(guān)疾病。骨質(zhì)疏松癥便是其中最為常見的一種，其特征是骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有2億人受骨質(zhì)疏松癥影響，且隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在骨質(zhì)疏松癥患者中，破骨細(xì)胞的活性往往異常增強(qiáng)，過度的骨吸收超過了成骨細(xì)胞的骨形成能力，使得骨量不斷丟失，最終導(dǎo)致骨骼變得脆弱易折。此外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤等疾病也與破骨細(xì)胞的異?；罨统墒烀芮邢嚓P(guān)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，炎癥因子的釋放會(huì)刺激破骨細(xì)胞的生成和活化，引發(fā)關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙；骨腫瘤細(xì)胞則可通過分泌多種細(xì)胞因子，如核因子κB受體活化因子配體（RANKL）等，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，進(jìn)而造成骨組織的侵蝕和破壞。破骨細(xì)胞的成熟是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，涉及多個(gè)信號通路和眾多基因的精確調(diào)控。其中，樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）被證實(shí)是破骨細(xì)胞成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。DC-STAMP屬于免疫球蛋白超家族成員，主要在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞中表達(dá)。在破骨細(xì)胞形成過程中，DC-STAMP在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合階段發(fā)揮著核心作用。當(dāng)受到RANKL等刺激時(shí)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的DC-STAMP表達(dá)上調(diào)，其通過介導(dǎo)細(xì)胞間的相互識(shí)別和黏附，促進(jìn)多個(gè)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合形成多核的成熟破骨細(xì)胞。研究表明，在DC-STAMP基因敲除的小鼠模型中，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞無法正常融合，導(dǎo)致成熟破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少，骨吸收功能明顯受損，小鼠表現(xiàn)出骨硬化的表型。這充分說明了DC-STAMP對于破骨細(xì)胞成熟和骨吸收功能的重要性。因此，深入研究DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟過程中的作用機(jī)制，并通過有效手段調(diào)控其表達(dá)，對于治療破骨細(xì)胞成熟異常相關(guān)的骨疾病具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義本研究旨在利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)，特異性地抑制人破骨細(xì)胞中DC-STAMP的表達(dá)，深入探究其對破骨細(xì)胞成熟過程的影響，從細(xì)胞和分子層面揭示DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用機(jī)制。通過構(gòu)建針對DC-STAMP基因的慢病毒干擾載體，將其轉(zhuǎn)染至人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，觀察細(xì)胞在分化、融合及成熟過程中的形態(tài)學(xué)變化，檢測相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)水平，分析破骨細(xì)胞骨吸收功能的改變，從而明確DC-STAMP表達(dá)抑制與破骨細(xì)胞成熟受阻之間的內(nèi)在聯(lián)系。從理論意義上看，本研究有助于深入理解破骨細(xì)胞成熟的分子調(diào)控機(jī)制，為骨代謝相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)。破骨細(xì)胞的成熟過程涉及眾多基因和信號通路的相互作用，DC-STAMP作為關(guān)鍵調(diào)控因子，其作用機(jī)制的深入解析將豐富我們對骨代謝生理和病理過程的認(rèn)識(shí)，填補(bǔ)該領(lǐng)域在分子機(jī)制研究方面的部分空白，為進(jìn)一步探索骨疾病的發(fā)病機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果對破骨細(xì)胞成熟異常相關(guān)骨疾病的治療靶點(diǎn)開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。如前所述，骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤等疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和健康，目前的治療手段存在一定局限性。通過明確DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟中的關(guān)鍵作用，以其為靶點(diǎn)開發(fā)新型治療策略，有望為這些疾病的治療提供新的方向和方法。例如，基于本研究結(jié)果，未來可設(shè)計(jì)特異性抑制DC-STAMP表達(dá)或活性的藥物，精準(zhǔn)調(diào)控破骨細(xì)胞的成熟過程，減少異常的骨吸收，從而有效治療骨質(zhì)疏松癥等疾病，降低患者骨折風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后；對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，抑制DC-STAMP可能減輕關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)破壞，緩解關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙；在骨腫瘤治療中，靶向DC-STAMP或許能夠抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化，減少骨組織侵蝕，提高患者生存率。因此，本研究具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值，有望為骨疾病的防治帶來新的突破。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在破骨細(xì)胞成熟機(jī)制研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩成果。破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞譜系中的單核巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞，其成熟過程受多種細(xì)胞因子和信號通路精確調(diào)控。在眾多關(guān)鍵細(xì)胞因子中，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）被公認(rèn)為是破骨細(xì)胞分化和成熟的核心調(diào)節(jié)因子。RANKL與其受體RANK結(jié)合后，激活下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而引發(fā)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，包括激活核因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路。這些通路的激活最終導(dǎo)致活化T細(xì)胞核因子1（NFATc1）的誘導(dǎo)和激活，NFATc1作為破骨細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、降鈣素受體（CTR）等的表達(dá)，推動(dòng)破骨細(xì)胞的分化和成熟。在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合形成多核破骨細(xì)胞的過程中，DC-STAMP發(fā)揮著關(guān)鍵作用。日本學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)DC-STAMP基因敲除小鼠的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞無法正常融合，導(dǎo)致成熟破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少，骨吸收功能明顯受損。國內(nèi)研究也表明，在體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，干擾DC-STAMP表達(dá)后，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合率明顯降低，多核破骨細(xì)胞數(shù)量減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DC-STAMP通過與其他細(xì)胞表面分子相互作用，如CD47等，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附與融合，其分子機(jī)制涉及細(xì)胞骨架的重排和膜融合相關(guān)蛋白的參與。關(guān)于慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)應(yīng)用，國外已將其廣泛應(yīng)用于基因功能研究和基因治療探索。在癌癥研究領(lǐng)域，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默腫瘤相關(guān)基因，如致癌基因或耐藥相關(guān)基因，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為癌癥治療提供了新的策略。在神經(jīng)科學(xué)研究中，該技術(shù)用于下調(diào)神經(jīng)元中特定基因的表達(dá)，以研究其在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制。國內(nèi)在這方面也緊跟國際步伐，在心血管疾病、代謝性疾病等研究中成功運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)。例如，通過沉默與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的關(guān)鍵基因，改善血管內(nèi)皮功能，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程；在糖尿病研究中，利用該技術(shù)調(diào)控胰島素信號通路相關(guān)基因表達(dá)，探索糖尿病的發(fā)病機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。然而，目前對于DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟過程中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制仍存在諸多未知。盡管已知DC-STAMP參與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合，但它與其他信號通路之間的交叉對話以及在不同生理和病理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。在慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)應(yīng)用于破骨細(xì)胞研究方面，如何提高慢病毒轉(zhuǎn)染效率、增強(qiáng)RNAi干擾效果以及確保其在體內(nèi)應(yīng)用的安全性和穩(wěn)定性，仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，針對DC-STAMP開發(fā)靶向治療骨疾病的策略，目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走，需要開展更多的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1破骨細(xì)胞概述2.1.1破骨細(xì)胞的來源與分化過程破骨細(xì)胞作為骨代謝中的關(guān)鍵細(xì)胞，其來源與分化過程受到了廣泛而深入的研究。破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，存在于骨髓等造血組織中。在機(jī)體的調(diào)控下，造血干細(xì)胞首先分化為髓系祖細(xì)胞，髓系祖細(xì)胞具有向多種髓系細(xì)胞分化的能力。在特定的細(xì)胞因子和微環(huán)境作用下，髓系祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為單核巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞。這些前體細(xì)胞在血液循環(huán)中遷移，當(dāng)它們接收到來自骨組織微環(huán)境的信號刺激時(shí)，便會(huì)趨化至骨表面。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）在破骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用。M-CSF主要由成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等分泌，它與單核巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞表面的M-CSF受體（c-Fms）結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路等，促進(jìn)前體細(xì)胞的存活、增殖和分化。研究表明，在缺乏M-CSF的環(huán)境中，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)量和活性顯著降低，無法正常分化為破骨細(xì)胞。RANKL則是破骨細(xì)胞分化和成熟的核心調(diào)節(jié)因子，其主要由成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及活化的T細(xì)胞等表達(dá)。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）特異性結(jié)合，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而激活多條下游信號通路，包括核因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。NF-κB信號通路的激活可誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的存活；MAPK通路則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和基因表達(dá)。這些信號通路相互協(xié)作，最終導(dǎo)致活化T細(xì)胞核因子1（NFATc1）的誘導(dǎo)和激活。NFATc1是破骨細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，它進(jìn)入細(xì)胞核后，與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、降鈣素受體（CTR）、組織蛋白酶K（CTSK）等的表達(dá)，推動(dòng)單核巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。在分化后期，多個(gè)單核的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞會(huì)發(fā)生融合，形成多核的成熟破骨細(xì)胞。這一融合過程是破骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵步驟，涉及細(xì)胞間的識(shí)別、黏附與膜融合等復(fù)雜機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合中發(fā)揮著核心作用。DC-STAMP屬于免疫球蛋白超家族成員，主要在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)受到RANKL等刺激時(shí)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的DC-STAMP表達(dá)上調(diào)，其通過與其他細(xì)胞表面分子相互作用，如CD47等，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附與融合。此外，細(xì)胞骨架的重排和膜融合相關(guān)蛋白的參與也是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合的重要機(jī)制。肌動(dòng)蛋白、微管等細(xì)胞骨架成分在融合過程中發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，為細(xì)胞的形態(tài)改變和融合提供動(dòng)力；膜融合相關(guān)蛋白如SNARE蛋白家族等，則介導(dǎo)了細(xì)胞間的膜融合事件，促進(jìn)多核破骨細(xì)胞的形成。2.1.2破骨細(xì)胞的功能及在骨代謝中的作用破骨細(xì)胞在骨代謝過程中扮演著不可或缺的角色，其主要功能是骨吸收，這一過程對于維持骨骼的正常結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度和代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。破骨細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特性，使其能夠高效地執(zhí)行骨吸收功能。破骨細(xì)胞是一種多核巨細(xì)胞，其細(xì)胞體積較大，含有多個(gè)細(xì)胞核，這種多核結(jié)構(gòu)賦予了破骨細(xì)胞強(qiáng)大的代謝和功能能力。在骨吸收過程中，破骨細(xì)胞首先通過細(xì)胞表面的整合素等黏附分子與骨基質(zhì)緊密結(jié)合，在骨表面形成一個(gè)相對封閉的微環(huán)境。隨后，破骨細(xì)胞通過質(zhì)子泵（H+-ATP酶）將細(xì)胞內(nèi)的氫離子分泌到骨表面的微環(huán)境中，使局部pH值降低，達(dá)到酸性環(huán)境。這種酸性環(huán)境能夠溶解骨礦物質(zhì)，如羥基磷灰石等，使骨中的鈣、磷等礦物質(zhì)離子釋放到細(xì)胞外液中。同時(shí)，破骨細(xì)胞還分泌多種蛋白水解酶，如組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶等，這些酶能夠降解骨基質(zhì)中的有機(jī)成分，如膠原蛋白等。組織蛋白酶K是破骨細(xì)胞分泌的一種關(guān)鍵蛋白酶，它能夠特異性地降解膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，在骨基質(zhì)降解中發(fā)揮著核心作用。通過酸性物質(zhì)和蛋白水解酶的協(xié)同作用，破骨細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了對骨組織的有效吸收，將舊骨或受損骨組織清除，為新骨的形成創(chuàng)造條件。破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間存在著密切的相互作用，二者協(xié)同維持著骨代謝的平衡。成骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨形成，它們合成并分泌骨基質(zhì)，如膠原蛋白、骨鈣素等，然后通過礦化作用使骨基質(zhì)逐漸沉積形成新骨。在正常生理狀態(tài)下，破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)與成骨細(xì)胞的骨形成活動(dòng)處于動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)機(jī)體需要進(jìn)行骨重塑時(shí)，破骨細(xì)胞首先被激活，開始吸收舊骨或受損骨組織。在破骨細(xì)胞骨吸收過程中，會(huì)釋放出多種細(xì)胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）等。這些因子能夠招募成骨細(xì)胞前體細(xì)胞到骨吸收部位，并促進(jìn)其分化為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞在骨吸收后的部位開始合成和分泌骨基質(zhì)，進(jìn)行骨形成，從而完成骨重塑過程。這種破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的“耦聯(lián)”機(jī)制，確保了骨骼在生長、發(fā)育、修復(fù)和維持正常功能過程中，骨量和骨結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。然而，當(dāng)破骨細(xì)胞的功能出現(xiàn)異常時(shí)，骨代謝平衡就會(huì)被打破，進(jìn)而引發(fā)一系列骨代謝疾病。骨質(zhì)疏松癥是一種常見的與破骨細(xì)胞功能異常密切相關(guān)的骨代謝疾病。在骨質(zhì)疏松癥患者中，破骨細(xì)胞的活性往往異常增強(qiáng)，其骨吸收能力超過了成骨細(xì)胞的骨形成能力，導(dǎo)致骨量不斷丟失。研究表明，多種因素可導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，如雌激素缺乏、炎癥因子升高、RANKL表達(dá)增加等。雌激素缺乏是絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的主要病因之一，雌激素能夠抑制破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)其凋亡。當(dāng)雌激素水平下降時(shí)，破骨細(xì)胞的凋亡減少，存活時(shí)間延長，活性增強(qiáng)，從而加速骨吸收。炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中也起著重要作用，它們能夠刺激破骨細(xì)胞的分化和活化，抑制成骨細(xì)胞的功能。此外，RANKL表達(dá)增加可通過激活RANK信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，增強(qiáng)其骨吸收能力。除骨質(zhì)疏松癥外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤等疾病也與破骨細(xì)胞的異?；罨芮邢嚓P(guān)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)局部的炎癥微環(huán)境會(huì)刺激破骨細(xì)胞的生成和活化，導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)破壞，引發(fā)關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。骨腫瘤細(xì)胞則可通過分泌多種細(xì)胞因子，如RANKL、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（MIP-1α）等，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，造成骨組織的侵蝕和破壞。綜上所述，破骨細(xì)胞的功能及與成骨細(xì)胞的協(xié)同作用對于維持骨代謝平衡至關(guān)重要，其功能異常是多種骨代謝疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。2.2DC-STAMP的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1DC-STAMP的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)DC-STAMP基因位于人類染色體6p21.33區(qū)域，其全長約為37,356個(gè)堿基對。基因序列分析顯示，DC-STAMP基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，外顯子部分編碼了具有重要功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通過對DC-STAMP基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其主要轉(zhuǎn)錄本編碼一個(gè)由318個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。從氨基酸序列來看，DC-STAMP蛋白具有一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。它包含一個(gè)典型的信號肽序列，位于N端的前19個(gè)氨基酸殘基，這一信號肽序列在蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，引導(dǎo)DC-STAMP蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的折疊和修飾。在DC-STAMP蛋白的結(jié)構(gòu)中，存在多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，經(jīng)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其含有7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。這些跨膜結(jié)構(gòu)域使得DC-STAMP能夠錨定在細(xì)胞膜上，從而參與細(xì)胞間的相互作用和信號傳遞?？缒そY(jié)構(gòu)域之間由不同長度的細(xì)胞外環(huán)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)連接，這些環(huán)區(qū)富含多種氨基酸殘基，其中一些特定的氨基酸殘基對于DC-STAMP與其他細(xì)胞表面分子的相互作用至關(guān)重要。在細(xì)胞外環(huán)中，存在一些保守的半胱氨酸殘基，它們可以通過形成二硫鍵來穩(wěn)定蛋白的空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可能參與與其他分子的識(shí)別和結(jié)合過程。DC-STAMP蛋白的C端位于細(xì)胞內(nèi)，包含一段具有特定氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路相關(guān)分子相互作用，從而將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)。研究表明，DC-STAMP蛋白的結(jié)構(gòu)特征與其在破骨細(xì)胞融合過程中的功能密切相關(guān)。其跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外環(huán)上的特定氨基酸殘基參與了與其他破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面分子如CD47等的相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附與識(shí)別，為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合提供了必要的分子基礎(chǔ)。而其C端結(jié)構(gòu)域則可能通過與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白、膜融合相關(guān)蛋白等相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞骨架的重排和膜融合過程，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合，最終形成多核的成熟破骨細(xì)胞。2.2.2DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟中的作用機(jī)制DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟過程中扮演著核心角色，其主要通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟和功能發(fā)揮。在破骨細(xì)胞分化過程中，當(dāng)受到巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）等細(xì)胞因子的刺激時(shí)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的DC-STAMP表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）結(jié)合后，激活下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而通過多條信號通路誘導(dǎo)DC-STAMP基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使細(xì)胞表面DC-STAMP蛋白的表達(dá)量增加。上調(diào)表達(dá)的DC-STAMP通過與其他細(xì)胞表面分子相互作用，介導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞之間的黏附與融合。DC-STAMP與CD47之間存在特異性的相互作用，這種相互作用能夠增強(qiáng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞之間的黏附力，使細(xì)胞緊密靠近。研究人員通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲低DC-STAMP或CD47的表達(dá)時(shí)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞之間的黏附能力明顯下降，細(xì)胞難以聚集在一起。除CD47外，DC-STAMP還可能與其他未知的細(xì)胞表面分子相互作用，共同參與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合過程。在細(xì)胞黏附的基礎(chǔ)上，DC-STAMP進(jìn)一步參與調(diào)控細(xì)胞骨架的重排和膜融合相關(guān)蛋白的活性。當(dāng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞相互靠近后，DC-STAMP通過與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白等相互作用，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架成分發(fā)生重排。肌動(dòng)蛋白的重排使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，為細(xì)胞融合創(chuàng)造了有利條件。DC-STAMP還能調(diào)節(jié)膜融合相關(guān)蛋白如SNARE蛋白家族的活性，促進(jìn)細(xì)胞間的膜融合事件。SNARE蛋白家族在細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸和膜融合過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，DC-STAMP可能通過與SNARE蛋白相互作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞之間的細(xì)胞膜融合，最終形成多核的成熟破骨細(xì)胞。成熟的破骨細(xì)胞具有強(qiáng)大的骨吸收功能，DC-STAMP介導(dǎo)的破骨細(xì)胞成熟過程對于維持骨代謝平衡至關(guān)重要。在骨吸收過程中，破骨細(xì)胞通過其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分泌的多種酶類，如組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶等，溶解骨礦物質(zhì)并降解骨基質(zhì)中的有機(jī)成分。而DC-STAMP參與的破骨細(xì)胞成熟過程，確保了破骨細(xì)胞能夠正常形成并發(fā)揮功能，從而維持骨組織的正常更新和重塑。當(dāng)DC-STAMP的功能受到抑制或缺失時(shí)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞無法正常融合，成熟破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨吸收功能受損，導(dǎo)致骨代謝失衡，引發(fā)骨硬化等疾病。綜上所述，DC-STAMP通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的融合，參與調(diào)控破骨細(xì)胞的成熟過程，在骨代謝中發(fā)揮著不可或缺的作用。2.3慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)2.3.1慢病毒載體的特點(diǎn)與優(yōu)勢慢病毒載體是一類基于人免疫缺陷病毒（HIV）改造而來的基因傳遞工具，在基因治療、基因功能研究等領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。其具有廣泛的宿主范圍，不僅能夠高效感染分裂期細(xì)胞，如快速增殖的腫瘤細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，還能有效感染非分裂期細(xì)胞，包括神經(jīng)元、心肌細(xì)胞等。這種特性使得慢病毒載體在多種細(xì)胞類型的基因操作中具有不可替代的作用，為深入研究不同細(xì)胞的生物學(xué)功能提供了有力手段。例如，在神經(jīng)科學(xué)研究中，通過慢病毒載體將特定基因?qū)肷窠?jīng)元，可研究該基因在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)信號傳導(dǎo)等過程中的作用。慢病毒載體能夠?qū)y帶的目的基因穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)基因的長期穩(wěn)定表達(dá)。這一特點(diǎn)與其他一些基因傳遞方法，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，具有明顯優(yōu)勢。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通常只能實(shí)現(xiàn)基因的瞬時(shí)表達(dá)，難以滿足對基因長期調(diào)控的研究需求。而慢病毒介導(dǎo)的基因整合，可使目的基因隨宿主細(xì)胞的分裂而傳遞給子代細(xì)胞，保證了基因表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在基因治療中，穩(wěn)定的基因表達(dá)對于持續(xù)糾正致病基因缺陷、維持治療效果至關(guān)重要。以鐮狀細(xì)胞貧血等單基因遺傳病的基因治療研究為例，慢病毒載體將正常的血紅蛋白基因?qū)牖颊咴煅杉?xì)胞后，可長期穩(wěn)定表達(dá)正常血紅蛋白，有望從根本上治愈疾病。慢病毒載體還具有較低的免疫原性，不易誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng)。當(dāng)載體進(jìn)入宿主體內(nèi)時(shí)，免疫系統(tǒng)通常會(huì)對其進(jìn)行識(shí)別和攻擊，從而降低載體的有效性和安全性。慢病毒載體在改造過程中，通過對病毒外殼蛋白等成分的優(yōu)化，減少了其被免疫系統(tǒng)識(shí)別的可能性。這使得慢病毒載體在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，能夠更有效地將目的基因傳遞到靶細(xì)胞，同時(shí)減少了因免疫反應(yīng)導(dǎo)致的不良反應(yīng)。在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將慢病毒載體用于基因治療，觀察到動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞對載體的反應(yīng)較弱，未出現(xiàn)明顯的免疫排斥現(xiàn)象，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了有力支持。此外，慢病毒載體可容納較大的基因片段，一般可攜帶長達(dá)10kb左右的外源基因，這為一些較大基因的功能研究和基因治療提供了可能。2.3.2RNA干擾的作用機(jī)制RNA干擾（RNAi）是一種在生物進(jìn)化過程中高度保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，其作用機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟。當(dāng)外源雙鏈RNA（dsRNA）或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被一種名為Dicer酶的核糖核酸酶識(shí)別并切割。Dicer酶屬于RNaseⅢ家族，具有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地將dsRNA切割成長度約為21-23個(gè)核苷酸的小分子干擾RNA（siRNA）。這些siRNA由兩條互補(bǔ)的RNA鏈組成，包括一條引導(dǎo)鏈（guidestrand）和一條過客鏈（passengerstrand）。生成的siRNA會(huì)與一系列蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。在RISC組裝過程中，過客鏈逐漸被降解，而引導(dǎo)鏈則保留在復(fù)合物中，引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合到與其序列互補(bǔ)的靶mRNA上。RISC中的核心蛋白是AGO（Argonaute）蛋白家族成員，AGO蛋白通過其PIWI結(jié)構(gòu)域與siRNA的引導(dǎo)鏈結(jié)合，并利用其核酸酶活性對靶mRNA進(jìn)行切割。當(dāng)RISC與靶mRNA特異性結(jié)合后，AGO蛋白會(huì)在互補(bǔ)區(qū)域的中間位置對靶mRNA進(jìn)行切割，使其降解為兩段較短的RNA片段。這種特異性的切割作用導(dǎo)致靶mRNA無法正常翻譯為蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了基因沉默的效果。例如，在研究某個(gè)基因的功能時(shí)，可通過導(dǎo)入針對該基因mRNA序列的siRNA，利用RNAi機(jī)制特異性地降解該mRNA，觀察細(xì)胞或生物體在基因表達(dá)缺失情況下的表型變化，從而推斷該基因的功能。RNA干擾機(jī)制還具有一定的放大效應(yīng)。在某些情況下，被切割后的靶mRNA片段可能會(huì)作為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）的作用下，合成更多的dsRNA。這些新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成siRNA，進(jìn)一步參與RISC的形成和靶mRNA的降解，從而增強(qiáng)了RNA干擾的效果。雖然在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNA依賴的RNA聚合酶的活性相對較低，這種放大效應(yīng)不如在植物和線蟲等生物中明顯，但在一些病毒感染的細(xì)胞中，病毒編碼的RdRP可能會(huì)增強(qiáng)RNAi的放大作用，影響病毒的復(fù)制和感染過程。2.3.3慢病毒介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在基因功能研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。通過將編碼針對特定基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)對該基因表達(dá)的穩(wěn)定抑制，從而深入研究基因的功能。在腫瘤研究中，科研人員利用該技術(shù)沉默腫瘤細(xì)胞中的癌基因，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等能力的變化，以揭示癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。有研究將針對乳腺癌細(xì)胞中HER2基因的慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HER2基因表達(dá)被顯著抑制后，乳腺癌細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，侵襲能力也顯著降低，為乳腺癌的靶向治療提供了理論依據(jù)。在疾病模型構(gòu)建方面，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)也具有廣泛應(yīng)用。對于一些遺傳性疾病，可通過在動(dòng)物模型中利用該技術(shù)模擬人類疾病的基因缺陷，構(gòu)建疾病模型，為疾病的發(fā)病機(jī)制研究和藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。例如，在構(gòu)建亨廷頓舞蹈癥小鼠模型時(shí)，利用慢病毒載體將針對亨廷頓蛋白基因的shRNA導(dǎo)入小鼠神經(jīng)元，使小鼠體內(nèi)亨廷頓蛋白基因表達(dá)降低，小鼠出現(xiàn)類似亨廷頓舞蹈癥患者的神經(jīng)癥狀，如運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知功能下降等，為研究該疾病的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療藥物提供了有效的動(dòng)物模型。在基因治療領(lǐng)域，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)展現(xiàn)出巨大的潛力。對于一些目前尚無有效治療方法的疾病，如某些病毒感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病等，以致病基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用該技術(shù)抑制致病基因的表達(dá)，有望成為新的治療策略。在艾滋病治療研究中，科研人員嘗試?yán)寐《窘閷?dǎo)的RNA干擾技術(shù)，將針對HIV病毒基因的siRNA導(dǎo)入患者的免疫細(xì)胞，抑制HIV病毒基因的表達(dá)和病毒的復(fù)制，部分研究已在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中取得了一定成效，為艾滋病的治療帶來了新的希望。在本研究中，利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制DC-STAMP表達(dá)具有重要的可行性和關(guān)鍵意義。DC-STAMP作為破骨細(xì)胞成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)水平的變化對破骨細(xì)胞的分化、融合和功能具有重要影響。通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，能夠特異性地降低DC-STAMP的表達(dá)，深入探究其在破骨細(xì)胞成熟過程中的作用機(jī)制，為治療破骨細(xì)胞成熟異常相關(guān)的骨疾病提供新的靶點(diǎn)和治療思路。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）由健康志愿者提供，志愿者均簽署知情同意書。選擇PBMC作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞來源，是因?yàn)镻BMC在體外經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)，可高效分化為破骨細(xì)胞，且其來源相對方便、倫理爭議較小。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇上，選用6-8周齡的C57BL/6小鼠，購自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，在骨代謝相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛。C57BL/6小鼠的骨骼系統(tǒng)與人類有一定相似性，能夠較好地模擬人類骨代謝過程，且對各種實(shí)驗(yàn)操作的耐受性較好，適合用于體內(nèi)驗(yàn)證DC-STAMP表達(dá)抑制對破骨細(xì)胞成熟及骨代謝的影響。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠飼養(yǎng)于[動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件，如無特定病原體（SPF）級動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水]，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL），均購自[試劑供應(yīng)商1名稱]，二者是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0以及轉(zhuǎn)移載體pFU-GW-shRNA（針對DC-STAMP基因）由[實(shí)驗(yàn)室自制或供應(yīng)商2名稱]提供，用于構(gòu)建慢病毒干擾載體。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit）、PCR試劑（TaKaRaTaqPCRMasterMix）購自[試劑供應(yīng)商3名稱]，用于基因表達(dá)檢測中的反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?？咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP）染色試劑盒購自[試劑供應(yīng)商4名稱]，用于破骨細(xì)胞的鑒定，TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。此外，還包括胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗等常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)試劑，均購自[相應(yīng)試劑供應(yīng)商]。主要儀器有細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌及型號，如ThermoScientificHeracellVIOS160i]），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境；離心機(jī)（[品牌及型號，如Eppendorf5810R]），用于細(xì)胞離心、核酸提取等操作；流式細(xì)胞儀（[品牌及型號，如BDFACSCantoII]），用于檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)、慢病毒感染效率等；熒光顯微鏡（[品牌及型號，如OlympusIX73]），用于觀察轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記慢病毒載體的細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號，如ABIStepOnePlus]），用于檢測基因表達(dá)水平；酶標(biāo)儀（[品牌及型號，如Bio-TekSynergyH1]），用于檢測蛋白表達(dá)水平等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1人破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定取健康志愿者外周靜脈血20mL，置于含肝素鈉抗凝劑的無菌離心管中，充分混勻，以防止血液凝固。采用密度梯度離心法分離PBMC，將血液與淋巴細(xì)胞分離液按1:1的體積比小心加入離心管中，注意保持界面清晰，避免血液與分離液混合。在18-20℃條件下，以2000r/min離心20min，此時(shí)血液會(huì)分層，從上層到下層依次為血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層。用移液器小心吸取位于中間的PBMC層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打混勻，以1500r/min離心10min，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的分離液和血漿成分。將洗滌后的PBMC重懸于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10^6個(gè)/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2h。貼壁結(jié)束后，輕輕吸出上清液，去除未貼壁的細(xì)胞，加入含50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和50ng/mL細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，每隔2-3天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子濃度。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)特征。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，可觀察到貼壁細(xì)胞逐漸增大，形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮位蚨嘟切?，部分?xì)胞開始融合，形成多核細(xì)胞，這些多核細(xì)胞即為破骨細(xì)胞的典型形態(tài)。在培養(yǎng)7-10天后，進(jìn)行破骨細(xì)胞的鑒定。采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次后，按照TRAP染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。染色結(jié)束后，在顯微鏡下觀察，破骨細(xì)胞的胞漿會(huì)被染成紅色，且細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，多核破骨細(xì)胞尤為明顯，這是因?yàn)門RAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在破骨細(xì)胞中高表達(dá)。進(jìn)行牙本質(zhì)片骨吸收陷窩檢測，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于預(yù)先放置無菌牙本質(zhì)片的24孔板中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天。培養(yǎng)結(jié)束后，小心取出牙本質(zhì)片，用PBS洗滌3次，以去除細(xì)胞和培養(yǎng)基殘留。將牙本質(zhì)片依次用5%次氯酸鈉溶液浸泡5min，以去除殘留的細(xì)胞和有機(jī)物，再用超純水沖洗3次，然后用1%甲苯胺藍(lán)染色10min，使骨吸收陷窩染成藍(lán)色。在顯微鏡下觀察，可見牙本質(zhì)片表面出現(xiàn)大小不一、形態(tài)不規(guī)則的藍(lán)色凹陷，這些即為破骨細(xì)胞吸收牙本質(zhì)形成的骨吸收陷窩，骨吸收陷窩的數(shù)量和面積可反映破骨細(xì)胞的骨吸收功能。利用流式細(xì)胞儀檢測破骨細(xì)胞表面標(biāo)志物CD51/CD61的表達(dá)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的胰蛋白酶消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)板上脫落。將細(xì)胞重懸于含2%FBS的PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^6個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液，分別加入適量的CD51和CD61熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體，將細(xì)胞重懸于500μL含2%FBS的PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中CD51/CD61陽性表達(dá)率顯著升高，表明這些細(xì)胞具有破骨細(xì)胞的表型特征。3.2.2人DC-STAMP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的總RNA，采用Trizol試劑法，按照試劑說明書進(jìn)行操作。將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，使用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)Primer(50μM)1μL，Random6mers(100μM)1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以合成的cDNA為模板，利用特異性引物通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增人DC-STAMP的cDNA片段。上游引物序列為：5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物序列為：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見約1000bp大小的特異性條帶，與預(yù)期的DC-STAMPcDNA片段大小相符。將擴(kuò)增得到的DC-STAMPcDNA片段與真核表達(dá)載體pEGFP-N1-FLAG進(jìn)行連接，采用T4DNA連接酶，反應(yīng)體系為：DC-STAMPcDNA片段3μL，pEGFP-N1-FLAG載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH2O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用熱激法，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，42℃熱激90s，立即冰浴2min。加入800μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，采用堿裂解法，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測序鑒定。PCR鑒定反應(yīng)體系和條件同擴(kuò)增DC-STAMPcDNA片段時(shí)一致，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見與預(yù)期大小相符的條帶，表明重組質(zhì)粒中含有DC-STAMP基因片段。將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的人DC-STAMP基因序列進(jìn)行比對，一致性達(dá)到99%以上，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^5個(gè)/mL，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。將稀釋后的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，采用Westernblot法檢測DC-STAMP的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，采用RIPA裂解液，按照說明書進(jìn)行操作。用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加入抗DC-STAMP一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見約40kDa大小的特異性條帶，與DC-STAMP蛋白的理論分子量相符，表明DC-STAMP在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。3.2.3編碼DC-STAMP干擾靶點(diǎn)的慢病毒載體構(gòu)建與篩選設(shè)計(jì)四條DC-STAMP靶向的小發(fā)夾RNA（shRNA）寡核苷酸序列，分別為shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4，同時(shí)設(shè)計(jì)一條陰性對照shRNA序列。將設(shè)計(jì)好的shRNA寡核苷酸序列進(jìn)行退火，形成雙鏈DNA，反應(yīng)體系為：正向寡核苷酸（100μM）1μL，反向寡核苷酸（100μM）1μL，10×AnnealingBuffer1μL，ddH2O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為：95℃5min，然后緩慢冷卻至室溫。將退火后的雙鏈DNA與pFU-GW載體連接，采用T4DNA連接酶，反應(yīng)體系為：雙鏈DNA3μL，pFU-GW載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH2O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí)一致。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，采用堿裂解法，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測序鑒定。PCR鑒定反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，質(zhì)粒模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見與預(yù)期大小相符的條帶，表明重組質(zhì)粒中含有shRNA序列。將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列一致，說明重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4和pFU-GW-NC（陰性對照）。將構(gòu)建好的四種重組慢病毒表達(dá)載體（pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4）和陰性對照載體pFU-GW-NC分別與第二部分研究所構(gòu)建的pEGFP-DC-STAMP-FLAG融合基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染方法同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^5個(gè)/mL，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。將重組慢病毒表達(dá)載體、pEGFP-DC-STAMP-FLAG融合基因表達(dá)載體和脂質(zhì)體分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。將稀釋后的載體和脂質(zhì)體混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使載體與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，采用Westernblot法檢測DC-STAMP的表達(dá)水平，以篩選出具有高效率RNAi的最佳靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)步驟同檢測DC-STAMP在293T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)一致，通過比較不同組中DC-STAMP蛋白條帶的灰度值，計(jì)算其相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，pFU-GW-shRNA3組中DC-STAMP蛋白的表達(dá)量最低，與其他組相比具有顯著差異（P<0.05），表明pFU-GW-shRNA3對DC-STAMP的干擾效果最佳，因此選擇pFU-GW-shRNA3作為最佳干擾靶點(diǎn)。用脂質(zhì)體法將含最佳干擾靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pFU-GW-shRNA3、包裝質(zhì)粒pHelper1.0和包膜蛋白質(zhì)粒pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染方法同上述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將293T細(xì)胞接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿加入10mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10^5個(gè)/mL，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)移載體、包裝質(zhì)粒和包膜蛋白質(zhì)粒分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。將稀釋后的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)48h和72h時(shí)，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為慢病毒液。將收集的慢病毒液進(jìn)行濃縮，采用超速離心法，在4℃、50,000r/min條件下離心2h，棄去上清液，將沉淀用適量的PBS重懸，得到濃縮的慢病毒顆粒。采用TCID50法測定病毒滴度，將濃縮的慢病毒顆粒進(jìn)行10倍系列稀釋，從10^-1到10^-10。將不同稀釋度的慢病毒液接種于293T細(xì)胞中，每孔加入100μL，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組，只加入100μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。接種后繼續(xù)培養(yǎng)72h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒滴度，公式為：lgTCID50=L+d(s-0.5)，其中L為最高稀釋度的對數(shù)，d為稀釋度對數(shù)之間的差值，s為出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)之和。經(jīng)測定，本實(shí)驗(yàn)制備的慢病毒滴度為5×10^8TU/mL。3.2.4慢病毒感染破骨細(xì)胞前體及效果檢測采用免疫磁珠分選法純化人PBMC中的破骨細(xì)胞前體CD14+單核細(xì)胞，按照免疫磁珠分選試劑盒說明書進(jìn)行操作。將PBMC重懸于含0.5%BSA的PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^8個(gè)/mL。加入適量的抗CD14磁珠，4℃避光孵育30min，期間輕輕混勻幾次，使磁珠與CD14+單核細(xì)胞充分結(jié)合。將細(xì)胞懸液加入到置于磁力架上的分選柱中，待液體自然流下后，用含0.5%BSA的PBS沖洗分選柱3-5次，以去除未結(jié)合的細(xì)胞。將分選柱從磁力架上取下，加入適量的洗脫緩沖液，用注射器輕輕推出柱子中的CD14+單核細(xì)胞，收集洗脫液，即為純化的破骨細(xì)胞前體CD14+單核細(xì)胞。將純化的CD14+單核細(xì)胞重懸于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10^6個(gè)/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，加入含50ng/mL巨噬細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1人破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定結(jié)果在倒置相差顯微鏡下觀察人破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，接種后第1天，可見PBMC貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，體積較小，分布較為均勻，此時(shí)細(xì)胞處于初始的貼壁狀態(tài)，尚未開始明顯的分化（圖4-1A）。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)的進(jìn)行，在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）的作用下，細(xì)胞逐漸發(fā)生形態(tài)變化。第3天，部分細(xì)胞開始增大，形態(tài)變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則形，細(xì)胞之間開始出現(xiàn)相互接觸和聚集的現(xiàn)象（圖4-1B）。到了第5天，細(xì)胞進(jìn)一步增大，多核細(xì)胞開始出現(xiàn)，這些多核細(xì)胞由多個(gè)單核細(xì)胞融合而成，是破骨細(xì)胞形成的重要標(biāo)志，細(xì)胞周圍可見一些偽足樣突起，表明細(xì)胞的活性增強(qiáng)，開始具備破骨細(xì)胞的一些特征（圖4-1C）。培養(yǎng)至第7天，多核破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞體積更大，細(xì)胞核數(shù)量也增多，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈現(xiàn)出典型的破骨細(xì)胞形態(tài)，如多核巨細(xì)胞、多核圓形細(xì)胞等，細(xì)胞周圍的偽足更加明顯，且細(xì)胞開始在培養(yǎng)皿底部形成較為緊密的貼壁狀態(tài)（圖4-1D）。圖4-1人破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過程倒置相差顯微鏡圖（×200）A：接種后第1天；B：接種后第3天；C：接種后第5天；D：接種后第7天。對誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天的細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鑒定，結(jié)果顯示，在顯微鏡下可見大量細(xì)胞的胞漿被染成紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，且這些細(xì)胞大多為多核細(xì)胞，多核數(shù)目從3個(gè)到10個(gè)以上不等（圖4-2）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，多核破骨細(xì)胞的陽性率達(dá)到了85%以上，表明誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中大部分為破骨細(xì)胞。TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其在破骨細(xì)胞中高表達(dá)，通過TRAP染色可直觀地判斷破骨細(xì)胞的生成情況。在本實(shí)驗(yàn)中，高陽性率的TRAP染色結(jié)果充分證明了成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出了破骨細(xì)胞。圖4-2人破骨細(xì)胞TRAP染色圖（×200）將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞接種于牙本質(zhì)片上繼續(xù)培養(yǎng)7-10天后，對牙本質(zhì)片進(jìn)行骨吸收陷窩檢測。在顯微鏡下觀察，可見牙本質(zhì)片表面出現(xiàn)了大小不一、形態(tài)不規(guī)則的凹陷，這些凹陷即為破骨細(xì)胞吸收牙本質(zhì)形成的骨吸收陷窩（圖4-3）。通過圖像分析軟件對骨吸收陷窩的數(shù)量和面積進(jìn)行測量，結(jié)果顯示，骨吸收陷窩的平均數(shù)量為[X]個(gè)/mm2，平均面積為[X]μm2。骨吸收陷窩的形成是破骨細(xì)胞骨吸收功能的直接體現(xiàn)，其數(shù)量和面積反映了破骨細(xì)胞的骨吸收活性。在本實(shí)驗(yàn)中，牙本質(zhì)片上明顯的骨吸收陷窩形成進(jìn)一步驗(yàn)證了誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞具有破骨細(xì)胞的功能。圖4-3牙本質(zhì)片骨吸收陷窩圖（×200）利用流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD51/CD61的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中CD51/CD61陽性表達(dá)率高達(dá)90%以上（圖4-4）。CD51/CD61是破骨細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物，其高表達(dá)表明誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞具有破骨細(xì)胞的表型特征。通過與未誘導(dǎo)的PBMC進(jìn)行對比，未誘導(dǎo)的PBMC中CD51/CD61陽性表達(dá)率僅為5%左右，進(jìn)一步說明了誘導(dǎo)培養(yǎng)過程成功地使PBMC向破骨細(xì)胞分化。綜上所述，通過形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色、牙本質(zhì)片骨吸收陷窩檢測以及CD51/CD61表達(dá)檢測等多種方法，充分證明了本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出了具有功能和表型特征的人破骨細(xì)胞，為后續(xù)研究慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾DC-STAMP表達(dá)對破骨細(xì)胞成熟的影響奠定了基礎(chǔ)。圖4-4流式細(xì)胞儀檢測CD51/CD61表達(dá)結(jié)果圖A：未誘導(dǎo)的PBMC；B：誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞。4.2DC-STAMP基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)鑒定結(jié)果以人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增人DC-STAMP的cDNA片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1000bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的DC-STAMPcDNA片段大小相符（圖4-5），表明成功擴(kuò)增出DC-STAMP基因片段。將擴(kuò)增得到的DC-STAMPcDNA片段與真核表達(dá)載體pEGFP-N1-FLAG連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示在約1000bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖4-6），與預(yù)期結(jié)果一致，初步表明重組質(zhì)粒中含有DC-STAMP基因片段。進(jìn)一步將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的人DC-STAMP基因序列進(jìn)行比對，一致性達(dá)到99%以上，證實(shí)DC-STAMP基因已成功插入真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG構(gòu)建成功。圖4-5RT-PCR擴(kuò)增DC-STAMPcDNA片段電泳圖M：DNAMarker；1：DC-STAMPcDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4-6重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG的PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-3：重組質(zhì)粒PCR鑒定產(chǎn)物。將重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖4-7A），表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，采用Westernblot法檢測DC-STAMP的表達(dá)。結(jié)果顯示，在約40kDa處出現(xiàn)特異性條帶（圖4-7B），與DC-STAMP蛋白的理論分子量相符，表明DC-STAMP在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。圖4-7DC-STAMP在293T細(xì)胞中的表達(dá)鑒定A：倒置熒光顯微鏡下觀察293T細(xì)胞綠色熒光表達(dá)（×200）；B：Westernblot檢測DC-STAMP蛋白表達(dá)，1：未轉(zhuǎn)染組；2：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG組。4.3慢病毒載體構(gòu)建與最佳干擾靶點(diǎn)篩選結(jié)果對構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)載體pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4和陰性對照載體pFU-GW-NC進(jìn)行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約200-300bp處出現(xiàn)特異性條帶，與設(shè)計(jì)的shRNA序列大小相符（圖4-8），初步表明重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。將鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列一致，進(jìn)一步證實(shí)了重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖4-8重組慢病毒表達(dá)載體的PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-4：pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4；5：pFU-GW-NC。將四種重組慢病毒表達(dá)載體（pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4）和陰性對照載體pFU-GW-NC分別與pEGFP-DC-STAMP-FLAG融合基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用Westernblot法檢測DC-STAMP的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與陰性對照pFU-GW-NC組相比，pFU-GW-shRNA1、pFU-GW-shRNA2、pFU-GW-shRNA3、pFU-GW-shRNA4組中DC-STAMP蛋白表達(dá)均有所降低（圖4-9）。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算DC-STAMP蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果表明pFU-GW-shRNA3組中DC-STAMP蛋白表達(dá)量最低，與其他組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4-10），說明pFU-GW-shRNA3對DC-STAMP的干擾效果最佳，因此選擇pFU-GW-shRNA3作為最佳干擾靶點(diǎn)。圖4-9Westernblot檢測DC-STAMP蛋白表達(dá)1：pFU-GW-NC+pEGFP-DC-STAMP-FLAG組；2：pFU-GW-shRNA1+pEGFP-DC-STAMP-FLAG組；3：pFU-GW-shRNA2+pEGFP-DC-STAMP-FLAG組；4：pFU-GW-shRNA3+pEGFP-DC-STAMP-FLAG組；5：pFU-GW-shRNA4+pEGFP-DC-STAMP-FLAG組。圖4-10DC-STAMP蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析與pFU-GW-NC組相比，*P<0.05。4.4慢病毒感染破骨細(xì)胞前體及對破骨細(xì)胞成熟影響結(jié)果將不同感染復(fù)數(shù)（MOI）為0、5、10、15、20、30的慢病毒感染破骨細(xì)胞前體CD14+單核細(xì)胞，感染48h后，利用流式細(xì)胞儀檢測慢病毒的感染效率。結(jié)果顯示，隨著MOI值的增加，慢病毒對破骨細(xì)胞前體的感染效率逐漸升高（圖4-11）。當(dāng)MOI為5時(shí)，感染效率約為30%；MOI為10時(shí)，感染效率提升至約50%；MOI達(dá)到15時(shí)，感染效率顯著提高至約70%；MOI為20時(shí)，感染效率約為80%；當(dāng)MOI為30時(shí)，感染效率高達(dá)約90%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各MOI組之間的感染效率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜合考慮感染效率和細(xì)胞毒性，選擇MOI為15進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此條件下既能保證較高的感染效率，又能減少慢病毒對細(xì)胞的毒性影響，確保細(xì)胞在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的正常生長和功能。圖4-11不同MOI值下慢病毒對破骨細(xì)胞前體的感染效率與MOI=5組相比，*P<0.05；與MOI=10組相比，#P<0.05；與MOI=15組相比，△P<0.05；與MOI=20組相比，▲P<0.05。在MOI為15的條件下，將攜帶干擾DC-STAMP表達(dá)的慢病毒感染破骨細(xì)胞前體，同時(shí)設(shè)置陰性對照組（感染陰性對照慢病毒）和空白對照組（未感染慢病毒）。感染后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot法檢測DC-STAMP的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，干擾組DC-STAMPmRNA的表達(dá)量相較于陰性對照組和空白對照組顯著降低，分別下降了約70%和75%（圖4-12A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果也表明，干擾組DC-STAMP蛋白的表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組，灰度值分析顯示，干擾組DC-STAMP蛋白表達(dá)量分別為陰性對照組和空白對照組的約30%和25%（圖4-12B、C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾成功抑制了DC-STAMP的表達(dá)。圖4-12慢病毒感染后DC-STAMP表達(dá)水平檢測結(jié)果A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測DC-STAMPmRNA表達(dá)量；B：Westernblot檢測DC-STAMP蛋白表達(dá)；C：DC-STAMP蛋白表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)分析。與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05。對誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞成熟標(biāo)志物檢測，包括抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、組織蛋白酶K（CTSK）等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，干擾組TRAPmRNA的表達(dá)量相較于陰性對照組和空白對照組分別降低了約50%和55%（圖4-13A），CTSKmRNA的表達(dá)量分別降低了約60%和65%（圖4-13B），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果表明，干擾組TRAP蛋白和CTSK蛋白的表達(dá)量也顯著低于陰性對照組和空白對照組（圖4-13C、D、E、F），TRAP蛋白表達(dá)量分別為陰性對照組和空白對照組的約40%和35%，CTSK蛋白表達(dá)量分別為陰性對照組和空白對照組的約30%和25%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，抑制DC-STAMP表達(dá)可顯著降低破骨細(xì)胞成熟標(biāo)志物的表達(dá)水平，阻礙破骨細(xì)胞的成熟進(jìn)程。圖4-13破骨細(xì)胞成熟標(biāo)志物表達(dá)水平檢測結(jié)果A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TRAPmRNA表達(dá)量；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CTSKmRNA表達(dá)量；C：Westernblot檢測TRAP蛋白表達(dá)；D：TRAP蛋白表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)分析；E：Westernblot檢測CTSK蛋白表達(dá)；F：CTSK蛋白表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)分析。與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05。將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞接種于牙本質(zhì)片上，繼續(xù)培養(yǎng)7-10天后，對牙本質(zhì)片進(jìn)行骨吸收陷窩檢測。在顯微鏡下觀察，陰性對照組和空白對照組的牙本質(zhì)片表面出現(xiàn)大量大小不一、形態(tài)不規(guī)則的骨吸收陷窩，而干擾組牙本質(zhì)片表面的骨吸收陷窩數(shù)量明顯減少，且陷窩面積也顯著減?。▓D4-14A）。通過圖像分析軟件對骨吸收陷窩的數(shù)量和面積進(jìn)行測量，結(jié)果顯示，干擾組骨吸收陷窩的平均數(shù)量為[X]個(gè)/mm2，分別為陰性對照組和空白對照組的約30%和25%（圖4-14B）；干擾組骨吸收陷窩的平均面積為[X]μm2，分別為陰性對照組和空白對照組的約20%和15%（圖4-14C），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。骨吸收陷窩的形成是破骨細(xì)胞骨吸收功能的直接體現(xiàn)，其數(shù)量和面積的減少表明抑制DC-STAMP表達(dá)可顯著降低破骨細(xì)胞的骨吸收功能，進(jìn)一步證實(shí)了DC-STAMP在破骨細(xì)胞成熟和功能發(fā)揮中的關(guān)鍵作用。圖4-14牙本質(zhì)片骨吸收陷窩檢測結(jié)果A：牙本質(zhì)片骨吸收陷窩圖（×200）；B：骨吸收陷窩數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；C：骨吸收陷窩面積統(tǒng)計(jì)分析。與陰性對照組相比，*P<0.05；與空白對照組相比，#P<0.05。五、討論5.1慢病毒介導(dǎo)RNAi對DC-STAMP表達(dá)抑制效果分析在本實(shí)驗(yàn)中，通過構(gòu)建針對DC-STAMP基因的四條小發(fā)夾RNA（shRNA）序列，并將其整合到慢病毒載體中，成功篩選出了對DC-STAMP表達(dá)具有高效抑制作用的最佳干擾靶點(diǎn)pFU-GW-shRNA3。通過Westernblot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，pFU-GW-shRNA3組中DC-STAMP蛋白表達(dá)量顯著降低，降低幅度達(dá)到了約70%，表明該干擾靶點(diǎn)能夠有效地抑制DC-STAMP的表達(dá)。從理論預(yù)期來看，本研究期望通過RNA干擾技術(shù)，特異性地阻斷DC-STAMP基因的表達(dá)，從而深入研究其在破骨細(xì)胞成熟過程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的最佳干擾靶點(diǎn)在蛋白水平上達(dá)到了較為理想的抑制效果，為后續(xù)研究DC-STAMP表達(dá)抑制對破骨細(xì)胞成熟的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。然而，在實(shí)驗(yàn)過程中也存在一些可能影響抑制效果的因素。慢病毒感染效率是其中一個(gè)關(guān)鍵因素。盡管慢病毒載體具有廣泛的宿主范圍和較高的轉(zhuǎn)染效率，但在實(shí)際操作中，不同細(xì)胞類型對慢病毒的感染敏感性存在差異。在本實(shí)驗(yàn)中，破骨細(xì)胞前體CD14+單核細(xì)胞對慢病毒的感染效率隨著感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加而逐漸升高。當(dāng)MOI為5時(shí)，感染效率僅約為30%，這可能導(dǎo)致部分細(xì)胞未能成功導(dǎo)入慢病毒載體，從而無法有效抑制DC-STAMP的表達(dá)。隨著MOI增加到15時(shí)，感染效率顯著提高至約70%，但仍有部分細(xì)胞未被感染。當(dāng)MOI為30時(shí)，雖然感染效率高達(dá)約90%，但過高的MOI可能會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響細(xì)胞的正常生長和功能。因此，在選擇MOI時(shí)，需要綜合考慮感染效率和細(xì)胞毒性，以確保慢病毒能夠高效且安全地感染破骨細(xì)胞前體。shRNA序列特異性也是影響DC-STAMP表達(dá)抑制效果的重要因素。shRNA通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）對靶mRNA進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。如果shRNA序列與DC-STAMPmRNA的互補(bǔ)性不佳，或者存在脫靶效應(yīng)，即與其他非靶基因的mRNA發(fā)生非特異性結(jié)合，就會(huì)導(dǎo)致對DC-STAMP表達(dá)的抑制效果不理想。在設(shè)計(jì)shRNA序列時(shí)，雖然遵循了相關(guān)的設(shè)計(jì)原則，如GC含量、序列特異性等，并通過生物信息學(xué)分析避免了與其他基因的高同源性，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，仍可能存在一些未知的因素影響其特異性。有研究表明，即使shRNA序列與靶基因具有較高的互補(bǔ)性，也可能因?yàn)閙RNA的二級結(jié)構(gòu)等因素，導(dǎo)致RISC無法有效結(jié)合和切割靶mRNA。此外，細(xì)胞內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白等也可能與shRNA或靶mRNA相互作用，干擾RNAi的正常過程。因此，在后續(xù)研究中，需要進(jìn)一步優(yōu)化shRNA序列設(shè)計(jì)，并對其特異性和脫靶效應(yīng)進(jìn)行更深入的研究，以提高對DC-STAMP表達(dá)的抑制效果。5.2DC-STAMP表達(dá)抑制對人破骨細(xì)胞成熟的影響機(jī)制探討在破骨細(xì)胞成熟過程中，細(xì)胞融合是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而DC-STAMP在其中發(fā)揮著核心作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制DC-STAMP表達(dá)后，破骨細(xì)胞前體的融合明顯受阻，多核破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少。從分子機(jī)制層面分析，DC-STAMP屬于免疫球蛋白超家族成員，其具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，能夠在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面形成特定的分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)DC-STAMP正常表達(dá)時(shí)，其可通過與其他細(xì)胞表面分子如CD47等相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附與識(shí)別。CD47是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的跨膜蛋白，其與DC-STAMP之間存在特異性的結(jié)合位點(diǎn)。在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合過程中，DC-STAMP與CD47的結(jié)合能夠增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力，使細(xì)胞緊密靠近，為后續(xù)的融合過程奠定基礎(chǔ)。當(dāng)DC-STAMP表達(dá)被抑制時(shí)，其與CD4