①引物的選擇②引物的序列推斷③引物的裝飾引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的設(shè)計(jì)：引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸①引物的5’端能與模板鏈的3’端進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)②引物之間或引物內(nèi)部，不能發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)（2023年山東高考）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物

F2和R1或F1與R2

。

1．為使甘藍(lán)具有抗除草劑能力，科研人員將除草劑草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。(1)草甘膦抗性基因一條鏈的兩端序列如下，采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增草甘膦抗性基因，應(yīng)選用的引物組合為（

）A．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TCTGTTGAAT-3′B．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TAAGTTGTCT-3′C．5′-ATTCAACAGA-3′和5′-ATCATCCAAG-3′D．5′-ATTCAACAGA-3′和5′-GAACCTACTA-3′答案：2.四種引物:引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點(diǎn))是可以互補(bǔ)的。3.流程:(1)分別利用引物1和2，引物3和4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過(guò)引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起。(2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。(3)用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。(4)通過(guò)測(cè)序可以檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。3.人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解血栓,但大劑量使用會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血。如果將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸,能顯著降低出血副作用。如圖是通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)獲取t-PA改良基因的過(guò)程。(圖中重疊延伸PCR過(guò)程中,引物a