1旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)方法本文件描述了旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)總則和流程、田間調(diào)查與樣本采集、土壤健康評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定和篩選、土壤健康指數(shù)計(jì)算等內(nèi)容。本文件適用于旱地農(nóng)田黑土的自然健康評(píng)價(jià)、障礙因子識(shí)別與土壤健康管理。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T32720土壤微生物呼吸的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法GB/T39228土壤微生物生物量的測(cè)定熏蒸提取法GB/T41223土壤質(zhì)量硝化作用潛勢(shì)的測(cè)定和硝化作用的抑制氧化銨快速試驗(yàn)GB/T42487土壤質(zhì)量土壤硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測(cè)定氯化鉀溶液浸提手工分析法HJ613土壤干物質(zhì)和水分的測(cè)定重量法HJ704土壤有效磷的測(cè)定碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法HJ802土壤電導(dǎo)率的測(cè)定電極法HJ889土壤陽(yáng)離子交換量的測(cè)定三氯化六氨合鈷浸提-分光光度法HJ962土壤pH值的測(cè)定電位法HJ974土壤和沉積物11種元素的測(cè)定堿熔-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法NY/T296土壤全量鈣、鎂、鈉的測(cè)定NY/T889土壤速效鉀和緩效鉀含量的測(cè)定NY/T1121.1土壤檢測(cè)第一部分：土壤樣品的采集、處理和貯存2NY/T1121.4土壤檢測(cè)第4部分：土壤容重的測(cè)定NY/T1121.22土壤檢測(cè)第22部分：土壤田間持水量的測(cè)定-環(huán)刀法T/NAIA012土壤磷酸酶活性的測(cè)定磷酸苯二鈉比色法T/NAIA0280土壤中全磷、全鉀及氟化物的測(cè)定氫氧化鈉熔融法T/JAASS144土壤微生物胞外酶活性測(cè)定熒光法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1黑土Blacksoil黑土是指以黑色或暗黑色腐殖質(zhì)表土層為標(biāo)志、具有高有機(jī)碳含量的土壤。本標(biāo)準(zhǔn)中的黑土泛指我國(guó)東北黑土區(qū)分布的以黑色或暗黑色腐殖質(zhì)表土層為特征、富含有機(jī)碳的土壤，即包括在該區(qū)域分布的典型黑土和其他土壤類型。3.2土壤健康Soilhealth土壤健康是指土壤作為一個(gè)動(dòng)態(tài)生命系統(tǒng)持續(xù)維持植物、動(dòng)物和人類生命活動(dòng)功能的能力。本標(biāo)準(zhǔn)中土壤健康評(píng)價(jià)主要針對(duì)土壤自然健康（Soilattributehealth）而言，指在現(xiàn)有土地利用和管理背景下，由土壤固有的物理、化學(xué)和生物等自然屬性所體現(xiàn)的土壤健康狀況，不包括對(duì)人為耕作和管理等的評(píng)價(jià)。4土壤健康評(píng)價(jià)流程土壤健康評(píng)價(jià)流程包括以下4個(gè)環(huán)節(jié)1）土樣采集，根據(jù)評(píng)價(jià)區(qū)域面積，確定田間取樣布點(diǎn)方案，樣點(diǎn)布設(shè)兼顧代表性和經(jīng)濟(jì)可行性，采用統(tǒng)一方法，在同一時(shí)間段完成樣品采集與保存；（2）指標(biāo)篩選，采樣統(tǒng)一方法測(cè)定土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)，獲取備選指標(biāo)數(shù)據(jù)集。參考康奈爾土壤健康評(píng)價(jià)體系（ComprehensiveAssessmentofSoilHealth,CASH），采用主成分分析結(jié)合綜合3載荷值和相關(guān)性分析，篩選建立最小數(shù)據(jù)集3）指標(biāo)賦分與整合，采用累積概率分布函數(shù)，對(duì)指標(biāo)測(cè)定值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并賦分，進(jìn)一步計(jì)算各指標(biāo)得分均值，得到土壤健康指數(shù)4）驗(yàn)證與優(yōu)化：綜合專家意見(jiàn)與用戶對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果的滿意度和意見(jiàn)反饋，對(duì)最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)選取及評(píng)分函數(shù)進(jìn)行修訂，并對(duì)土壤健康指數(shù)進(jìn)行迭代計(jì)算與優(yōu)化。流程圖如下：圖1旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)流程5田間調(diào)查與樣本采集5.1樣點(diǎn)布設(shè)與田間調(diào)查采取40×40km網(wǎng)格化布點(diǎn)，網(wǎng)格盡量覆蓋不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)網(wǎng)格根據(jù)作物類型分布選取6-9個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)間相距3-5km千米左右，保證每種作物類型有4個(gè)以上田塊重復(fù)。記錄樣點(diǎn)地理信息（包括經(jīng)緯度、海拔、坡度等）、土壤類型、作物類型、長(zhǎng)勢(shì)、病害情況等，并向當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶了解施肥和耕作管理、種植歷史等信息。5.2土壤樣品采集土壤樣品采集于作物旺盛生長(zhǎng)期（8月中旬）進(jìn)行。采用五點(diǎn)采樣法，于作物行內(nèi)兩株作物之間采集土壤樣本，取樣深度統(tǒng)一為15cm。（對(duì)于土壤采集的技術(shù)細(xì)節(jié)，可參考NY/T1121.1的規(guī)定執(zhí)5.3樣品前處理與保存4樣品經(jīng)去除可見(jiàn)根系和石礫、過(guò)2mm篩后，分裝為三份：一份（約500g）于4℃冷藏，供土壤理化和生物性質(zhì)測(cè)定；一份（約100g）于-80℃或-20℃冰箱保存（如在-20℃下保存，但建議相關(guān)分析在6個(gè)月內(nèi)完成），用于DNA提??；其余部分（約200g）進(jìn)行風(fēng)干保存。6土壤健康評(píng)價(jià)備選指標(biāo)確定參考康奈爾土壤健康評(píng)價(jià)體系（CASH）、相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合專家意見(jiàn)，本標(biāo)準(zhǔn)確定土壤健康評(píng)價(jià)備選指標(biāo)共46項(xiàng)（表1）。表1旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)備選指標(biāo)指標(biāo)屬性具體指標(biāo)物理容重、田間持水量、質(zhì)地（粘粒、粉粒、砂粒含量）、電導(dǎo)率化學(xué)酸堿度、總碳、有機(jī)碳、總氮、碳氮比、可溶性有機(jī)氮、可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、陽(yáng)離子交換量、微量元素含量（鐵、鎂、鋁、鈣、鈉、錳）、總磷、總鉀、有效磷、速效鉀生物微生物量碳、微生物量氮、微生物量碳氮比、基礎(chǔ)呼吸速率、呼吸熵、土壤酶活性(β-葡萄糖苷酶活性、磷酸酶活性、脲酶活性、固氮酶活性）、硝化潛勢(shì)、反硝化潛勢(shì)、細(xì)菌、真菌及原生生物群落的α-多樣性指數(shù)（Shannon、Chao1）、β-多樣性（NMDS1）注：在樣本量較大的情況下，首先選擇約15%的代表性樣品進(jìn)行46項(xiàng)指標(biāo)的分析測(cè)定，通過(guò)主成分分析、相關(guān)分析并結(jié)合文獻(xiàn)資料整理，初步篩選出了32項(xiàng)指標(biāo)（表1中加黑指標(biāo)）。在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量，對(duì)約50%的樣品進(jìn)行32項(xiàng)指標(biāo)的分析測(cè)定，進(jìn)一步通過(guò)主成分分析和相關(guān)分析等，結(jié)合專家咨詢決策，最終篩選出最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)用于土壤健康評(píng)價(jià)。7.指標(biāo)測(cè)定7.1土壤物理指標(biāo)土壤物理指標(biāo)包括容重、田間持水量、電導(dǎo)率、土壤質(zhì)地（粘粒、粉粒與砂粒含量），共4項(xiàng)。容重測(cè)定按NY/T1121.4，田間持水量測(cè)定按NY/T1121.22，電導(dǎo)率按HJ802，土壤質(zhì)地測(cè)定按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。57.2土壤化學(xué)指標(biāo)土壤化學(xué)指標(biāo)包括酸堿度、總碳、有機(jī)碳、總氮、碳氮比、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、陽(yáng)離子交換量、鐵、鎂、鋁、鈣、鈉、錳元素含量、總磷、總鉀、速效磷、速效鉀，共19項(xiàng)。土壤酸堿度測(cè)定按HJ962，機(jī)碳含量按《土壤中有機(jī)碳的測(cè)定燃燒法》（征求意見(jiàn)稿）的規(guī)定執(zhí)行，土壤總碳、總氮含量按《土壤中總碳和有機(jī)質(zhì)的測(cè)定元素分析儀法》（征求意見(jiàn)稿）的規(guī)定執(zhí)行。碳氮比按公式（1）計(jì)式中：C/N——土壤碳氮比；TC——土壤總碳含量，單位為克每千克（gkg-1TN——土壤總氮含量，單位為克每千克（gkg-1）。土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量測(cè)定按GB/T42487的規(guī)定執(zhí)行，陽(yáng)離子交換量按HJ889，鐵、鎂、鋁、鈣、錳元素含量按HJ974，鈉含量按NY/T296，總磷與總鉀含量按T/NAIA0280，速效磷含量按HJ704，速效鉀含量按NY/T889的規(guī)定執(zhí)行。7.3土壤生物指標(biāo)土壤生物指標(biāo)包括微生物量碳、微生物量氮、微生物量碳氮比、基礎(chǔ)呼吸速率、呼吸熵、β-葡萄糖苷酶活性、磷酸酶活性、脲酶活性、固氮酶活性、反硝化酶活性、硝化潛勢(shì)、細(xì)菌、真菌及原生生物的α-多樣性指數(shù)（Shannon、Chao1）和β-多樣性（NMDS1）共20項(xiàng)。微生物量碳（MBC）、微生物量氮（MBN）測(cè)定按GB/T39228的規(guī)定執(zhí)行，土壤基礎(chǔ)呼吸速率（SBR）按GB/T32720的規(guī)定執(zhí)行。微生物量碳氮比按公式（2）計(jì)算，呼吸熵（qCO2）按公式（3）計(jì)算。式中：6MBC/MBN——微生物量碳氮比；MBC——土壤微生物碳含量，單位為毫克每千克（mgkg-1MBN——土壤微生物氮含量，單位為毫克每千克（mgkg-1）。qCO2=SBR/MBC（3）式中：qCO2——呼吸熵，單位為微克每毫克每小時(shí)(μgmg-1h-1)SBR——土壤基礎(chǔ)呼吸速率，單位為微克每千克每小時(shí)(μgkg-1h-1）；MBC——土壤微生物碳，單位為毫克每千克（mgkg-1）。β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定按T/JAASS144的規(guī)定執(zhí)行，磷酸酶活性測(cè)定按T/NAIA012，脲酶活性測(cè)定按附錄B的規(guī)定執(zhí)行，固氮酶活性的測(cè)定按附錄C的規(guī)定執(zhí)行，反硝化酶活性的測(cè)定按附錄D的規(guī)定執(zhí)行，硝化潛勢(shì)按GB/T41223的規(guī)定執(zhí)行。細(xì)菌、真菌及原生生物的α-多樣性指數(shù)（Shannon、Chao1）和β-多樣性（NMDS1）測(cè)定按附錄E的規(guī)定執(zhí)行。8.最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)篩選8.1主成分分析對(duì)上述指標(biāo)數(shù)據(jù)做主成分分析，提取特征值≥1的主成分。統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)在每個(gè)主成分上的載荷，選出載荷絕對(duì)值≥0.5的指標(biāo)，納入后續(xù)分析。8.2綜合載荷計(jì)算通過(guò)計(jì)算各指標(biāo)在所有主成分上的綜合載荷（公式（4）），以表征指標(biāo)在主成分多維空間中的信息貢獻(xiàn)度。綜合載荷值越大，表明該指標(biāo)的信息量越全面。據(jù)此，選取綜合載荷值最大的前40%的指標(biāo)，構(gòu)建最小數(shù)據(jù)集。式中：7Nik——第i個(gè)變量在特征值≥1的前k個(gè)主成分上的綜合載荷值；Uik——第i個(gè)變量在第k個(gè)主成分上的載荷；Λk——第k個(gè)主成分的特征值。8.3相關(guān)性分析分析綜合載荷前40%指標(biāo)間的相關(guān)性，并剔除與綜合載荷值最大值指標(biāo)相關(guān)度大于0.6的指標(biāo)，最終從各主成分中確定一組非冗余核心指標(biāo)，構(gòu)成最小數(shù)據(jù)集。8.4旱地農(nóng)田黑土健康最小數(shù)據(jù)集經(jīng)過(guò)上述分析，篩選出13項(xiàng)土壤健康評(píng)價(jià)最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)，包括容重、田間持水量、電導(dǎo)率、酸堿度、有機(jī)碳、全氮、可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮、微生物量碳、微生物量氮、微生物量碳氮比、呼吸速率和呼吸熵。結(jié)合專家意見(jiàn)咨詢和決策，最終確定10項(xiàng)指標(biāo)納入旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)最小數(shù)據(jù)集。表2旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)屬性具體指標(biāo)物理容重田間持水量粘粒含量砂粒含量化學(xué)酸堿度有機(jī)碳含量生物微生物量碳基礎(chǔ)呼吸速率呼吸熵9土壤健康指數(shù)計(jì)算9.1指標(biāo)賦分9.1.1評(píng)分函數(shù)類型確定8參考康奈爾土壤健康評(píng)價(jià)體系（CASH）、相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合專家意見(jiàn)，確定每個(gè)指標(biāo)的函數(shù)類型，即“越多越好型”、“越少越好型”或“中間最優(yōu)型”（圖2）。圖2旱地農(nóng)田黑土健康評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)分函數(shù)類型表3旱地農(nóng)田黑土健康最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)評(píng)分函數(shù)類型土壤健康指標(biāo)評(píng)分函數(shù)類型公式物理指標(biāo)容重中間最優(yōu)型得分=100*CND(μ,σ),x<閾值;得分=100*[1-CND(μ,σ)],x>閾值田間持水量越多越好得分=100*CND(μ,σ)粘粒含量(<40%)越多越好得分=100*CND(μ,σ)粘粒含量(>40%)越少越好得分=100*[1-CND(μ,σ)]砂粒含量越少越好得分=100*[1-CND(μ,σ)]電導(dǎo)率<200us.cm-1越多越好得分=100*CND(μ,σ)電導(dǎo)率>200us.cm-1越少越好得分=100*[1-CND(μ,σ)]化學(xué)指標(biāo)酸堿度中間最優(yōu)型得分=100*CND(μ,σ),x<閾值;有機(jī)碳含量越多越好得分=100*[1-CND(μ,σ)],x>閾值得分=100*CND(μ,σ)生物指標(biāo)微生物量碳越多越好得分=100*CND(μ,σ)基礎(chǔ)呼吸速率越多越好得分=100*CND(μ,σ)呼吸熵越少越好得分=100*[1-CND(μ,σ)]99.1.2評(píng)分函數(shù)建立獲取每個(gè)指標(biāo)全部測(cè)定數(shù)據(jù)的高斯分布參數(shù)（平均值和標(biāo)準(zhǔn)差），根據(jù)上述確定的評(píng)分函數(shù)類型（即“越多越好型”、“越少越好型”、“中間最優(yōu)型”以得到各指標(biāo)的累積概率分布函數(shù)（CumulativeNormalDistribution,CND公式（5觀測(cè)值對(duì)應(yīng)的概率值（p）乘以100即為無(wú)量綱賦分值。p=f(x,μ（5）式中：p（介于0到1）——觀測(cè)變量值x落在區(qū)間內(nèi)（+∞,-∞)某一位置的概率值；μ——指標(biāo)平均值；σ——為指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差。9.2土壤健康指數(shù)計(jì)算采用等權(quán)重計(jì)算土壤健康指數(shù)（Soilhealthindex），即各指標(biāo)得分均值為土壤健康指數(shù)。即采樣公式（6）soilhealthindex=Σ(scoreBD+scorewHC+scoreClay+scoresand+scoreEC+scorepH+scores0C+scoreMBC+scoreResp+scoreqC02)（6）式中：Soilhealthindex——土壤健康指數(shù)；ScoreBD——土壤容重得分；ScoreWHC——土壤田間持水量得分；ScoreClay——土壤黏粒含量得分；ScoreSand——土壤砂粒含量得分；ScoreEC——土壤電導(dǎo)率得分；ScorepH——土壤酸堿度得分；ScoreSOC——土壤有機(jī)碳含量得分；ScoreMBC——土壤微生物量碳得分；ScoreResp——土壤基礎(chǔ)呼吸速率得分；ScoreqCO2——土壤呼吸熵得分。邀請(qǐng)專家和農(nóng)戶對(duì)土壤健康評(píng)價(jià)的初步結(jié)果進(jìn)行評(píng)議，根據(jù)其反饋意見(jiàn)，對(duì)最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)選取及評(píng)分函數(shù)進(jìn)行針對(duì)性修訂，并對(duì)土壤健康指數(shù)進(jìn)行迭代計(jì)算。9.3土壤健康等級(jí)劃分根據(jù)全部樣本的土壤健康指數(shù)分布情況，對(duì)土壤綜合健康狀況給予定性評(píng)級(jí)（等級(jí)從低到高分別為：十級(jí)、九級(jí)、八級(jí)、七級(jí)、六級(jí)、五級(jí)、四級(jí)、三級(jí)、二級(jí)、一級(jí)）。表4土壤健康等級(jí)劃分表康指數(shù)0-1010-2020-3030-4040-5050-6060-7070-8080-9090-100八級(jí)七級(jí)六級(jí)五級(jí)二級(jí)一級(jí)9.4土壤健康評(píng)價(jià)報(bào)告土壤健康評(píng)價(jià)報(bào)告包含各土壤健康指標(biāo)的測(cè)量值和賦分值，以及土壤健康綜合指數(shù)和等級(jí)，以便于農(nóng)田管理者理解。具體說(shuō)來(lái)，包含以下3部分內(nèi)容：（1）土壤背景信息欄：包括農(nóng)場(chǎng)名、聯(lián)系方式、土樣編號(hào)、采樣日期、作物類型、耕作方式、排水狀況、農(nóng)田地表坡度和土壤質(zhì)地等信息；（2）土壤健康指標(biāo)欄：包括測(cè)定的土壤健康指標(biāo)的名稱、土壤健康指標(biāo)測(cè)定值、土壤健康指標(biāo)分值（0~40分為低分值，40~60分為中分值，60~100分為高分值）、低分值指標(biāo)反映的土壤受限功能、土壤健康指標(biāo)值對(duì)應(yīng)的累積頻率；（3）土壤健康狀況綜合評(píng)價(jià)欄：包括土壤健康總分和土壤健康等級(jí)。土壤健康報(bào)告示例如下。表5土壤健康報(bào)告示例土壤健康報(bào)告編號(hào)：DA21Z028-②地點(diǎn)：通榆縣新興鄉(xiāng)G1015鐵科高速林水村經(jīng)緯度：122.747474,44.835123海拔：160m坡度2°土壤類型：深位蘇打鹽化堿土土壤質(zhì)地：粘粒5.7%，粉粒13.4%，砂粒80.8%Loamysand作物：玉米田間觀察情況：沙土，土壤較干。土壤健康狀況：土壤化學(xué)、物理、生物性質(zhì)均存在限制因子，主要為土壤肥力低、作物養(yǎng)分供應(yīng)能力差、保水性差、生物活性低。土壤健康指標(biāo)測(cè)量值賦分值（百分制）土壤受限功能物理指標(biāo)容重(g/cm3)土壤通氣、入滲、根系生長(zhǎng)田間持水量(%)28.0651土壤保水性粘粒含量(%)5.7238土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性砂粒含量(%)69.850土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性電導(dǎo)率(μm/cm)79.5633化學(xué)指標(biāo)酸堿度8.66堿脅迫與作物營(yíng)養(yǎng)有效性有機(jī)碳(g/kg)5.748生物指標(biāo)微生物量碳(mg/kg)80.2920土壤生物活性土壤呼吸速率(pmol/g*s)39土壤生物活性呼吸熵(pmol/g*h)6.17土壤生物活性（碳利用效率低）土壤健康總分 29.7八級(jí)（低）健康程度附錄A土壤質(zhì)地的測(cè)定采用激光粒度分析法對(duì)土壤質(zhì)地進(jìn)行測(cè)定。稱取0.5g風(fēng)干樣品于100ml小燒杯中，加入10ml10％雙氧水，置于電爐上加熱，加熱過(guò)程中不斷用水沖洗燒杯壁，防止燒開(kāi)，加熱至混合液變清沒(méi)有細(xì)小泡沫，以除去樣品中的有機(jī)質(zhì)，然后加入10ml10％鹽酸加熱至沸騰，以除去樣品中的碳酸鹽。從電爐上取下小燒杯，排放整齊后注滿去離子水，靜置浸泡12h后，將上清液小心抽取，抽至保留約10ml，最后加入10ml分散劑（0.05M六偏磷酸鈉溶液），置于超聲波振蕩器2~8min，以形成高分散的顆粒懸浮液，通過(guò)激光粒度儀（Mastersizer2000,Malvern,USA）分析各粒級(jí)百分含量、粒度累積曲線及平均粒徑、中值粒徑、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、偏度（SK）、尖度（Kg）等粒度參數(shù)，三次平行分析誤差低于2%。粒徑分級(jí)：粒徑小于2μm的土壤顆粒劃分為粘粒；粒徑介于2μm與50μm的土壤顆粒劃分為粉粒；粒徑大于50μm的土壤顆粒劃分為砂粒。粘粒、粉粒與砂粒含量的單位為百分比（%）。附錄B脲酶活性的測(cè)定利用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定土壤脲酶活性。取5g鮮土或10g干土，置于50mL三角瓶中，加入1mL甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mLpH6.7檸檬酸鹽緩沖液，搖勻后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)液，過(guò)濾，取3mL濾液于50mL容量瓶，然后加水至20mL，再加4mL苯酚鈉溶液，仔細(xì)混合，加入3mL次氯酸鈉溶液，充分搖蕩，放置20min，用水稀釋至刻度，一小時(shí)之內(nèi)將著色液在紫外分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，記錄吸光度值。同時(shí)，設(shè)置氨濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線、無(wú)土空白對(duì)照以及無(wú)基質(zhì)空白對(duì)照。脲酶活性按公式（G.1）計(jì)算。 Ure=m式中：Ure——脲酶活性，單位為毫克每克每天（mg·g-1d-1）；a樣本——由吸光值經(jīng)氨濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣本氨濃度，單位為毫克每毫升（mg·ml-1）；a無(wú)土對(duì)照——由吸光值經(jīng)氨濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的無(wú)土對(duì)照氨濃度，單位為毫克每毫升（mg·ml-）；a無(wú)基質(zhì)對(duì)照——由吸光值經(jīng)氨濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的無(wú)基質(zhì)對(duì)照氨濃度，單位為毫克每毫升）；V——顯色液體積，單位為毫升（ml）；n——稀釋倍數(shù)，無(wú)單位；m——土壤干重，單位為克（g）。附錄C固氮酶活性的測(cè)定將10g鮮土置于120ml滅菌的血清瓶中，向瓶中加入4ml葡萄糖（1mgC/gdrysoil）和蘋(píng)果酸鈉溶液（1mgC/gdrysoil）；然后向血清瓶中加入10%的C2H2（Air:C2H2=90:10），于25℃環(huán)境中培養(yǎng)24h。同時(shí)設(shè)置不加入土壤的空白瓶作為對(duì)照。利用氣相色譜測(cè)定瓶?jī)?nèi)上空乙烯的濃度。固氮酶活性按公式（B.1）計(jì)算。式中：Vnif——固氮酶活性，單位為毫摩爾每克土每天（nmol·g-1·d-1）；c——樣本瓶?jī)?nèi)乙烯濃度，單位為百萬(wàn)分比濃度（ppm）；c0——空白瓶?jī)?nèi)乙烯濃度，單位為百萬(wàn)分比濃度（ppm）；110——?dú)怏w體積，單位為毫升（ml）；m——土壤干重，單位為克（g）；22.4——標(biāo)準(zhǔn)狀況下氣體摩爾體積，單位為摩爾每升（mol·L-1）。附錄D反硝化酶活性的測(cè)定準(zhǔn)確稱取5g鮮土于玻璃血清瓶中，加入5ml蒸餾水，充分振蕩混勻，用橡皮塞和鋁蓋密封瓶口。用針頭向血清瓶?jī)?nèi)充入高純氮?dú)?，同時(shí)在橡皮塞上插入另一根針頭，整個(gè)過(guò)程持續(xù)5min用以排出血清瓶中的空氣。將裝有5ml蒸餾水的注射器插入橡皮塞內(nèi)，直到無(wú)氣泡產(chǎn)生為止，確保瓶?jī)?nèi)為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。向瓶?jī)?nèi)充入10%（V/V）的乙炔氣體（10ml），充分混勻，再次調(diào)節(jié)大氣壓至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。將處理好的血清瓶置于25℃避光培養(yǎng)12h，最后抽取瓶?jī)?nèi)氣體，用氣相色譜測(cè)定其中N2O氣體的含量。附錄E細(xì)菌、真菌及原生生物的α-多樣性指數(shù)（Shannonindex,Chao1richness）與β-多樣性（即NMDS1值）的測(cè)定與計(jì)算稱取0.5g土壤，使用DNesayPowerSoilKit（QIAGENGmbH,Germany）進(jìn)行土壤樣品中的總DNA的提取。使用Nanodrop分光光度計(jì)（Thermoscientific,Wilmington,DE）進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定。利用IlIumina公司的NovaSegPE250平臺(tái)，采用16SrRNA基因V3-V4區(qū)的細(xì)菌群落的特異性引物515FmodF（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）與806RmodR（5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得細(xì)菌群落（Caporasoetal.2011）。采用真菌的特異性引物fITS7（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增（Ihrmarketal.2012）獲得真菌群落。使用18SrRNAV4search區(qū)的微型真核生物通用引物TAReuk454FWD1F（5’-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3’）和TAReukREV3R（5’-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Stoecketal.2010），獲得原生生物群落。在QIIME1.9.0軟件平臺(tái)使用USEARCH（Edgar，2010）對(duì)原始序列進(jìn)行處理。首先將引物序列及低質(zhì)量（Qscore<30）序列的末端進(jìn)行裁剪后進(jìn)行合并，并去除合并后錯(cuò)誤值大于0.5的序列。用UNIOSE3方法去除序列中的嵌合體，按照序列相似度100%進(jìn)行降噪以形成“零半徑OTUs”（Zero-radiusOTUs,ZOTUsEdgar，2016）。結(jié)合樣本的測(cè)序深度以及稀釋曲線結(jié)果確定抽平序列數(shù)，產(chǎn)生的ZOTU表進(jìn)行下游分析。使用alpha_diversity.py計(jì)算α-多樣性以獲得細(xì)菌、真菌和原生生物的Shannon多樣性指數(shù)和Chao1豐富度指數(shù)。在R語(yǔ)言中，利用vegan包對(duì)細(xì)菌、真菌和原生生物群落進(jìn)行非度量多維尺度分析(non-metricmultidimensionalscaling，NMDS)，從生成的坐標(biāo)矩陣中提取第一列數(shù)據(jù)，即對(duì)應(yīng)第一軸的坐標(biāo)值（即NMDS1值）作為微生物群落的β-多樣性。多樣性指數(shù)按公式（G.1）計(jì)算。Shannonindex=?i=1S(pi×lnpi)（G.1）式中：Shannonindex——多樣性指數(shù)；S——物種總數(shù)；pi——第i個(gè)物種的相對(duì)豐度，即第i個(gè)物種的個(gè)體數(shù)量除以所有物種的總個(gè)體數(shù)量。豐富度估計(jì)量按公式（G.2）計(jì)算。Chao1richness=Sobs+F1(F1?1)2(F2+1)式中：Chao1richness——豐富度估計(jì)量；Sobs——物種總數(shù)；F1——豐度為1的物種數(shù)量；F2——豐度為2的物種數(shù)量。參考文獻(xiàn)[1]FAO.Globalstatusofblacksoils[M/OL]//FAO,2022.[2]LEHMANNJ,BOSSIODA,K?GEL-KNABNERI,etal.Theconceptandfutureprospectsofsoilhealth[J/OL].NatureReviewsEarth&Environment,2020,1(10):544-553.DOI:10.1038/s43017-020-0080-8.[3]FINEAK,VANESHM,SCHINDELBECKRR.Statistics,ScoringFunctions,andRegionalAnalysisofaComprehensiveSoilHealthDatabase[J/OL].SoilScienceSocietyofAmericaJournal,2017,81(3):589-601.[4]MOEBIUS-CLUN