1、八寶景天抑菌活性實驗方案1 材料與儀器1.1 材料八寶景天（莖、葉、花），采摘于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，去離子水洗凈，陰干，經(jīng)粉碎機粉碎(過4060 目篩)，所得植物粉用密封袋于遮光處保存?zhèn)溆谩?.2 微生物真菌：黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黃瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院提供。番茄葉霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜莖腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoc

2、tonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。1.3 試劑與儀器95%乙醇 分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司葡萄糖 分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司瓊脂粉 生化試劑 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司馬鈴薯JFSD-100粉碎機 上海淀久中藥機械制造有限公司JJ200型精密電子天平 美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠

3、TDL-5A低速大容量離心機 上海悅豐儀器儀表有限公司生化培養(yǎng)箱SPX-250型 上海躍進醫(yī)療器械廠ZKF035電熱真空干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠超凈工作臺 上海生物科技有限公司1.4 培養(yǎng)基的制備 真菌都用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g 瓊脂20g 水1000mL pH值 自然培養(yǎng)基具體制作方法是：將200g馬鈴薯去皮，去芽眼，切成小條放入鋁鍋中，加入1000mL水，煮沸2030分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用68層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補水至1000

4、mL，加入瓊脂熔化，再加入糖攪拌均勻，趁熱分裝于試管或錐形瓶中。分裝后121滅菌20min。2 試驗方法2.1植物提取液的制備準(zhǔn)確稱取100 g的樣品，于250 ml錐形瓶中，加入200 ml 95%的乙醇，室溫下，超聲提取45 min，連續(xù)提取3次，過濾粗提物，離心（3500 r/min,20 min），過濾除雜，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，4 冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2八寶景天（莖、葉、花）提取物抑菌活性的測定抑菌試驗樣品的準(zhǔn)備：稱取一定量的提取物，用20%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇將植物提取物配制成質(zhì)量濃度為10 g/ml的供試藥液做抑菌試驗用。菌的活化培養(yǎng)：供試真菌從4 冰箱取出，接種于具有馬鈴薯葡萄

5、糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于28下活化培養(yǎng)，待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿的80%時備用。菌懸液的制備：取一定量已活化的供試菌于裝有50mL的液體PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，制成菌懸液于28下培養(yǎng)48h，用無菌的移液管取1.0mL培養(yǎng)好的菌懸液于試管中，加入9.0mL的無菌水依次梯度稀釋，每稀釋一個試管，濃度降低10-1，用稀釋培養(yǎng)基測數(shù)法測菌體個數(shù)，調(diào)至濃度為6.8106 CFU/mL（指每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù)）。八寶景天（莖、葉、花）提取物抑菌活性的測定采用菌絲生長速率法、稀釋培養(yǎng)基測數(shù)法。2.2.1菌絲生長速率法又稱抑菌圈法或瓊脂平板法。生長速率是指將不同濃度的藥液與融化的培養(yǎng)基混合，制成帶毒培

6、養(yǎng)基平面，在平面上接種病原菌，以病菌生長速度的快慢來判斷藥劑毒力大小的方法，以一定的時間內(nèi)菌落直徑的大小來表示。菌絲生長速率法試驗步驟：1）制備帶毒培養(yǎng)基平面 準(zhǔn)確的吸取一定量的上述植物提取物加入到已融化的培養(yǎng)基中，混合均勻倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻后即成帶毒的培養(yǎng)基平面2）接種病原菌 用無菌打空器將已活化的菌制成直徑為6mm的菌餅，用無菌鑷子將菌餅接入平板中央，每培養(yǎng)皿放置1 個菌餅，置于25 28 的電熱恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。3）結(jié)果 采用十字交叉法測定菌落直徑,按以下公式計算抑制率：抑制率=(CK菌落直徑-0.6)-(處理菌落直徑-0.6)/(CK菌落直徑-0.6)100%2.2.2稀釋培養(yǎng)基測數(shù)法根據(jù)微生物在高度稀釋條件下，固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計的技術(shù)方法，即一個菌落代表一個單細胞。稀釋培養(yǎng)基測數(shù)法試驗步驟如下：1）稀釋培養(yǎng)基測數(shù)法(最大或然數(shù)計數(shù)法Most probable number，MPN)測定每毫升原培養(yǎng)液含活菌數(shù)，根據(jù)MPN所得結(jié)果將原培養(yǎng)液稀釋成約100CFU/mL；2）吸取20L菌懸液于含提取物的固體培養(yǎng)基的平板中，用涂菌棒涂布均勻靜置15 min，將培養(yǎng)基平板倒置(防止皿蓋冷凝水下滴)于28生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；3）數(shù)菌落數(shù)，對照組菌落數(shù)記為C0，涂