1、無菌檢查法驗(yàn)證,張榮玉,一、概述：1.1定義：系用于檢查藥典要求的無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其它品種是否無菌的一種方法。2.1驗(yàn)證的必要性和意義：確認(rèn)所采用的方法檢查供試品無菌的適合性。保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；檢查方法的完整性。與同藥品無菌檢查接軌。通過對(duì)不同品種、批號(hào)的無菌檢查比較；對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)全過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。,二、存在問題:2.1專業(yè)人才少,缺乏相應(yīng)的培訓(xùn)和管理。2.2工作量大,導(dǎo)致操作不規(guī)范。2.3檢驗(yàn)方法缺陷，如直接種法可操作性差，引入污染的風(fēng)險(xiǎn)較大。2.4試驗(yàn)條件的影響環(huán)境影響培養(yǎng)基、稀釋劑、沖洗液。所用品、器具清潔滅菌。,三、無菌檢查的試驗(yàn)要求:3.

2、1環(huán)境：10000級(jí)局部以下100級(jí)，布局符合無菌操作要求；或隔離系統(tǒng)（生物安全柜）。3.2人員：必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)培訓(xùn)。3.3設(shè)備、器件、材料：經(jīng)處理必須符合無菌要求，培養(yǎng)箱的溫度指示裝置要校驗(yàn)。3.4培養(yǎng)基：3.4.1按藥典規(guī)定處方配制，采用經(jīng)驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。3.4.2保存：2-25避光保存；期限：非密閉容器3周，密閉容器1年。3.4.3培養(yǎng)基適用性、無菌性、靈敏度檢查。,3.4.4靈敏度檢查：3.4.4.1檢查用菌株傳代不得超過5代。3.4.4.2常用菌株：金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26003)銅像假單胞菌CMCC（B）10104枯草芽胞桿菌CMCC（B）63501

3、生孢梭菌CMCC（B）64941白色念珠菌CMCC（F）98001黑曲霉CMCC（F）980033.4.4.3菌液配制、保存、接種培養(yǎng)按藥典要求。3.4.4.4結(jié)果判斷：空白對(duì)照應(yīng)無細(xì)菌增長(zhǎng)，加菌液的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基靈敏度符合要求。,3.5稀釋液、沖洗液：3.5.1按藥典規(guī)定配制后采用經(jīng)驗(yàn)證的滅菌程序滅菌。3.5.2常用稀釋液、沖洗液：0.1%蛋白胨水液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液無菌0.1%氯化鈉液中性磷酸鹽緩沖液含0.1%聚山梨酯（吐溫-80）的0.1%蛋白胨水溶液3.5.3依據(jù)供試品的特性選擇稀釋液、沖洗液。,四、無菌檢查法驗(yàn)證:4.1原理:驗(yàn)證的所有環(huán)境、培養(yǎng)基、菌株、稀釋

4、液、沖洗液均與日常檢查方法相一致、并符合相關(guān)規(guī)定。4.2驗(yàn)證分類：前驗(yàn)證：建立無菌檢查方法時(shí)。再驗(yàn)證：修訂檢查方法時(shí)。定期驗(yàn)證：供試品組合或原檢查條件改變。,4.3驗(yàn)證方案制定原則：供試品的抑菌性，敏感菌種選擇;適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蚪档鸵志?。樣品的預(yù)處理方式能有效抵消（或中和）產(chǎn)品的抑菌性。樣品的預(yù)處理方式、檢驗(yàn)過程、培養(yǎng)條件均不影響樣品中微生物的生長(zhǎng)。驗(yàn)證記錄真實(shí)完整地記錄所做試驗(yàn)。,4.4驗(yàn)證重點(diǎn)環(huán)節(jié)分布：,樣品,需前處理,不需前處理,驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)，檢出影響,有抑菌作用,去除抑菌作用,通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判,無抑菌作用,驗(yàn)證抑菌活性去除方法的有效性及對(duì)污染菌檢出物影響,檢驗(yàn),4.5驗(yàn)證

5、方法：4.5.1制備驗(yàn)證試驗(yàn)菌液，按藥典方法配制菌液。4.5.2選擇配制適合的培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液。4.5.3供試品的處理：驗(yàn)證所用的溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等的有效性，使用量及微生物生長(zhǎng)無影響。驗(yàn)證加熱溫度、離心速度和時(shí)間對(duì)微生物生長(zhǎng)或分布無影響。不需前處理的供試品免做。,4.5.4無抑菌性樣品的驗(yàn)證方法：依據(jù)產(chǎn)品溶解性和微生物限度選擇合適的中性稀釋劑溶解和稀釋，用直接接種法驗(yàn)證，常用中性稀釋液或淋洗液。4.5.5具有抑菌性樣品的驗(yàn)證方法：確定抑菌作用（抑細(xì)菌、真菌試驗(yàn)驗(yàn)證），選擇敏感菌株對(duì)供試品抑菌活性去除效果檢驗(yàn)（陽性菌回收試驗(yàn)）。消除樣品抑菌性的方法驗(yàn)證：,化學(xué)鈍化中和法（化學(xué)

6、試劑中合法）：利用化學(xué)（生物）專屬性滅活，常用鈍化劑有：對(duì)氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜過濾法和直接接種法也可用。對(duì)化學(xué)中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如-內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶。稀釋中和法：利用降低供試品的相對(duì)濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進(jìn)行。薄膜過濾法：利用體積差異分離，通過薄膜過濾，微生物被截于濾膜，培養(yǎng)薄膜觀察有無微生物生長(zhǎng)。各方法組合運(yùn)用，效果更好。,驗(yàn)證方法:a.驗(yàn)證分組：A組:樣品組,適當(dāng)方法中和樣品,加入少量驗(yàn)證微生物(接種量少于100cfu)。B組:對(duì)照組,0.1%蛋白胨或PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液,加少量微生物(接種量少于100cfu).C組：陽性對(duì)照組，不經(jīng)中和處理

7、，將實(shí)驗(yàn)菌株直接接種于培養(yǎng)基中(接種量少于100cfu)。,b.結(jié)果分析:A組與B組微生物生長(zhǎng)數(shù)量相似，表明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性，如果B組與C組的微生物數(shù)量相似，表明樣品預(yù)處理用中和劑的毒性、檢測(cè)程序和培養(yǎng)條件等均不影響微生物生長(zhǎng)。樣品如無抑菌性，省去B組試驗(yàn)，A組與C組直接比較。A組微生物生長(zhǎng)數(shù)量不及C組微生物生長(zhǎng)數(shù)量，表明試驗(yàn)用器具材料或培養(yǎng)條件等方面存在對(duì)微生物生長(zhǎng)不利因素。c.為考查驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證至少需3個(gè)不同批次的同類樣品，分別進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。,五、供試品無菌檢查驗(yàn)證:5.1按藥典要求確定檢驗(yàn)數(shù)量、檢驗(yàn)量、設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5.2供試品無菌檢

8、查方法和檢驗(yàn)條件與驗(yàn)證方法相同。5.3直接接種法驗(yàn)證試驗(yàn)：5.3.1供試品有抑菌時(shí)，按培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)的菌種，向該種無菌檢查培養(yǎng)基內(nèi)加入該微生物，每種培養(yǎng)基接2瓶，每瓶接種量控制10-100cfu之間。5.3.2參照藥典規(guī)定確定培養(yǎng)基用量，按無菌檢查要求向上述其中一瓶加入規(guī)定量供試品，另一瓶為陽性對(duì)照。5.3.3將種好的容器按藥典規(guī)定溫度培養(yǎng)14days。,5.3.4驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)：供試品與陽性對(duì)照相比、供試品容器內(nèi)微生物生長(zhǎng)不明顯，說明有抑菌性?？墒褂弥泻蛣┤绫葴?80。-內(nèi)酰胺酶等消除抑菌效果。中和劑不能消除抑菌作用，適當(dāng)增加培養(yǎng)基體積稀釋。5.4薄膜過濾法驗(yàn)證試驗(yàn)：5.4.1薄膜過濾法驗(yàn)證

9、試驗(yàn)供試品有抑菌特性時(shí)，在同型號(hào)的每個(gè)過濾器加規(guī)定定量的供試品（容器數(shù)及每容器的過濾體積）。淋洗至少3次，淋洗液為100ml/次，最后一次淋洗液中，接種驗(yàn)證用菌株（10-100cfu）；取另一濾器不過濾供試品，重復(fù)上述淋洗操作，作為陽性對(duì)照。分別將靈敏度實(shí)驗(yàn)的菌種及相應(yīng)培養(yǎng)基逐一試驗(yàn)。,5.4.2供試品和陽性對(duì)照接種后、培養(yǎng)基容器按藥典菌株要求溫度下培養(yǎng)，時(shí)間不超過14days。5.4.3使用新的濾膜過濾器（不同廠家或批號(hào)、型號(hào)）重新進(jìn)行樣品試驗(yàn)組、蛋白胨對(duì)照組和陽性對(duì)照組的驗(yàn)證確認(rèn)。5.4.4驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)：供試品培養(yǎng)基容器內(nèi)可見微生物生長(zhǎng)明顯（混濁），與陽性對(duì)照組比較結(jié)果相似，則在無菌檢查試

10、驗(yàn)中必須過濾與驗(yàn)證試驗(yàn)相等量的供試品、淋洗液。淋洗相同次數(shù)及使用相同量的培養(yǎng)基。供試品培養(yǎng)基容器內(nèi)與陽性對(duì)照結(jié)果相比微生物生長(zhǎng)不明顯，應(yīng)增加淋洗次數(shù)、重復(fù)上述試驗(yàn)。,六、驗(yàn)證合格標(biāo)準(zhǔn):6.1平皿菌落計(jì):6.1.1通常用于藥品防腐劑防腐效力測(cè)試和微生物限度檢查中。計(jì)數(shù)每毫升（或克）樣品的微生物含量。6.1.2每種試驗(yàn)菌每組至少重復(fù)3次（3個(gè)不同批次的樣品）。6.1.3合格標(biāo)準(zhǔn)：A組（樣品試驗(yàn)組）驗(yàn)證微生物平均生長(zhǎng)數(shù)量不低于C組（陽性對(duì)照組）驗(yàn)證微生物平均生長(zhǎng)數(shù)量的70%，檢驗(yàn)方法通過驗(yàn)證。,6.2直接接種法：6.2.1培養(yǎng)基能中和抗菌劑的抑菌性，并適合廣譜微生物的生長(zhǎng)，包括樣品種潛在微生物生長(zhǎng)。

11、6.2.2每種試驗(yàn)菌種每組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。如需要改變產(chǎn)品和培養(yǎng)基比率達(dá)到中和效果。6.2.3合格標(biāo)準(zhǔn)：3批（不同批次的樣品）在14days內(nèi)所有樣品試驗(yàn)組中培養(yǎng)基都顯示大量的微生物生長(zhǎng)，則相應(yīng)的試驗(yàn)方法通過驗(yàn)證。,6.3薄膜過濾法：6.3.1適用于無菌檢查和生物限度堅(jiān)查，樣品必須能被過濾。需溶解的樣品應(yīng)驗(yàn)證該樣品的溶解方式及整個(gè)試驗(yàn)過程，試驗(yàn)用具和材料及培養(yǎng)條件等不會(huì)影響樣品中固有的微生物的生長(zhǎng)。6.3.2樣品試驗(yàn)組、樣品溶液通過薄膜，用適量淋洗液淋洗3次，在最后一次淋洗液中接入少量（10-100財(cái)富）驗(yàn)證菌。淋洗后，將濾膜轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基（或液體培養(yǎng)基中）培養(yǎng)。樣品抑菌性強(qiáng)、則應(yīng)進(jìn)行中

12、和處理，再驗(yàn)證中和效果。,6.3.3蛋白胨對(duì)照組：不加產(chǎn)品的稀釋液，其他操作及實(shí)驗(yàn)條件與樣品試驗(yàn)組相同。驗(yàn)證中和用鈍化劑（針對(duì)需預(yù)處理的樣品）、過濾器和濾膜材質(zhì)是否會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生影響）。6.3.4陽性對(duì)照組：將與上述兩組等量同種驗(yàn)證菌液（10-100cfu）直接種到固體培養(yǎng)基表面（或液體培養(yǎng)基中）。比較蛋白胨對(duì)照組和陽性對(duì)照組微生物的情況，估算濾器和濾膜造成微生物的損失量。6.3.53次試驗(yàn)（3個(gè)不同批次的樣品）結(jié)果評(píng)價(jià)：上述3組試驗(yàn)結(jié)果間差異均在70%以上（固體培養(yǎng)基）或培養(yǎng)14days內(nèi)所有試驗(yàn)組的液體培養(yǎng)基微生物均有生長(zhǎng)，則認(rèn)為驗(yàn)證微生物的回收率基本相同，相應(yīng)的微生物驗(yàn)證方法同過驗(yàn)證。,

13、七、驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)與報(bào)告:7.1分析評(píng)價(jià)主要包括有：7.1.1對(duì)每個(gè)驗(yàn)證試驗(yàn)的菌株、每次驗(yàn)證試驗(yàn)的數(shù)據(jù)及其有效性和合理性評(píng)價(jià)。7.1.2驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)所表明的檢品預(yù)處理方式、檢驗(yàn)用器具、材料、培養(yǎng)條件等的合理性是否符合規(guī)定要求，它們與藥品檢驗(yàn)的規(guī)程要求是否符合。7.1.3驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)最后要說明該藥品的微生物檢測(cè)方法是否準(zhǔn)確、有效、可靠與可行，是否有較好的重現(xiàn)性。最后得出結(jié)論。,7.2驗(yàn)證試驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容包括有：7.2.1驗(yàn)證試驗(yàn)藥品的名稱，待驗(yàn)證檢驗(yàn)方法的有效登記號(hào)。7.2.2驗(yàn)證試驗(yàn)用菌株名稱、菌號(hào)、試驗(yàn)室控制號(hào)、轉(zhuǎn)種代數(shù)。7.2.3驗(yàn)證菌株的制備和接種記錄。7.2.4驗(yàn)證供試品的預(yù)處理方法、

14、檢驗(yàn)用具和材料、檢測(cè)步驟以及培養(yǎng)條件等。7.2.5驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)及結(jié)論。7.2.6驗(yàn)證條件：包括驗(yàn)證試驗(yàn)的原始記錄，包括驗(yàn)證菌株的制備和接種量復(fù)核、驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果等。,無菌驗(yàn)證范例（注射劑無菌檢查方法）,一、材料：1.1樣品：品名、規(guī)格、批號(hào)、生產(chǎn)批號(hào)。1.2培養(yǎng)基稀釋液：硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、批號(hào)；改良馬丁液體培養(yǎng)液，批號(hào)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號(hào)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)；0.1%蛋白胨滌養(yǎng)，PH7.10.2；培養(yǎng)基和稀釋液來源。1.3驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種：所用菌代數(shù)。金黃色葡萄球菌（26003）；銅綠假單胞菌（10104），枯草芽孢桿菌（63501）;生孢梭菌（64941）；白色念珠菌（98001）

15、；黑曲霉菌（98003），上述菌種的來源及傳代數(shù)。1.4儀器和濾器：HTY-2001A集菌儀；全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器，批號(hào)及生產(chǎn)廠商。,二、驗(yàn)證方法：2.1菌液制備：取經(jīng)34培養(yǎng)18-24h的金葡萄、銅綠假單胞菌，枯草孢芽菌的新鮮肉湯培養(yǎng)物1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10-5、10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經(jīng)34培養(yǎng)18-24h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1ml。加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經(jīng)24培養(yǎng)的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。取經(jīng)24培養(yǎng)一周的黑曲霉料面培養(yǎng)物，加入無菌0.9%氯化鈉溶液10ml，洗下孢子；吸出孢子懸液，過濾除去菌籽，收集菌液至另一無菌試管，取菌液0.1ml，加入無菌0.9%氯化鈉溶液9.9ml，稀釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用。,2.2菌液計(jì)數(shù)：每種菌液接種工作皿、取平均值。計(jì)數(shù)結(jié)果列表（略）。2.3方法驗(yàn)證及結(jié)果：直接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養(yǎng)基2ml/支后，再按要求加入相應(yīng)陽性菌液（30-100cfu/ml)。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3-5days，逐日觀察、