1、.,1,免疫學(xué)檢驗(yàn),.,2,第二十二章 免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),.,3,免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) -是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與組織細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的免疫檢測(cè)方法。,.,4,免疫組化的檢測(cè)原理,.,5,免疫組化的檢測(cè)原理,.,6,免疫組化的檢測(cè)原理,.,7,第一節(jié) 免疫組化檢驗(yàn)技術(shù)基本知識(shí),.,8,免疫組化全過程,.,9,一、標(biāo)本制作,標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。 （一）標(biāo)本的主要來源 主要有： 活體組織 各種體液及

2、穿刺液 培養(yǎng)細(xì)胞等,.,10,（二）標(biāo)本的固定與保存 1組織材料的固定目的 防止組織細(xì)胞的死后變化，以保持其固有形態(tài) 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu) 使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察 固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片 防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu) 經(jīng)過固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。,.,11,2固定劑的選擇 最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn) 最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) 最大限度地保存抗原的免疫活性 3固定方法 固定方法常用 浸泡法主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進(jìn)行灌注的組織

3、固定。 灌注法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。,.,12,.,13,（三）玻片的處理 玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一 一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑 （四）切片方法的選擇,.,14,.,15,二、抗原處理,（一）進(jìn)行抗原的暴露和修復(fù)的原因 1.固定液的影響 2.抗體制備的影響 （二）抗原的暴露 主要采用酶消化的方法 在選擇酶消化時(shí)，應(yīng)針對(duì)要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可,.,16,（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù) 抗原修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性檢出率 微波處理法 水

4、浴鍋法 壓力鍋法,.,17,三、抗體處理,抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑 （一）抗體的選擇 具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質(zhì)抗體 （二）抗體的稀釋 抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤^量或不足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果 （三）抗體的合理保存 要特別注意保持抗體的生物活性,.,18,四、常用標(biāo)記物,（一）熒光素 如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等 （二）酶 如：辣根過氧化物酶(HRP) （三）生物素-親和素系統(tǒng) （四）免疫金標(biāo)記技術(shù) （五）免疫鐵蛋白技術(shù),.,19,五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷,（一）對(duì)照染色設(shè)計(jì) 為了保證免疫組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對(duì)第

5、一抗體設(shè)立對(duì)照。 1.陽性對(duì)照 用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 目的是證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。 2.陰性對(duì)照 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。 目的是排除假陽性。,.,20,3.陰性試劑對(duì)照 是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)等。 4.自身對(duì)照 是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。,.,21,（二）陽性結(jié)果 陽性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性、定量

6、指標(biāo) 陽性細(xì)胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)(漿)型等）及組織分布特點(diǎn)（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo) 哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽性（只要是抗原所在部位）也應(yīng)視為陽性表達(dá),.,22,（三）陰性結(jié)果 陰性結(jié)果不能簡(jiǎn)單視為抗原不表達(dá)，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。 （四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別 1.分布位置 特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位 非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律,.,23,2.顯色強(qiáng)度 特異性反應(yīng)由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強(qiáng)度不一。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并與陰性細(xì)胞間有明顯間隔 而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，常為成片的細(xì)胞 3.

7、其他 在過大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色,.,24,.,25,六、質(zhì)量控制,質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)取得滿意結(jié)果的必要條件。 （一）試劑質(zhì)量控制 抗體的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵 （二）操作過程質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)操作 標(biāo)本的質(zhì)量控制 （三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制,.,26,第二節(jié) 酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識(shí)別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。,.,27,一、標(biāo)本制作,常用的標(biāo)本有組織切片、

8、組織印片和細(xì)胞涂片 酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為 酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法 非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法,.,28,二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法,（一）原理 酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過酶對(duì)底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到對(duì)抗原定性、定位、定量檢測(cè)的目的。,.,29,（二）技術(shù)類型 1.直接法 形成抗原一抗體一酶復(fù)合物 2.間接法 形成Ag-Ab1-Ab2E復(fù)合物 3.酶標(biāo)抗體三步染色法 為間接法的改良法 形成Ag-Ab1-Ab2E-Ab3E

9、復(fù)合物 （三）方法評(píng)價(jià),.,30,三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法,（一）原理 該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與 Ab3的Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測(cè)。,.,31,（二）技術(shù)類型 1.酶橋法 用辣根過氧化物酶（HRP）免疫動(dòng)物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體)與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3

10、-HRP復(fù)合物，加底物顯色,.,32,.,33,2.PAP法 即過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（AP）與酶（過氧化物酶（P）制成了可溶性復(fù)合物（PAP）,該復(fù)合物由2個(gè)抗酶抗體和3個(gè)過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。 通過橋抗體（Ab2）將特異性識(shí)別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來,.,34,.,35,.,36,3.雙橋PAP法 該法是PAP法的改良，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子

11、，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。 4.APAAP法 APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）- 抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡(jiǎn)稱APAAP法。技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。,.,37,（三）方法評(píng)價(jià) 該技術(shù)既可檢測(cè)抗原，又可檢測(cè)抗體。由于酶不是標(biāo)記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體的缺點(diǎn)，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的方法。,.,38,四、臨床應(yīng)用,酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測(cè)。組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、漿細(xì)胞中的免疫球蛋白、各

12、種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志等均可檢測(cè)。,.,39,第三節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，進(jìn)而對(duì)組織中的某種抗原進(jìn)行定性、定位和定量分析。,.,40,一、標(biāo)本制作,常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、印片或組織切片等。 （一）載玻片和蓋玻片的處理 載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好,.,41,（二）制片 1組織切片 組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。 2印片 組織材料也可制成印片

13、。 3涂片 細(xì)胞或細(xì)菌要制成涂片，涂片應(yīng)薄且均勻。,.,42,（三）標(biāo)本的固定 主要目的是： 1.防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落 2.去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂 3.便于保存。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本應(yīng)在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ā?（四）標(biāo)本片的保存 固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，如需保存，置-20下低溫干燥保存。,.,43,二、熒光抗體標(biāo)記及染色,熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。其制備過程通常包括抗體的標(biāo)記、純化和鑒定三步。 在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，37溫育30min。檢測(cè)不耐熱抗原以4過夜為宜。溫育后充分洗滌、

14、干燥、鏡檢。,.,44,三、臨床應(yīng)用,1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用 2.各種病原微生物的快速檢查和鑒定 3.寄生蟲感染的診斷 4.白細(xì)胞分化抗原的檢測(cè) 此外還應(yīng)用于HLA、腫瘤組織中的腫瘤抗原、組織中的免疫球蛋白和補(bǔ)體組分、激素和酶的定位等。,.,45,第四節(jié) 親和組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性

15、或定量分析。 用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。,.,46,一、生物素-親和素法,生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。 親和素也稱抗生物素，每個(gè)親和素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。,.,47,常用的技術(shù)類型有： 1.標(biāo)記親和素-生物素法（LAB法） 將親和素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物

16、素上，如此多層放大，提高了檢測(cè)抗原的敏感性。,.,48,.,49,2.橋連親和素-生物素法（BAB法） 先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。,.,50,.,51,3. 親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法） 此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中

17、網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測(cè)抗原的靈敏度。,.,52,.,53,二、SPA法,SPA具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgG Fc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)SPA分子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。,.,54,.,55,三、鏈霉親和素生物素技術(shù),鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素-生物素方法（LSAB）。 LSAB法的特點(diǎn):特異性強(qiáng)；分子量小，穿透力強(qiáng)，放大效應(yīng)遠(yuǎn)

18、超ABC法，故其敏感性更強(qiáng)；等電點(diǎn)中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；操作時(shí)間縮短，更簡(jiǎn)便。,.,56,.,57,四、凝集素法,一種凝集素具有專一性結(jié)合某種特異性糖基的能力，同時(shí)所有生物膜都含有一定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。,.,58,一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型并反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞病變中的變化。 標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來： 作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記 作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記 腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，也可用凝集素檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。,.,59,常用下列染色法： 直接法標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合 間接法將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上 糖凝集素糖法 本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，未結(jié)合部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)“三明治樣”的糖凝集素糖的結(jié)合物。,.,60,第五節(jié) 其他免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),一、金免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金