1、第八章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定,（一）測(cè)定方法概述 1、測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法： 凱氏定氮法 快速測(cè)定法（雙縮脲、紫外、水楊酸比色、染料結(jié)合法） 2、測(cè)定氨基酸的方法： 甲醛、電位滴定、茚三酮比色 氣相、液相、薄層、離子交換色譜、 自動(dòng)分析儀,（二）凱氏定氮法 1、實(shí)驗(yàn)原理 以硫酸銅為催化劑， 用濃硫酸消化試樣， 使有機(jī)氮分解為氨， 與硫酸生成硫酸銨。 然后加堿蒸餾使氨逸出， 用硼酸溶液吸收，再用 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根 據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的 消耗量計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。,2、實(shí)驗(yàn)步驟 （1）試樣的制備與稱樣（稱0.5-5g試樣（含氮30-40mg） 放入凱氏燒瓶中） （2）消化 向凱氏燒瓶中依次加入硫

2、酸銅0.4g、硫酸鉀10g、硫酸20mL。將凱氏燒瓶放在電爐上，緩慢加熱。待起泡停止，內(nèi)容物均勻后，升高溫度，保持液面微沸。當(dāng)溶液呈藍(lán)綠色透明時(shí)，繼續(xù)加熱0.5-1h。取下凱氏燒瓶冷卻至約40，緩慢加人適量水，搖勻，冷卻至室溫。,（3）蒸餾與吸收 將消化好并冷卻至室溫的消化溶液全部轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。 向接收瓶?jī)?nèi)加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示劑。將接收瓶置于蒸餾裝置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取 100.05mL稀釋定容后的試液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室。并用少量水沖洗小玻璃杯，一并移入反應(yīng)室。塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入約10mL40%氫氧化鈉

3、溶液。提起玻璃塞，使氫氧化鈉溶液緩慢流入反應(yīng)室。立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸餾5min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min。用少量蒸餾水沖洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶?jī)?nèi)。取下接收瓶。,(4) 滴定 用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定收集液至剛剛出現(xiàn)紫紅色為終點(diǎn)。 同一試樣做兩次平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。 3、結(jié)果計(jì)算 (V- V0)0.014c X(%) =-F100 m(10/100),方法二 比色法,1、實(shí)驗(yàn)原理 食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在 pH 4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮

4、和甲醛反應(yīng)生成黃色的 3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長(zhǎng) 400 nm下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。,2、實(shí)驗(yàn)步驟 （1）試樣的制備與稱樣（稱0.1-0.5g試樣放入凱氏燒瓶中） （2）消化、樣品制備 向凱氏燒瓶中依次加入硫酸銅0.1g、硫酸鉀1g、硫酸5mL。將凱氏燒瓶放在電爐上，緩慢加熱。待起泡停止，內(nèi)容物均勻后，升高溫度，保持液面微沸。當(dāng)溶液呈藍(lán)綠色透明時(shí)，繼續(xù)加熱0.5-1h。取下凱氏燒瓶冷卻至約40，緩慢加人適量水，搖勻，冷卻至室溫。 將消化好并冷卻至室溫的消化溶液全部轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，

5、搖勻。 吸取2.00 mL5.00 mL試樣或試劑空白消化液于50 mL或100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加1滴2滴對(duì)硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。,(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（相當(dāng)于0.00 g、5.00 g、10.0 g、20.0 g、40.0 g、60.0 g、80.0 g和100.0 g氮） ，分別置于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0 mL顯色劑，加水

6、稀釋至刻度，混勻。置于100 水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算線性回歸方程。,(4)試樣測(cè)定 吸取0.50 mL2.00 mL（約相當(dāng)于氮100 g）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100 水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。,四、結(jié)

7、果計(jì)算 試樣中蛋白質(zhì)的含量按下式計(jì)算： X= 式中： X試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）； c試樣測(cè)定液中氮的含量，單位為微克（g）； c0試劑空白測(cè)定液中氮的含量，單位為微克（g）； V1試樣消化液定容體積，單位為毫升（mL）； V2制備試樣溶液的消化液體積，單位為毫升（mL）； V3試樣溶液總體積，單位為毫升（mL）； V4測(cè)定用試樣溶液體積，單位為毫升（mL）； m試樣質(zhì)量，單位為克（g）；,(三) 快速測(cè)定法 為滿足生產(chǎn)過程的快速控制分析，減少環(huán)境污染、簡(jiǎn)便操作省時(shí)，建立了快速測(cè)定方法 如：雙縮脲法、紫外分光光度法、水楊酸比色法、染料結(jié)合法 1、雙縮脲法 （1）原理：

8、雙縮脲在堿性條件下，能與硫酸銅結(jié)合生成紅紫色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比；max=560nm可用吸收光度法進(jìn)行比色測(cè)定。 （2）測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以采用凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣，按蛋白質(zhì)含量40、50、60、70、80、90、100、110mg稱取樣品8份于鈉氏比色管中，各加入1mlCCl4（阻滯淀粉、還原糖、色素、類脂物溶解，消除干擾）加入雙縮脲試劑（酒石酸鉀鈉，KOH ，CuSO4）50.00ml振搖均勻（10min）靜置1h，取上層清液離心5min，再測(cè)max=560nm時(shí)的A（水作參比）,樣品測(cè)

9、定 準(zhǔn)確稱取適量樣品，同樣方法測(cè)樣品的A （3）計(jì)算 x 蛋白質(zhì)（）=-100 w x從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得蛋白質(zhì)含量，mg w測(cè)定樣液相當(dāng)樣品質(zhì)量，mg （4）說明 高脂肪樣品，先用醚抽出棄之 若有不溶物可抽出蛋白質(zhì)后再測(cè),2、水楊酸比色法 （1）原理: 樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化后轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，與水楊酸鈉作用生成藍(lán)色化合物，在max=660nm處比色測(cè)定，求出含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì) （2）測(cè)定:標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取含氮2.5g/ml的硫酸銨 （NH4）2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于25ml容量瓶中，分別加入：空白酸溶液2ml P76.3（2）、磷酸鹽緩沖液5ml、加水至15m

10、l、水楊酸鈉5ml、3637恒溫水浴15min，加入次氯酸鈉2.5ml，再在3637恒溫15min，加水至刻度, max=660nm測(cè)A 樣品處理：稱取0.21.0g置于凱氏燒瓶中，加入15ml濃H2SO4，0.5gCuSO4，4.5g無水硫酸鈉，小火加熱沸騰后，進(jìn)行消化，待溶液澄清，呈暗綠色時(shí)，冷卻，移至250ml容量瓶中，定容。樣品測(cè)定：吸取樣液5ml（必要時(shí)稀釋）以下步驟同上“標(biāo)準(zhǔn)曲線”操作 （3）計(jì)算 Xk 含氮量（）= -100 蛋（）= 總氮（）F（6.25） m106 X-含氮量g，k-樣品稀釋倍數(shù)，m-樣品質(zhì)量，g （4）說明：消化樣品，當(dāng)天測(cè)定，重現(xiàn)性好.嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度（3

11、637）影響顯色,（四）氨基酸總量測(cè)定 1、雙指示劑甲醛滴定法（測(cè)定游離氨基酸） 有單指示劑滴定法、雙指示劑滴定法 單指示劑有：百里酚酞,酚酞;雙指示劑有：中性紅百里酚酞 其原理均是用甲醛與NH2作用，使堿性消失，再用強(qiáng)堿滴定COOH R-CH-COOH + 2HCHO R-CH-COOH NH2 N(CH2OH)2 測(cè)定：樣品（溶液）（2030mg氨基酸+H2O+3滴中性紅，用0.1N NaOH滴定至黃橙色 （V1）樣品+中性甲醛+3滴百里酚酞，搖，靜1min，用0.1N NaOH滴定至淡藍(lán)色 （V2） 計(jì)算： （V2V1）C0.014 氨基酸態(tài)氮（%）= - 100 W 式中：V1用中性紅

12、作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉的體積,V2用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)耗氫氧化鈉的體積,2、電位滴定法 （1）原理：加入甲醛，固定氨基堿性。用酸度計(jì)指示滴定終點(diǎn)，據(jù)加入甲醛后耗用NaOH量計(jì)算蛋白質(zhì) 適用于混濁及色深樣品的直接滴定。 （2）測(cè)定：樣液用NaOH滴定至pH=7.58.2 加入中性20甲醛后，用NaOH滴至pH=9.2 同時(shí)作空白試驗(yàn) （3）計(jì)算： 氨基酸（）=,3、茚三酮比色法 （1）原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物，max=570nm其顏色深淺與氨基酸含量成正比。 （2）測(cè)定 準(zhǔn)確吸取100g/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.

13、0ml至比色管中，補(bǔ)加水至相同體積。加入茚三酮、磷酸緩沖液各1ml，水浴中加熱15min。加水至（或轉(zhuǎn)入容量瓶中）25ml，靜置15min。在570nm下以空白液為參比液，測(cè)A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品測(cè)定 吸取樣液15ml，用同樣條件下測(cè)A，查出氨基酸g （3）計(jì)算 X 氨基酸總量（mg）=-100 m1000,（五）個(gè)別氨基酸的測(cè)定 例：游離賴氨酸的測(cè)定 原理 賴氨酸與茚三酮在pH3的專一顯色反應(yīng)，在=475nm處測(cè)A，分析范圍=0.0750.2mg/ml 測(cè)定 a 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在試管中分別加入賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2mg/ml）0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0ml各補(bǔ)足至2.0mL，加入4mL茚三酮試劑, =475nm處，測(cè)A b 待測(cè)液測(cè)定 吸取待測(cè)液2ml，加4mL茚三酮試劑，=475nm,測(cè)A （茚三酮試劑茚三酮1.25g+94mL乙二醇甲醚；+CuCl22H2O 1.7g + 32mL0.1M檸檬酸）,（六）氨基酸的分離與測(cè)定,1、薄層色譜法 2、氨基酸自動(dòng)分析儀 （1）原理：采用陽離子交換樹脂、利用氨基酸的酸堿性、極性、分子量大小不同在色譜柱上進(jìn)行分離，用茚三酮顯色，再定量測(cè)定。 （2）樣品預(yù)處理：如何處理？（純化、水