1、真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始自八十年代以來，人們對(duì)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成及其起始因子的研究有了進(jìn)一步深入。elF的作用或真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的起始過程與原核細(xì)胞的起始過程大體類似，不同之處主要有以下幾點(diǎn)：(1)特異的起始型tRNA為Met-tRNAMet，不需要N末端的甲酰化。(2)Met-tRNAMet和GTP與eIF2形成一個(gè)可分離的復(fù)合物，不依賴于小亞基。而在原核細(xì)胞IF1與tRNAMet結(jié)合在30S小亞基上。(3)tRNA Met與40S小亞基的結(jié)合先于與mRNA的結(jié)合。相反，在原核細(xì)胞tRNAMet與30S小亞基的結(jié)合后于mRNA與30S小亞基的結(jié)合。(4)ATP水解為ADP提供能量，

2、對(duì)于mRNA的結(jié)合是必需的。(5)在真核細(xì)胞，不僅elF的種類多，而且許多elF本身是多亞基的蛋白質(zhì)。最明顯的是elF3(涉及mRNA結(jié)合，類似于原核細(xì)胞IF3的作用)，含有大約10個(gè)亞基，分子量達(dá)106KD，其重量相當(dāng)于40S亞基重量的1/3。(6)mRNA5端帽的存在對(duì)于起始是需要的(除外某些病毒mRNA，一些病毒mRNA的5末端有共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì))。(7)真核細(xì)胞在起始過程中存在的一種蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)方式是最后一個(gè)關(guān)鍵差別。elF，每個(gè)循環(huán)周期經(jīng)歷一次GTP-GDP交換，參與該交換過程的另一蛋白質(zhì)稱為elF2B(也稱為GEF，即GTP-GDP exchange factor)。從酶催化上講

3、，過程類似于原核細(xì)胞肽鏈延長中的EF-Tu/Ts循環(huán)(見第二節(jié))。當(dāng)elF2將Met-tRNAMet定位于核糖體后它即轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性形式的elF2-GDP。只有當(dāng)elF2與elF2B形成復(fù)合物(elF2-elF2B)后，elF2中的GDP才能被取代。在elF2-elF2B復(fù)合物中。elF2與GTP有很高的親和力，因此能再進(jìn)入活性狀態(tài)并再與Met-tRNAMet結(jié)合。在這個(gè)循環(huán)過程中，elF2的三個(gè)亞基之一elF2對(duì)磷酸化敏感。磷酸化的elF2與elF2B形成的復(fù)合物甚穩(wěn)定，不易解離，從而降低了elF2的可利用性。真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的起始步驟可概括為：(1)形成43S核糖體復(fù)合物;由40S小亞

4、基與elF3和elF4c組成。(2)形成43S前起始復(fù)合物:即在43S核糖體復(fù)合物上，連接elF2-GTP-Met-tRNAMet復(fù)合物。(3)形成43S前起始復(fù)合物:由mRNA及帽結(jié)合蛋白1(CBP1)、elF4A、elF4B和elF4F共同構(gòu)成一個(gè)mRNA復(fù)合物。mRNA復(fù)合物與43S前起始復(fù)合物作用，形成48S前起始復(fù)合物。(4)形成80S起始復(fù)合物:在elF5的作用下，48S前起始復(fù)合物中的所有elF釋放出，并與60S大亞基結(jié)合，最終形成80S起始復(fù)合物，即40S亞基-mRNA-Met-tRNAMet-60S亞基。在真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始階段，值得一提的是40S核糖體亞基幾乎總是

5、選擇第一個(gè)起始密碼子AUG，開始對(duì)mRNA翻譯，這種選擇比原核細(xì)胞對(duì)起始密碼子的選擇方式更簡單些。首先，AUG是唯一的起始密碼子，而在原核細(xì)胞(E.coli)可作為起始密碼子的三聯(lián)體除AUG外，還有GUG，UUG，甚至AUU也可被利用。其次，定位在mRNA5末端的AUG(通常距5末端10-100個(gè)核苷酸)總被選擇。其最簡單的模式是:40S亞基與帶帽的mRNA5末端接觸，并沿著mRNA掃描一直到抵達(dá)第一個(gè)AUG處再開始翻譯。該過程需消耗ATP。這主要是由于Met-tRNAMet的反密碼子與起始密碼子AUG互補(bǔ)的結(jié)果。因此正如前述，真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的特點(diǎn)之一是:tRNAMet先與40S亞基結(jié)

6、合，然后再與mRNA結(jié)合。由此看來，掃描過程其實(shí)是以43S前起始復(fù)合物的形式進(jìn)行的。在真核細(xì)胞tRNAMet中，毗鄰它的反密碼子3端的核苷酸是被一個(gè)大集團(tuán)修飾的A(t6A:N-9-D-呋喃核糖)嘌呤-6-氨基甲酰蘇氨酸)，t6A能通過加強(qiáng)成摞反應(yīng)(Stacking interaction)，穩(wěn)定反密碼子3端核苷酸，不允許在密碼子與反密碼子的反應(yīng)中密碼子第一位堿基擺動(dòng)。原核細(xì)胞tRNAMet缺乏該修飾堿基，因此在反應(yīng)過程中允許密碼子有更多可擺動(dòng)性。這個(gè)結(jié)構(gòu)的存在也有助于解釋43S前起始復(fù)合物對(duì)起始密碼子AUG的選擇的簡單的方式。所以，在真核mRNA中，附加的上游信號(hào)是必要的，例如象原核mRNA的

7、SD順序那樣的信號(hào)。但是，通過深入研究40S亞基對(duì)起始部位的選擇機(jī)制。發(fā)現(xiàn)亦有某些例外情況，即一些mRNA的翻譯不是從起始AUG開始，而是從下游AUG處開始開放讀框。研究表明，事實(shí)A+1NNAUGG順序?qū)τ?0S亞基進(jìn)行起始是理想的序列。如果該順序-3位的A或G和G+1位的G被取代的話，該起始密碼子可能就被漏讀，或者40S亞基經(jīng)過AUG繼續(xù)掃描下去。 肽鏈的延長和終止與真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的起始因子相比較，在延長和終止步驟中所涉及的因子就十分簡單。真核細(xì)胞肽鏈延長和終止過程所涉及的因子因子功能相應(yīng)的原核細(xì)胞因子EF1促使aa-tRNA與核糖體結(jié)合EF-TuEF1使EF1再循環(huán)EF-TsEF2

8、轉(zhuǎn)位EF-GRF肽鏈釋放RF1RF2延長因子(EF)，分子量約50KD。EF1可與GTP和aa-tRNA形成復(fù)合物，并把a(bǔ)a-tRNA供給核糖體。對(duì)EF1的研究不象對(duì)原核細(xì)胞EF-Ts那么清楚，但已證明EF1能催化GDP-GTP交換，有助于EF1再循環(huán)利用，EF2分子量約100KD，相當(dāng)于原核細(xì)胞的EF-G，催化GTP水解和使aa-tRNA從A位轉(zhuǎn)移至P位。肽鏈合成的終止僅涉及到一種釋放因子(RF)，分子量約115KD。它可以識(shí)別所有的三種終止密碼子UAA，UAG和UGA。RF在活化了肽鏈酰轉(zhuǎn)移酶釋放新生的肽鏈后，即從核糖體解離，解離過程涉及GTP水解，故終止肽鏈合成是耗能的。 真核生物蛋白質(zhì)

9、生物合成的特異抑制劑真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的特異抑制劑的作用環(huán)節(jié)。 毫不驚奇，一些能夠抑制原核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑同樣也能抑制真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)生物合成。如aa-tRNA的類似物嘌呤霉素可提前終止肽鏈翻譯。又如梭孢酸(fusidicacid)不僅可阻止完成功能后的原核細(xì)胞EF-G從核糖體釋放，也能阻止真核細(xì)胞EF2的釋放。有一些抑制劑對(duì)真核細(xì)胞的翻譯過程是特異的，這主要是由于真核細(xì)胞翻譯系統(tǒng)裝置的特殊性。如7-甲基鳥苷酸(m7Gp)在體外抑制真核細(xì)胞的翻譯起始，就是因?yàn)閙7Gp與帽結(jié)合蛋白質(zhì)競爭性地與mRNA5端帽結(jié)合。同樣，其它多數(shù)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的特異性抑制劑亦可與不同的翻譯裝置

10、(成份)結(jié)合。上述這些特異性抑制劑大多數(shù)是小分子，有的是多肽，如蓖麻蛋白(ricin)。蓖麻蛋白是一種特異的核酸酶，能夠通過使60S亞基水解失活而中止延長步驟。由白喉?xiàng)U菌(Coryne bacterium diptheriae)所產(chǎn)生的致死性毒素是研究得較為清楚的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制劑。白喉毒素是一種65KD的蛋白質(zhì)，它不是由細(xì)菌基因組編碼的，而是由一種寄生于白喉?xiàng)U菌體內(nèi)的溶源性噬菌體(phage)編碼的。該毒素只是經(jīng)白喉?xiàng)U菌轉(zhuǎn)運(yùn)分泌出來，然后進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)。一旦進(jìn)入真核內(nèi)，白喉毒素就催化ADP-核糖與EF2連接。ADP-核糖由NAD+提供，它與EF2分子中修飾的組氨酸殘基結(jié)合。在體外，這種

11、結(jié)合很容易被加入尼克酰胺而逆轉(zhuǎn)。一旦EF2被ADP-核糖化，EF2就完全失活。由于白喉毒素是起催化作用，因此只需微量(也許少至一個(gè)分子)就能有效地抑制細(xì)胞的整個(gè)蛋白質(zhì)合成，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。EF2中修飾的組氨酸殘基亦稱為白喉酰胺(diphthamide)。假如在EF2中不存在白喉酰胺，白喉毒素就不會(huì)殺死哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 蛋白質(zhì)合成后的分泌不論原核核還是真核生物，在細(xì)胞漿內(nèi)合成的蛋白質(zhì)需定位于細(xì)胞的特異區(qū)域，或者分泌出細(xì)胞。將蛋白質(zhì)分泌出細(xì)胞，在真核細(xì)胞比原核細(xì)胞更困難，因?yàn)檎婧思?xì)胞胞體大，而且還有大量的膜性間隔。一些蛋白質(zhì)被合成后分泌到細(xì)胞外，這些蛋白質(zhì)統(tǒng)稱分泌蛋白。人們發(fā)現(xiàn)，將某些分泌蛋白質(zhì)mR

12、NA在體外進(jìn)行翻譯時(shí)，其翻譯產(chǎn)物的分子量比預(yù)計(jì)的要大的多。例如胰島素由個(gè)氨酸殘基組成，但胰島素mRNA的翻譯產(chǎn)物在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞無細(xì)胞翻譯體系中為個(gè)氨基酸殘基，稱為胰島素原（proinsulin)。在麥胚無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中為個(gè)氨基酸殘基組成的前胰島素原。后來證明，在前胰島素原的M末端有一段富含疏水氨基酸的肽段作為信號(hào)肽（signalpeptide)，使前胰島素原已成為胰島素原。然后胰島素原被運(yùn)到高爾基復(fù)合體，切去C肽成熟的胰島素，最終排出胞外。后來發(fā)現(xiàn)，幾乎各種分泌蛋白質(zhì)（如真核細(xì)胞的前清蛋白，免疫球蛋白輕鏈，催乳素等，原核細(xì)胞的脂蛋白、青霉素酶等）均含有信號(hào)肽，約由個(gè)疏水氨基酸殘基構(gòu)成。近年來，

13、人們才提出了信號(hào)肽假說去解釋分泌蛋白質(zhì)的分泌。其機(jī)理是:當(dāng)新生肽鏈正在跨越膜時(shí)，信號(hào)序列和其后段折成兩個(gè)短的螺旋段，并曲成一個(gè)反向平行的螺旋發(fā)夾，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可插入到疏水的脂質(zhì)雙層中。一旦分泌蛋白質(zhì)的N端錨在膜內(nèi)，后續(xù)合成的其它肽鏈段部分將順利通過膜。疏水性信號(hào)肽對(duì)于新生肽鏈跨越膜及把它固定在膜上起了一個(gè)拐棍作用。信號(hào)肽在完成功能后，隨即被一種特異的信號(hào)肽酶水解。哺乳類動(dòng)物的信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP)可見蛋白質(zhì)與折疊的RNA的二個(gè)結(jié)構(gòu)域締合，Alu表示SLRNA的序列(7SLRNA的序列與脊椎動(dòng)物基因的Alu重復(fù)序列家族的的序列同源)。S代表特殊的中心區(qū)。真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的特異抑制劑的作用環(huán)節(jié)

14、。桿形顆粒的長度約相當(dāng)于核糖體直徑。在80年代中期，Walter等人已提出了肯定的證據(jù)表明:在啟動(dòng)分泌和控制分泌方面，有一小分子RNA-蛋白質(zhì)反復(fù)合物起關(guān)鍵作用。由于該復(fù)合物能與新生的信號(hào)肽特異性反應(yīng)，故被命名為信號(hào)識(shí)別顆粒(Signal Recognition Particle，簡寫為SRP)。SRP由7SLRNA(約300個(gè)堿基)和6種不同的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合組成。蛋白質(zhì)的分子量從9-72KD不等。SRP的作用是能與核糖體結(jié)合并停止蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止翻譯發(fā)生在肽鏈延長至約70個(gè)氨基酸殘基長時(shí)。這個(gè)長度正好是信號(hào)肽完全從核糖體出來時(shí)的長度(隨信號(hào)肽后的30-40個(gè)氨基酸殘基此時(shí)被埋在核糖體內(nèi))。當(dāng)SRP)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的船塢蛋白(docking protein)接觸后，翻譯阻滯逆轉(zhuǎn)，SRP擴(kuò)