1、PCR實(shí)驗(yàn)室 標(biāo)準(zhǔn)化管理與質(zhì)量控制,溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 陶志華,PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化管理,第一部分,一. PCR實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化管理,依據(jù)： 按照臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法(衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)文) 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范 衛(wèi)檢字20028號(hào),1. PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置,工作區(qū)組成 (每區(qū)不同顏色隔離衣) 試劑準(zhǔn)備區(qū)、 樣本準(zhǔn)備區(qū)、 PCR擴(kuò)增區(qū)、 PCR產(chǎn)物分析區(qū)、 標(biāo)本接收及工作區(qū)組成 其設(shè)備、儀器等物品專用,2. PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的管理,注意： 唯一流向制度問(wèn)題 物品的專用與移動(dòng)問(wèn)題,3. PCR實(shí)驗(yàn)室的人員配置,相對(duì)固定的專業(yè)人員（學(xué)歷與職稱）

2、 培訓(xùn)與上崗證 PCR檢測(cè)干擾因素較多，結(jié)果分析復(fù)雜，其應(yīng)用需要與臨床充分溝通。 PCR實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)掌握相關(guān)學(xué)科知識(shí)及應(yīng)用能力（實(shí)驗(yàn)技能、分析能力、溝通能力）,4. 儀器設(shè)備的管理,(1)建檔管理： a. 儀器設(shè)備的一般情況 b. 儀器設(shè)備的相關(guān)文件 c. 儀器設(shè)備的損壞，故障，修理記錄 d. 有問(wèn)題的儀器設(shè)備停用標(biāo)識(shí) e. 儀器設(shè)備的報(bào)廢處理 (2) 儀器設(shè)備的分區(qū)專用 (3) 儀器設(shè)備的校準(zhǔn)和檢定 (4) 進(jìn)行定期的維護(hù)和保養(yǎng),5. 實(shí)驗(yàn)材料的購(gòu)買和管理,(1) PCR檢測(cè)試劑選用: 經(jīng)有關(guān)機(jī)構(gòu)檢定批準(zhǔn)上市的商品化試劑盒，商品試劑三證齊全（生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品注冊(cè)證、經(jīng)營(yíng)許可證）。 (2)

3、 Tip頭選購(gòu)： 必須使用有濾蕊的PCR專用Tip頭,b. 內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應(yīng)的使用說(shuō)明書(shū)等。,a. 外包裝檢查： 包裝應(yīng)完整無(wú)損無(wú)污，標(biāo)識(shí)清楚:廠家名稱，品名，批準(zhǔn)文號(hào)，生產(chǎn)日期，有效期等。,(3) 試劑及耗材的驗(yàn)收：,c. 性能檢查,a. PCR檢測(cè)試劑分區(qū)放置： 核酸提取液，陰、陽(yáng)性對(duì)照、定量標(biāo)準(zhǔn)及其它標(biāo)本處理用試劑存于樣品處理區(qū)； 擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑存于試劑配制區(qū)。 b. PCR檢驗(yàn)試劑存放于-20冰箱。 c. 無(wú)菌處理前的耗材存放于試劑準(zhǔn)備區(qū)，根據(jù)日常工作量，定期定量處理后放至樣品處理區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。,(4) 試劑及耗材的貯存：,體系建立后，如有

4、必要更換試劑品牌，實(shí)驗(yàn)室主任須向科技術(shù)負(fù)責(zé)人提交書(shū)面報(bào)告說(shuō)明更改理由；經(jīng)科技術(shù)委員會(huì)討論，科技術(shù)負(fù)責(zé)人簽字批準(zhǔn)方可更換。,(5) 實(shí)驗(yàn)室不能隨意更改檢測(cè)體系,6. PCR檢測(cè)的標(biāo)本管理,(1) 標(biāo)本接收 接收標(biāo)本時(shí)應(yīng)核對(duì)標(biāo)本與檢驗(yàn)申請(qǐng)單的一致性，對(duì)標(biāo)本狀態(tài)進(jìn)行登記記錄，并在登記本上簽字。 檢驗(yàn)申請(qǐng)有不清晰情況時(shí)，應(yīng)即時(shí)與臨床科室或相關(guān)人員聯(lián)系核實(shí)，并做好記錄。,(2) 標(biāo)本的唯一性標(biāo)識(shí),標(biāo)識(shí)由三部分構(gòu)成-檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本采集日期、該檢測(cè)批次的標(biāo)本序號(hào)，三部分間無(wú)間隔符號(hào)，例如：HBV 02 06 01a1（項(xiàng)目 年 月 日序號(hào)）。 標(biāo)本的唯一性標(biāo)識(shí)須字跡清晰明了，不得隨意作任何涂改；必須時(shí)，在舊

5、標(biāo)識(shí)上劃雙線更改，更改后應(yīng)保持舊標(biāo)識(shí)可辨識(shí),(3)標(biāo)本廢棄處理,廢棄樣本經(jīng)確認(rèn)后，保持容器完整，置于廢棄標(biāo)本處，經(jīng)密閉收集，統(tǒng)一焚燒處理,并有記錄。,7. PCR試驗(yàn)記錄的管理,（1）記錄方法 a.接受標(biāo)本記錄： 以書(shū)面形式記錄病人信息、樣本信息、是否 保存，同時(shí)對(duì)樣本作標(biāo)識(shí)，記錄人簽名； 檢驗(yàn)時(shí)，將標(biāo)識(shí)的樣本帶入樣本處理間處理。 b.PCR擴(kuò)增檢測(cè)記錄： 檢測(cè)結(jié)果以清楚的唯一標(biāo)識(shí)保存于PCR擴(kuò)增儀的電腦的指定文件夾內(nèi)，并定期進(jìn)行備份與整理。,c. 保存的文件夾及文件標(biāo)識(shí)號(hào)： d. 電子保存的軟件備份要求： 每一個(gè)月進(jìn)行一次電子報(bào)告的軟件備份； 安排在每月的最后一個(gè)工作日完成。,(2) 記錄保

6、存,a.電子數(shù)據(jù)的保存: 將病例資料、樣品資料、檢測(cè)結(jié)果錄入報(bào)告系統(tǒng)，產(chǎn)生報(bào)告，同時(shí)保存記錄，記錄人簽名 b.書(shū)面記錄的保存: 書(shū)面記錄（病例資料和結(jié)果記錄）裝訂保存于報(bào)告系統(tǒng)旁的抽屜里，每月進(jìn)行整理，所有記錄保存兩年，兩年后交科室統(tǒng)一建檔封存，封存記錄的開(kāi)啟須經(jīng)科主任同意并委派檔案管理人在場(chǎng)。,(3)記錄的保密：,a.“data”由系統(tǒng)設(shè)置密碼保護(hù)； b. 結(jié)果資料在報(bào)告系統(tǒng)設(shè)置密碼保護(hù)； c.在用的及保存的文字記錄須隨時(shí)在實(shí)驗(yàn)室工作人員的監(jiān)管下，脫離本室人員視線監(jiān)管的須存放在上鎖的抽屜或文件柜內(nèi)，鑰匙由該工作人員保管。 d. 記錄不能涂改，需修改時(shí)可用紅筆在修改內(nèi)容上加雙斜杠并在備注欄中說(shuō)

7、明、簽字,8. PCR檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告,(1) 報(bào)告的要求 檢測(cè)報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、客觀 (2) 報(bào)告的形式各醫(yī)院自定 (3) 報(bào)告單的發(fā)放與管理（憑？取單） 電話報(bào)告？ (5) 化驗(yàn)單需郵寄和E-mail形式發(fā)放的管理,9. 抱怨的內(nèi)部處理,(1) 抱怨的接受：醫(yī)生、病人、其他人,執(zhí)行者在接受抱怨時(shí)，應(yīng)記錄抱怨者姓名、地址、聯(lián)系方式、抱怨內(nèi)容（必要時(shí)首先穩(wěn)定抱怨者情緒）。,(2) 抱怨的處理（投訴）,a. 能當(dāng)時(shí)處理的抱怨及時(shí)解決，記錄。 b. 不能當(dāng)即答復(fù)的,按逐級(jí)授權(quán),匯報(bào)解決。 c. 抱怨的處理以病人滿意為目的， 但必須以遵重科學(xué)，遵重事實(shí)為原則， 在不違背科學(xué)原則，醫(yī)療行為規(guī)范的基礎(chǔ)上，

8、爭(zhēng)取抱怨者最大程度的理解。,10. 傳染性防護(hù),(1) 來(lái)自所有病人的血液和體液都被認(rèn)為是具有傳染性。標(biāo)本采集、運(yùn)送過(guò)程中，應(yīng)保持容器完好，無(wú)泄漏。 (2) 處理血液和體液的工作人員都應(yīng)戴上手套，穿防護(hù)服，戴帽子、口罩。 (3) 在標(biāo)本處理過(guò)程中，手或其它部位的皮膚在接觸血液或其它體液后必須立即徹底清洗。,臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,第二部分,為什么特別強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制？,容易污染假陽(yáng)性 處理不當(dāng)假陰性,假陽(yáng)性問(wèn)題：,標(biāo)本、試劑及實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地的污染 試劑盒的質(zhì)量問(wèn)題, UNG酶是一種選擇，但不可因此而高枕無(wú)憂 加強(qiáng)管理最為重要 選擇優(yōu)質(zhì)試劑盒,假陰性的問(wèn)題：,原因： 1.標(biāo)本處理等操作過(guò)程問(wèn)題 2.標(biāo)

9、本中存在抑制劑 3.由于基因突變所致 解決的辦法： 1.稀釋標(biāo)本 2.點(diǎn)突變的檢測(cè) 3.結(jié)合其他方法分析 4.加強(qiáng)與臨床聯(lián)系與對(duì)話,臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,為什么強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制？ 目前國(guó)內(nèi)所用核酸定量監(jiān)測(cè)方法，受模板濃度、PCR反應(yīng)體系的批間差異影響較大。因此，必須進(jìn)行方法學(xué)的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以此來(lái)規(guī)范PCR實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控工作 室間質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制,測(cè)定前的質(zhì)量控制 操作實(shí)驗(yàn)過(guò)程質(zhì)量控制 質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,測(cè)定前質(zhì)量控制,標(biāo)本采集和留取 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理 理想的試劑和操作方法 人員培訓(xùn),操作實(shí)驗(yàn)過(guò)程質(zhì)量控制,標(biāo)本

10、核酸提取質(zhì)量控制 靶核酸提取的質(zhì)量 和效率 臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制物和干擾物質(zhì) 擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)質(zhì)控,質(zhì)控管設(shè)計(jì),已知弱陽(yáng)性樣本質(zhì)控 已知陰性樣本質(zhì)控 試劑空白質(zhì)控,已知弱陽(yáng)性樣本質(zhì)控,監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程有效性,陰性血清樣本質(zhì)控,監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染； 由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染； 擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。,試劑空白管質(zhì)控,監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。 監(jiān)測(cè)反應(yīng)液加樣區(qū)及加樣過(guò)程是否發(fā)生污染。 如想鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染，可將一個(gè)或多個(gè)空管打開(kāi)靜置于標(biāo)本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽(yáng)性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液

11、的管為陰性，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。,統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法,高、低值質(zhì)控血清的制備,將常規(guī)檢測(cè)的血清標(biāo)本按高、低值分類后進(jìn)行混合分裝（每管一個(gè)檢測(cè)單位），凍存于-20冰箱備用。 購(gòu)買,檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量監(jiān)控,按常規(guī)方法每天插入一份高、低值質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清進(jìn)行定量檢測(cè) （包括標(biāo)本預(yù)處理、DNA提取等步驟） 連續(xù)20天后分別計(jì)算出高、低值血清的均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV） 制作L-J動(dòng)態(tài)質(zhì)控圖 高值質(zhì)控血清以強(qiáng)陽(yáng)性血清為宜 低值質(zhì)控血清以臨界值血清為宜,結(jié)果,結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)曲線的

12、截距和斜率質(zhì)控,以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率做質(zhì)控圖 以標(biāo)準(zhǔn)曲線截距做質(zhì)控圖 用同批號(hào)試劑同批號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 連續(xù)檢測(cè)20個(gè)批次,試劑a標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光,試劑b標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光,試劑c標(biāo)記探針熒光強(qiáng)度及背景熒光,試劑a質(zhì)量結(jié)果,我們選擇試劑盒a用于常規(guī)HBV DNA熒光定量檢測(cè)，并用該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與截距對(duì)試劑批間差異實(shí)施質(zhì)量監(jiān)控，其結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的批間差,同批號(hào)試劑批間 不同批號(hào)試劑批間 斜率 截距 斜率 截距 均值 3.724 45.808 3.671 44.474 標(biāo)準(zhǔn)差 0.116 0.785 0.045 0.952 變異系數(shù) 3.106 1.714 1.

13、229 2.140,試劑a質(zhì)量穩(wěn)定性,同批號(hào)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的批間變異（即試劑盒批內(nèi)）為3.106%和1.714%。 不同批號(hào)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距的均值、標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.671、0.045和44.474、0.952，其批間變異（既試劑盒批間）為1.229%和2.14%。,HBV DNA 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率質(zhì)控圖,HBV DNA 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線截距質(zhì)控圖,優(yōu)點(diǎn),采用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與截距以及熒光背景的噪音和熒光曲線的陡度對(duì)其實(shí)施動(dòng)態(tài)質(zhì)量監(jiān)控，具有簡(jiǎn)捷、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn) 利用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與截距對(duì)定量PCR進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，可有效控制因試劑分裝質(zhì)量(反應(yīng)液/酶加入量)及酶活性而引發(fā)的

14、失控,四. 臨床PCR試劑盒的選用,PCR或RT-PCR試劑盒的組成 PCR試劑盒的分類 影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素 PCR試劑盒質(zhì)量指標(biāo) PCR試劑盒的選用原則,1、PCR或RT-PCR試劑盒的組成,核酸提取試劑 標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品 核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑 產(chǎn)物檢測(cè)試劑（有些使用全自動(dòng)分析儀的PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)完成，故無(wú)專門的產(chǎn)物檢測(cè)試劑）,2、PCR試劑盒的分類,定性測(cè)定： PCR-ELISA、PCR-膜上雜交、熒光PCR（分子信標(biāo)和Taq Man等） 定量測(cè)定： 熒光定量PCR 、PCR-ELISA定量等。,3、影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素,內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì) 外在因素： 試劑盒的運(yùn)輸和貯存,試劑盒的