1、全面分析蛋白質(zhì)印跡結(jié)果Q1。沒有任何東西原因:更多。如果只使用一張沒有任何顯色的x光片，很可能是一級抗體加到了其他抗體上，或者是二級抗體加錯(cuò)了，例如兔子的添加小鼠?！窘鉀Q方法】:仔細(xì)檢查抗體是否添加錯(cuò)誤，確保膜轉(zhuǎn)移沒有問題?！窘?jīng)驗(yàn)】:上圖顯示根本沒有信號。如果是這種情況，大多數(shù)情況下抗體的添加是不正確的。如果中間有細(xì)帶，可能的原因是蛋白質(zhì)樣品量太少，一級抗體濃度太低，ECL發(fā)光溶液失效。此外，如果膠片轉(zhuǎn)移有問題，如膠片倒轉(zhuǎn)，它自然會是白色膠片。Q2。高背景【原因】:密封性不夠好，一級抗體濃度高，洗膜時(shí)間和次數(shù)不夠。解決方法:降低一級抗體濃度，增加洗膜的時(shí)間和頻率。【經(jīng)驗(yàn)】:高背景可能是WB中最

2、常見的問題。目標(biāo)波段是單一和清晰的，但其他地方有更多的擴(kuò)散和統(tǒng)一的背景(連續(xù))。事實(shí)上，只要我們注意操作規(guī)范，就很容易避免偷工減料。按規(guī)定沖洗5分鐘*5次或10分鐘*3次，而不是5分鐘*3次或10分鐘*2次。Q3。非特定波段原因:一級抗體與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合解決方法:更換一級抗體經(jīng)驗(yàn):絕大多數(shù)此類病例是由于原發(fā)性耐藥性差。你不能判斷哪一個(gè)是目標(biāo)條。如果確實(shí)沒有更好的抗體，建議使用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個(gè)條帶是目標(biāo)條帶。當(dāng)然，在這種情況下，初級抗體濃度過高導(dǎo)致非特異性結(jié)合的可能性非常小。Q4。具有規(guī)則邊緣的白色圓圈出現(xiàn)在條帶中【原因】:電轉(zhuǎn)化過程中膜和膠之間存在氣泡?！窘鉀Q方法】:轉(zhuǎn)移

3、膠片前，先去除膠片和膠水之間的氣泡?！窘?jīng)驗(yàn)】:我們經(jīng)常往盤子里倒電液。倒出的液體不能太多或太少。最佳高度是與第一層濾紙齊平。然后在濾紙上倒一些電液，用清水清洗凝膠，將凝膠涂在濾紙上，仔細(xì)檢查濾紙和凝膠之間是否有氣泡，并左右前后觀察。在不同方向觀察后，我們可以確認(rèn)沒有氣泡。然后我們在凝膠上倒一些電液。用雙手的拇指和食指，輕輕夾住聚偏氟乙烯膜兩側(cè)的中間，使膜呈U形，然后將U形的底部與膠水的中間接觸，慢慢將膜向兩側(cè)放下，這樣通常會有很少的氣泡。然后上面的濾紙也以U形放置，用玻璃棒輕輕壓下，然后用海綿覆蓋。小心不要來回推動氣泡，否則會產(chǎn)生氣泡。Q5。白色出現(xiàn)在條的中間(突出顯示)【原因】:中部高濃度的

4、辣根過氧化物酶消耗底物太快，消耗完畢后中部底物不發(fā)光。解決方法:降低蛋白質(zhì)含量和一級抗體、二級抗體的濃度?！窘?jīng)驗(yàn)】:如果你夠快的話，可以在中間的基板被消耗掉之前固定好x光片，但是時(shí)間很難把握。建議從降低蛋白質(zhì)含量和一、二抗?jié)舛热胧帧6。出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑點(diǎn)【原因】:膜的其他部分與一級抗體或二級抗體非特異性結(jié)合解決方法:封閉的牛奶必須是純凈的，封閉后要清洗干凈【經(jīng)驗(yàn)】:我們經(jīng)常等到我們發(fā)現(xiàn)沒有牛奶的時(shí)候才想封起來，然后匆忙用PBST/TBST來配置。在匆忙的準(zhǔn)備過程中，我們經(jīng)常在沒有完全溶解的情況下加入牛奶來倒薄膜，這將導(dǎo)致大量不溶性顆粒粘附在薄膜上，這將導(dǎo)致發(fā)光時(shí)薄膜上出現(xiàn)黑點(diǎn)。因此，牛奶溶解后，

5、最好休息一會兒，然后輕輕吸上層的牛奶將其密封。密封完成后，必須在加入第一種抗體前清洗三次。Q7。剝離尾礦【原因】:蛋白質(zhì)量太大，一級抗的濃度和時(shí)間【經(jīng)驗(yàn)】:這種情況很容易發(fā)生，因?yàn)楹芏嘣驎?dǎo)致這種結(jié)果。一般來說，蛋白質(zhì)的量是我們經(jīng)過多次摸索后發(fā)現(xiàn)的最佳量，所以它不太可能是由過多的蛋白質(zhì)引起的。最可能的原因是一級抗體濃度過高，作用時(shí)間過長。另外，洗滌第一種抗體和第二種抗體，不要偷工減料。建議將抗體和蛋白質(zhì)洗滌5分鐘* 5次。洗滌這么多次后，不要洗滌抗體和蛋白質(zhì)。你不能用刀刮傷它。真正的抗原抗體組合不能用這種方法洗掉。Q8。出現(xiàn)雙圖像【原因】:熒光強(qiáng)度較高。壓片時(shí)，放在一邊后會輕微移動。【解決方

6、法】:放上x光片后，不要?jiǎng)?，即使傾斜也沒關(guān)系。【經(jīng)驗(yàn)】:有時(shí)恰好是上下顛倒，雙重形象會相對較弱。不要把抗體誤認(rèn)為是蛋白質(zhì)的另一種異構(gòu)形式。Q9。異質(zhì)背景出現(xiàn)【原因】:膜可能以前用過解決方法:在操作的每個(gè)步驟中，應(yīng)注意不要干燥薄膜?！臼褂媒?jīng)驗(yàn)】:封口時(shí)，先洗第一個(gè)抗體，再洗第二個(gè)抗體，發(fā)光時(shí)注意不要風(fēng)干蛋白面。這可能是風(fēng)干后的結(jié)果。注意與高背景的區(qū)別。Q10。帶材的變形【原因】:氣泡或不溶顆粒存在于】:大豆分離蛋白凝膠【解決方法】:配制膠水時(shí)要小心，使用無雜質(zhì)的液體?！窘?jīng)驗(yàn)】:許多實(shí)驗(yàn)室不使用最新的設(shè)備，如用于配膠的海綿墊。如果使用多年，小氣泡會從底部向頂部泄漏。當(dāng)氣泡足夠小，膠水很快凝固時(shí)，中

7、間的小氣泡會留在膠水中，影響后面膠水的流動。此外，用于配制膠水的水、十二烷基硫酸鈉和Tris緩沖液應(yīng)小心不要有雜質(zhì)。Q11。這個(gè)帶子是啞鈴形的原因:膠水有問題【解決方法】:調(diào)好膠水，不要使用不合格的膠水。【經(jīng)驗(yàn)】:啞鈴最容易出現(xiàn)，因?yàn)槟z水配置不當(dāng)，凝固后膠水不均勻。我不知道你們是否有以下膠水分布。下圖顯示了拔出梳子后的結(jié)果。如果你拔出梳子，圖的下部會呈現(xiàn)啞鈴形。另一種可能性是，樣品中含有太多未被離心的雜質(zhì)，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白質(zhì)自然地被推向兩邊。Q12。最邊緣條的彎曲【原因】:電泳電流不均勻解決方法:更換新的電泳槽；不使用兩側(cè)的兩個(gè)孔?！窘?jīng)驗(yàn)】:一般情況下，我們使用10孔膠水。如果你正好取樣10個(gè)孔，兩端的兩個(gè)孔肯定會變形。此外，最好將樣品放在膠水中間，使電場均勻。Q13。電泳中的現(xiàn)象和問題(1)整條呈“65078”狀：凝膠冷卻不均勻，電泳槽老化。(2)整個(gè)條帶是“:凝膠的左右兩端都沒有凝固好。(3)溴酚藍(lán)試驗(yàn)：樣品溶解不好。(4)縱向紋理：樣品中存在不溶性顆粒(5)溴酚藍(lán)非常粗糙：濃縮膠的濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短或濃縮膠不匹配。(6)不能在分離凝膠中運(yùn)行：三氯苯酚值錯(cuò)誤，或忘記添加十二烷基硫酸鈉。Q14。其他問題(1)蛋白質(zhì)的分子量高或低。可能是膠水的濃度與目標(biāo)蛋白的濃度不一致，例如，100KD蛋白用12%的膠水，20KD蛋白用6%的膠水。(2