1、一 實(shí)驗(yàn)名稱：細(xì)胞的復(fù)蘇二 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩龃娴募?xì)胞恢復(fù)活性三 實(shí)驗(yàn)原理：在低于-700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融化至37，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。四 實(shí)驗(yàn)步驟 一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備： 1.將水浴鍋預(yù)熱至37，將培養(yǎng)液預(yù)熱后分裝到培養(yǎng)皿中2.離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。 二取出凍存管：

2、 1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。 三迅速解凍： 1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。 四.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min 五.制備細(xì)胞懸液： 1.吸棄上清液。2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。 六.細(xì)胞計(jì)數(shù)： 細(xì)胞濃度以5105/ml為宜。 七.培養(yǎng)細(xì)胞：將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入375C

3、O2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤： 1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37。2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。版本2一、細(xì)胞復(fù)蘇的原則在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。二、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟（1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。（2）迅速放入 38水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在

4、1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細(xì)胞。（3）在1000r/min速度下離心510分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1109/L，置37溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代?；驘o需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)1224小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。三、注意事項(xiàng)在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí)，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-50）。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時(shí)也會(huì)有部分細(xì)胞死亡。此時(shí)，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（已死亡）的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液，也會(huì)獲得較為滿意的結(jié)果。1.DMSO是細(xì)胞內(nèi)防護(hù)液。DMSO能快速通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞冷凍過程中，維持細(xì)胞內(nèi)外的水和離子平衡。將DMSO與右旋糖苷等細(xì)胞外防護(hù)液組合使用效果更佳。2.在常溫下，DMSO是有細(xì)胞毒性的。因此在往細(xì)胞懸液中加DMSO時(shí)，要在冰水混合物中進(jìn)行，一方面避免加入DMSO時(shí)放熱，對細(xì)胞造成損傷；另一方面避免溫度較高時(shí)，對細(xì)胞的毒性。3.細(xì)胞冷凍時(shí)，DMSO的濃度一般控制在515%,不能再高，否則也對細(xì)胞有毒性。一般用冷凍管凍細(xì)