1、緒論分子生物學(xué)(molecular biology）:是在分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的共同語(yǔ)言。核心內(nèi)容是通過(guò)生物的物質(zhì)基礎(chǔ)核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用等運(yùn)動(dòng)規(guī)律的研究來(lái)闡明生命分子基礎(chǔ)，從而探討生命的奧秘。藥學(xué)分子生物學(xué)(pharmaceutical molecular biology)：由于分子生物學(xué)的新理論、新技術(shù)滲入到藥學(xué)研究領(lǐng)域，從而使藥物學(xué)研究以化學(xué)、藥學(xué)的培養(yǎng)模式轉(zhuǎn)化為以生命科學(xué)、藥學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的新藥模式。分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象：核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及相互作用分子生物學(xué)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用： 1、DNA重組技術(shù)與新藥研

2、究 2、藥物基因組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)與現(xiàn)代藥物研究 3、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)是基因、蛋白質(zhì)、疾病三者相連的橋 梁科學(xué)第1章 核酸的分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能核酸的基本結(jié)構(gòu)（重點(diǎn)掌握）： 磷酸 核苷 堿基 戊糖引起DNA構(gòu)象改變的因素： 核苷酸順序、堿基組成、鹽的種類、相對(duì)濕度。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 有利 氫鍵不利 疏水力穩(wěn)定性的影響：堿基堆積力靜電斥力mRNA: 遺傳信息真核生物的mRNA結(jié)構(gòu): 5帽子 5非編碼區(qū) 編碼區(qū) 3非編碼區(qū)3polyA原核生物的mRNA結(jié)構(gòu)：5非編碼區(qū) 調(diào)控序列編碼區(qū)終止子 起始調(diào)控序列編 碼區(qū)終止區(qū)3非編碼區(qū)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形 三級(jí)結(jié)構(gòu)：倒L形 功能： 接受氨基酸、攜帶

3、氨基酸，把氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，然后按照mRNA上的密碼順序裝配成多肽或蛋白質(zhì)。rRNA：組成核蛋白體核酸分子雜交的原理：復(fù)性（變性的DNA重新恢復(fù)成雙鏈的過(guò)程稱為復(fù)性也叫做退火。）反義RNA的作用機(jī)制（掌握）： 類反義RNA:直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分編 碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙 鏈RNA，從而易被RNA酶 降解； 類反義RNA：與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變 化，抑制翻譯； 類反義RNA：則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。 雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過(guò)程主要分為兩個(gè)階段（重點(diǎn)掌握）： 啟動(dòng)階段 執(zhí)行階段 啟動(dòng)階段：當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原因出現(xiàn)雙

4、鏈RNA分子時(shí)， 細(xì)胞中一種稱為Dicer的核酸酶就會(huì)識(shí)別這些雙 鏈RNA，并將其降解成21-23bp長(zhǎng)的小干擾RNA （siRNA），單鏈siRNA與一些蛋白形成復(fù)合體， 構(gòu)成“RNA誘導(dǎo)的沉默小體”（RISC） 執(zhí)行階段：當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNA完全配對(duì)時(shí)， RISC就會(huì)切割目標(biāo)RNA，并由細(xì)胞中的核酸酶將 其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)病毒核酸的特點(diǎn)（了解）：（1）病毒只含一種核酸，構(gòu)成病毒體的心髓。 （2）核酸類型多態(tài)化（3）分子量小，基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，所含基因組數(shù)目少（4）病毒基因組核酸復(fù)制多樣化（5）病毒核酸更易受宿主細(xì)胞的影響而發(fā)生基因突變和重組（6）有些病毒去

5、除囊膜和衣殼，裸露的DNA或RNA也能感染細(xì)胞， 這 樣的核酸成為傳染性核酸 第二章 染色質(zhì)、染色體、基因和基因組染色質(zhì)和染色體的化學(xué)成分和組成： DNA:脫氧核糖、磷酸、堿基 組蛋白：堿性氨基酸，帶正電，如精氨酸、賴氨酸。 非組蛋白：酸性氨基酸，帶負(fù)電，如天冬氨酸、谷氨酸。 少量RNA 酶 DNA和組蛋白的含量比較恒定，非組蛋白的含量變化較大，RNA的含量最少?；虻亩x：基因的生物學(xué)定義:是攜帶生物遺傳信息的結(jié)構(gòu)單位，又是控制 一個(gè)特定性狀的功能單位?；虻姆肿由飳W(xué)定義：指DNA分子中能編碼一條多肽鏈，并且 具有一定長(zhǎng)度的片段。嚴(yán)格地說(shuō)，基因不僅 包含編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA的核酸序列，還

6、 包括為保證轉(zhuǎn)錄所必須的調(diào)控序列?；蚪M(genome)：是細(xì)胞中一套完整單體遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M結(jié)構(gòu)的異同：原核生物真核生物基因組很小基因組龐大復(fù)雜，含多種序列成分幾乎無(wú)蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體有操縱子結(jié)構(gòu)基因家族化，有重復(fù)序列基因多連續(xù)，有重疊基因（真核細(xì)胞病毒除外）基因不連續(xù)多順?lè)醋訂雾樂(lè)醋右詥慰截惡投嗫截悆煞N形式存在以單拷貝和多拷貝兩種形式存在第三章、可移動(dòng)的遺傳因子（轉(zhuǎn)座子)和染色體外的遺傳因子 轉(zhuǎn)座子(transposon)：原核生物和真核生物基因組中存在著可以從 一個(gè)部位轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)部位的DNA序列，這些序列稱為轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retransposon）:

7、指內(nèi)部含逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列，通過(guò)DNA RNA DNA方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，即轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA，再經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生成新的轉(zhuǎn)座子DNA并整合到基因組中。質(zhì)粒（plasmid）:是多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子。遺傳重組（genetic recombination）:減數(shù)分裂時(shí)，通過(guò)同源染色體的交換和非同源染色體的獨(dú)立分配，使子代細(xì)胞的遺傳信息產(chǎn)生了重新組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳重組。同源重組（homologous recombination）:指發(fā)生在兩條雙鏈DNA的同源序列之間，涉及的是大片段同源DNA序列的交換。位點(diǎn)特異重組（site-specific recombinati

8、on）:指不依賴于DNA序列的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA序列的重組。簡(jiǎn)述原核生物轉(zhuǎn)座子的類型及組成特點(diǎn)：IS兩端有ITR,只能編碼轉(zhuǎn)座酶；類轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)同IS，但不能獨(dú)立存在，僅作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子的兩端組件；復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩端由IS或類IS構(gòu)成，可編碼抗性物質(zhì)；TnA轉(zhuǎn)座子家族兩端為ITR,可編碼轉(zhuǎn)座酶、解離酶和抗性物質(zhì)。解釋逆轉(zhuǎn)錄病毒與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的區(qū)別： 轉(zhuǎn)錄病毒是具有感染能力的病毒顆粒，可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移；逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA基因組的組分，可以在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座， 但是不能在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。簡(jiǎn)述質(zhì)粒DNA特性： 質(zhì)粒的復(fù)制 嚴(yán)密型質(zhì)粒的復(fù)制 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制 質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒的

9、轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記試述大腸桿菌同源重組酶的特點(diǎn)（p92）： RecBCD:具有外切核酸酶活性，序列特異性的單鏈內(nèi)切酶的活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈、ATPase活性水解ATP為解旋提供能量； RecA：有單、雙鏈DNA結(jié)合活性，有ATPase的活性，并且促進(jìn)各種DNA分子進(jìn)行同源配對(duì)或分子入侵，形成同源配對(duì)的聯(lián)合分子； RuvAB：RuvA：識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn) RuvB：為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase） 憑借其解旋酶活性，推動(dòng)Holliday中間體的分支遷移； RuvC：是一種核酸內(nèi)切酶-專一性識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)。同源重組與位點(diǎn)特異重組

10、有何不同： 同源重組中DNA鏈的切斷可能是隨機(jī)的； 位點(diǎn)特異性重組是在某些特異的DNA序列處發(fā)生重組。 同源重組后染色體內(nèi)的DNA序列一般仍按原來(lái)的順序排列； 位點(diǎn)特異性重組中DNA節(jié)段的相對(duì)位置發(fā)生了移動(dòng)，即DNA 序列發(fā)生重排，從而得到不同的結(jié)果。Holliday模型的步驟： 1、兩個(gè)DNA分子單鏈的同一部位發(fā)生斷裂； 2、兩個(gè)斷裂的單鏈的游離末端彼此交換，連接形成holliday連接體； 3、通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生同另一分子的互補(bǔ)序列形成異源雙鏈DNA； 4、Holliday交叉的上部或下部旋轉(zhuǎn)180，中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體的DNA。分別為片段重組體和拼接重組體。第4章 DNA

11、的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)復(fù)制（replication）:遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。半保留復(fù)制：DNA生物合成時(shí)，母聯(lián)DNA解開(kāi)為兩條單鏈，各自作為模板按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板鏈互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA ，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。復(fù)制子：兩個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)之間的DNA片段。復(fù)制叉：DNA分子復(fù)制時(shí)，復(fù)制起點(diǎn)兩條鏈解開(kāi)成單鏈狀態(tài)所形成的Y形結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。使DNA鏈解離的酶：（1）解旋酶利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。 （2）單鏈DNA結(jié)合蛋白 SSB在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。（3）DNA

12、旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈。DNA聚合酶：原核生物：DNA-pol: 對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)DNA-pol DNA-pol: 是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。 真核生物：DNA聚合酶：合成后隨鏈，引物酶活性DNA聚合酶：DNA修復(fù)DNA聚合酶:先導(dǎo)鏈合成DNA聚合酶：線粒體DNA 的合成DNA聚合酶：機(jī)制不明類似于端粒：真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。2、末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。端粒的功能：1、維持染色體的穩(wěn)定性；2、維持DNA復(fù)制的完整

13、性端粒酶的組成：端粒酶RNA；端粒酶協(xié)同蛋白；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶影響端粒酶的藥物：1、反義核酸；2、核酶；3、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：3-疊氮胸苷（AZT）線粒體DNA復(fù)制：D環(huán)復(fù)制噬菌體和病毒DNA的復(fù)制：滾環(huán)復(fù)制AZT的作用原理：逆轉(zhuǎn)錄酶合成病毒DNA時(shí)，AZT摻入到病毒DNA中，由于AZT的3-OH被疊氮取代，所以不能合成3-5磷酸二酯鍵，使病毒DNA合成終止。（HIV治療）突變可分為：自發(fā)突變；誘發(fā)突變突變類型 堿基置換突變 點(diǎn)突變 （轉(zhuǎn)換、顛換） 單點(diǎn)突變 堿基插入（較長(zhǎng)） 多點(diǎn)突變 堿基缺失（較長(zhǎng)）移碼突變：插入、缺失一個(gè)或兩個(gè)堿基引起閱讀框架的改變 移碼突變：是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造

14、成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。 根據(jù)密碼子遺傳信息改變分類：同義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變根據(jù)突變表現(xiàn)型對(duì)外界環(huán)境的敏感性分類：非條件性突變、條件性突變突變型與野生型的變換：正相突變、回復(fù)突變突變?cè)颍海ㄒ唬┳园l(fā)突變（脫氨基、脫嘌呤）（二）誘發(fā)突變射線化學(xué)誘變劑（）堿基類似物（）氨基嘌呤（）堿基修飾劑（亞硝酸、羥胺、烷化劑）（）插入劑（3） 基因的人工誘變DNA 的修復(fù)系統(tǒng)：尿嘧啶糖基酶系統(tǒng) 一、復(fù)制修復(fù)錯(cuò)配修復(fù) 無(wú)嘌呤（AP）修復(fù)光復(fù)活修復(fù) 二、損傷修復(fù)甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù) 切除修復(fù) 三、復(fù)制后修復(fù) 大腸桿菌的重組修復(fù)系統(tǒng)SOS修復(fù)光復(fù)活修復(fù)（原理）：胸腺嘧啶在uv的作用下生成TT二聚體（胸腺嘧啶

15、二聚體），光復(fù)活酶在藍(lán)光的照射下激活，是二聚體解離。限制與修飾 限制：限制性內(nèi)切酶切斷外來(lái)的DNA 修飾：甲基化酶保護(hù)細(xì)胞自身的DNA渥曼青霉素的作用機(jī)制：（抑制腫瘤細(xì)胞）抑制DNA損傷修復(fù)的蛋白激酶的活性，DNA的修復(fù)功能減弱，增加多耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。第5章 轉(zhuǎn)錄 、轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄（transcription）：生物體以DNA為模板合成RNA 的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄單位：RNA鏈的生物合成起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)處終止，這一特定區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位。（位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)到轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)之間的DNA模板區(qū)域。）不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄選擇性稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。 有兩方面含義：（1）在DNA分子雙鏈上，

16、一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄； （2）模板鏈并非總是在同一單鏈上復(fù)制與轉(zhuǎn)錄相同點(diǎn)：以DNA為模板；由5向3方向延長(zhǎng)；反應(yīng)體系需要Mg2+區(qū)別：?jiǎn)?dòng)子（promoter）：是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的位于轉(zhuǎn)錄單位上游的一段具有高度保守性DNA序列。原核生物啟動(dòng)子：1、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)保守序列2、-10序列(Pribnow框）3. -35序列(Sextama框）4. 作用部位間隔區(qū): 17bp轉(zhuǎn)錄效率最高5. CAP結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶II的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)：1、起始子；2、TATA框(-25)；3、CAAT框(-75)；4、 GC框(-90)；5、增強(qiáng)子(遠(yuǎn)上游序列)增強(qiáng)子（enhanc

17、er):1、遠(yuǎn)上游序列；2、轉(zhuǎn)錄頻率增強(qiáng)； 3、增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和方向無(wú)關(guān)；4、大多為重復(fù)序列；5、組織特異性、細(xì)胞特異性；6、無(wú)基因?qū)Ｒ恍裕?7、受外部信號(hào)調(diào)控原核生物轉(zhuǎn)錄起始：需要RNA聚合酶全酶（；兩個(gè)、,后四個(gè)為核心酶）因子：NTP酶的活性；解旋酶的活性。莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理：（非依賴因子的終止）使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF) ：RNA聚合酶在起始轉(zhuǎn)錄時(shí)，需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，稱之為轉(zhuǎn)錄因子。（真核生物）RNA生物合成抑制劑： 利福霉素：抑制細(xì)菌RNA聚合酶（抑制

18、聚合酶的活性 起始階段） 利迪鏈霉素：抑制細(xì)菌RNA聚合酶（作用于亞基抑制延長(zhǎng)） a-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶（抑制聚合酶活性）真核生物mRNA前體加工：（1）5端加帽（加帽酶；甲基轉(zhuǎn)移酶；5-5三磷酸二酯鍵；5端有N7-甲基鳥(niǎo)苷酸）；（2）3末端PolyA（聚腺苷酸化）;（3）內(nèi)含子剪接；（4）甲基化帽子結(jié)構(gòu)的功能: 1、增加mRNA穩(wěn)定性，使mRNA免遭核酸酶的攻擊。2、為核蛋白體識(shí)別mRNA提供信號(hào)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成。3、促進(jìn)某些RNA的合成。 內(nèi)含子分類：I： 線粒體、葉綠體及某些低等真核生物,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是rRNAII：線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA III：細(xì)胞核，形

19、成套索結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA IV：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是tRNA第I類的內(nèi)含子的自我剪接：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是rRNA自身催化過(guò)程（經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）： （1）鳥(niǎo)核苷-OH攻擊第一個(gè)外顯子與內(nèi)含子之間的磷酸二酯鍵 （2）第一個(gè)外顯子3-OH攻擊內(nèi)含子與第二個(gè)外顯子之間的磷酸二酯鍵 （3）兩個(gè)外顯子相連第III類的內(nèi)含子的自我剪接：GU-AG規(guī)則（套索結(jié)構(gòu)）tRNA前體的加工： 1、 核酸內(nèi)切酶在tRNA兩端切斷 2、核酸外切酶在3端逐個(gè)切去附加的堿基 3、在3端加上-CCA-OH 4、核苷的修飾(堿基修飾：甲基化；還原反應(yīng)；核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)；脫氨反應(yīng))。第六章 蛋白質(zhì)生物合成翻譯及翻譯后過(guò)程 蛋白質(zhì)生物合成的概

20、念蛋白質(zhì)生物合成也稱翻譯，是生物細(xì)胞以mRNA 為模板，按照mRNA分子中核苷酸的排列順序所組成的密碼信息合成蛋白質(zhì)的過(guò)程。蛋白質(zhì)生物合成體系： 基本原料：20種編碼氨基酸 模板：mRNA 適配器：tRNA 裝配機(jī)：核蛋白體 主要酶和蛋白質(zhì)因子：氨基酰-tRNA合成酶、轉(zhuǎn)肽酶、起始因子、延長(zhǎng)因子、釋 放因子等 能源物質(zhì)：ATP、GTP 無(wú)機(jī)離子：Mg2+、 K+開(kāi)放閱讀框架(open reading frame, ORF)：從mRNA 5-端起始密碼子AUG到3-端終止密碼子之間的核苷酸序列，稱為開(kāi)放閱讀框架密碼子（codon）：在mRNA的開(kāi)放閱讀框架區(qū)，以每3個(gè)相鄰的核苷酸為一組，代表一種

21、氨基酸(或其他信息)，這種三聯(lián)體形式的核苷酸序列稱為密碼子。遺傳密碼的性質(zhì)：方向性、連續(xù)性、簡(jiǎn)并性、擺動(dòng)性、通用性、偏愛(ài)性擺動(dòng)性： 反密碼子與密碼子之間的配對(duì)有時(shí)并不嚴(yán)格遵守常見(jiàn)的堿基配對(duì)規(guī)律，這種現(xiàn)象稱為擺動(dòng)配對(duì)。原核生物mRNA的特點(diǎn)（重點(diǎn)）1、 半衰期較短，僅為幾分鐘2、SD序列: 起始AUG上游, -AGGA-保守序列，是核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)。3、多順?lè)醋樱涸思?xì)胞中數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA 可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順?lè)醋?polycistron) 。真核生物mRNA的特點(diǎn)（重點(diǎn)）1、轉(zhuǎn)錄和翻譯分別在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中完成。2、半衰期相對(duì)較長(zhǎng)（幾小時(shí)甚至幾

22、天）3、Kozak 序列：mRNA起始密碼子處的一段保守序列-CCACCAUGG-，能增加翻譯起始的效率。4、單順?lè)醋诱婧松? 起始氨基酰-tRNA: Met-tRNAiMet 參與肽鏈延長(zhǎng)的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet原核生物：起始氨基酰-tRNA: fMet-tRNAfMet N-甲酰甲硫氨酰-tRNA原核生物mRNA在核蛋白體小亞基上的準(zhǔn)確定位和結(jié)合涉及兩種機(jī)制：1.小亞基中的16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶堿基的短序列，通過(guò)與S-D序列堿基互補(bǔ)而使mRNA與小亞基結(jié)合。2.mRNA序列上緊接S-D序列后的核苷酸序列，可被核蛋白體小亞基蛋白rpS-1識(shí)別并結(jié)合。原核生

23、物的肽鏈合成起始：指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物的過(guò)程。（1） 核蛋白體大小亞基分離；（IF-3）（2） mRNA在小亞基定位結(jié)合；（3） 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； (IF-1、IF-2、GTP)（4） 核蛋白體大亞基結(jié)合。延長(zhǎng)：1. 進(jìn)位(positioning)/注冊(cè)(registration)(EF-Tu和EF-Ts催化) 2. 成肽(peptide bond formation)（肽?；D(zhuǎn)移酶） 3. 轉(zhuǎn)位(translocation)（轉(zhuǎn)位酶）核蛋白體循環(huán)：肽鏈延長(zhǎng)在核蛋白體上連續(xù)循環(huán)式進(jìn)行，又稱為核蛋白體循環(huán)。多聚核蛋白體：1條mRNA模

24、板鏈都可附著10100個(gè)核蛋白體，這些核蛋白體依次結(jié)合起始密碼子并沿53方向讀碼移動(dòng)，同時(shí)進(jìn)行肽鏈合成，這種mRNA與多個(gè)核蛋白體形成的聚合物稱為多聚核蛋白體。蛋白質(zhì)生物合成阻斷劑（P205208） 1. 抗生素類阻斷劑（嘌呤霉素、氯霉素、放線菌酮） 2. 抗代謝藥物（長(zhǎng)春新堿、三尖杉酯堿） 3. 白喉毒素（使eEF-2失活-糖基化，阻斷蛋白質(zhì)合成） 4. 干擾素 (使eIF-2失活-磷酸化; 降解病毒mRNA)分子伴侶：是細(xì)胞內(nèi)一類可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象、促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊的保守蛋白質(zhì)。分子伴侶有以下功能：封閉待折疊蛋白質(zhì)的暴露的疏水區(qū)段；創(chuàng)建一個(gè)隔離的環(huán)境，可以使蛋白質(zhì)的折

25、疊互不干擾；促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和去聚集。翻譯后加工修飾：（一）側(cè)鏈氨基酸的微小修飾 1. 二硫鍵的形成 2.甲基化、磷酸化及乙?；ǘ┘羟泻图艚蛹庸?1新生肽鏈N端的切除 2剪切 （1）信號(hào)肽的切除 （2）前體蛋白加工 （3）活性肽的剪切釋放（三）添加化學(xué)基團(tuán)第八章 基因工程及其在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用基因工程的基本原理（簡(jiǎn)答題）：獲取目的基因選擇和構(gòu)建載體目的基因與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體的篩選克隆基因的表達(dá)限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的3種粘性末端： 5-粘性末端；3-粘性末端；平頭末端影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：1、 DNA的純度2、DNA甲基化程度3、底物DNA的分子構(gòu)型4、反應(yīng)溫度5、反應(yīng)

26、系統(tǒng)組成：緩沖液、pH等6、酶量、反應(yīng)體積、酶切時(shí)間合理使用DNA連接酶 (DNA ligase)：催化DNA中相鄰的5-磷酸基和3-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接。DNA連接酶的分類：(1) T4噬菌體DNA連接酶 連接粘性末端或平末端的DNA分子(2)大腸桿菌DNA連接酶 只能連接粘性末端DNA和RNA的修飾酶：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾 堿性磷酸酶切除5-末端的磷酸限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？ 不能。 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA的特異序列（回文序列）， 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA。DNA聚合酶和DNA連接酶有何不同點(diǎn)？

27、 1、DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用，在基因工程中起作用。 2、 DNA聚合酶：主要是在DNA片段末端連接上單個(gè)脫氧核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用 3、DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)切口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板 4、DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；載體必備條件： 1、能自主復(fù)制；2、有多克隆位點(diǎn)（MCS）；3、具有遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；4、分子量小，以容納較大的外源DNA。質(zhì)粒(plasmid)：是細(xì)菌染色體外的遺傳單位，環(huán)狀雙鏈DNA分子。存在于宿主細(xì)胞內(nèi)、獨(dú)立于染色

28、體外的、自主復(fù)制的遺傳成分?？寺≥d體 (cloning vector): 能使插入的外源DNA序列被復(fù)制、擴(kuò)增而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體表達(dá)載體: 為使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體稱表達(dá)載體。藍(lán)白篩選：質(zhì)粒上存在LacZ序列，該序列能編碼-半乳糖苷酶N端，而細(xì)菌染色體能編碼-半乳糖苷酶C端, 形成互補(bǔ)產(chǎn)生了具有活性的-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基里存在的X-gal被雜合的-半乳糖苷酶水解，形成藍(lán)色化合物，因此在平板上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。而LacZ序列上存在多克隆位點(diǎn)，由于目的基因的插入，破壞了LacZ的結(jié)構(gòu)，無(wú)法產(chǎn)生功能性的-半乳糖苷酶，不能水解X-gal，不能生成藍(lán)色化合物，

29、所以平板上出現(xiàn)白色菌落，白色菌落為陽(yáng)性克隆的菌落。DNA重組: 不同來(lái)源DNA分子通過(guò)共價(jià)連接（磷酸二酯鍵）而組合成新的DNA分子的過(guò)程。大腸桿菌載體按功能分類：（1）克隆載體（2）表達(dá)載體（3）穿梭載體*原核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)元件是： 啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)大腸桿菌基因表達(dá)載體分為3個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組體的選擇系統(tǒng)：復(fù)制子、選擇標(biāo)記外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：?jiǎn)?dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、抑制物基因蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子穿梭載體（shuttle vector)：原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)。 真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的

30、選擇標(biāo)記基因。采用不同方法獲取目的基因（簡(jiǎn)答題）：基因序列已知基因序列未知基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)聚合酶鏈反應(yīng)化學(xué)合成法基因組DNA文庫(kù)（名解）：存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。 PCR 反應(yīng)體系：1、模板DNA ；2、dNTP；3、引物；4、Tag DNA聚合酶；5、緩沖液。 步驟：模板DNA變性；模板DNA與引物退火；引物延伸。人工合成基因局限性：1、長(zhǎng)度：60bp；2、中性突變：密碼子選擇需注意；3、二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)結(jié)構(gòu)影響拼接；4、合成費(fèi)用高。載體與目的基因的連接主要有以下5種連接方式：（選擇簡(jiǎn)答）1、粘性末端連接2、平頭末端連接3、銜接體（linker）技

31、術(shù)4、同源多聚尾連接法5、人工接頭（adaptor）技術(shù)粘性末端的連接方式：（選擇）1、插入失活法（單酶切）2、定向克隆法（雙酶切）3、載體5端脫磷法（CIP）基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較（10分）：基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建：cDNA文庫(kù)的建立： 組織或細(xì)胞染色體DNAmRNA 限制性內(nèi)切酶反轉(zhuǎn)錄酶基因片段cDNA第一鏈克隆載體復(fù)制重組DNA分子雙鏈cDNA受體菌載體含重組分子的轉(zhuǎn)化菌重組DNA分子（基因文庫(kù)）受體菌cDNA文庫(kù)1、cDNA文庫(kù)比基因組DNA文庫(kù)小得多。2、從cDNA文庫(kù)篩選基因比較容易。3、基因組DNA文庫(kù)：內(nèi)含子和外顯子4、cDNA文庫(kù)：只有外顯子感受態(tài)細(xì)胞(comp

32、etent cell)： 用特殊方法（CaCL2）處理后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力， 這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。重組基因?qū)朐思?xì)胞：CaCl2轉(zhuǎn)化法重組基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的方法：1、磷酸鈣轉(zhuǎn)染；2、電穿孔；3、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染；4、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；5、顯微注射。重組體的篩選鑒定方法主要有：1、遺傳學(xué)方法2、核酸雜交法（鑒定）3、免疫學(xué)方法（鑒定）4、利用PCR方法篩選重組子5、酶切鑒定6、DNA測(cè)序（鑒定）核酸分子雜交法主要包括：（一）菌落原位雜交（二）Southern印跡（DNA）（三）斑點(diǎn)印跡（四）Northern印跡（RNA）PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須

33、預(yù)先得到什么樣的信息?答： (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。 (2)至少要預(yù)先知道足夠合成一對(duì)引物的靶DNA序列。第七章 基因表達(dá)的調(diào)控基因表達(dá)(gene expression)： 是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程，即：生成具有生物學(xué)功能產(chǎn)物的過(guò)程?？烧T導(dǎo)基因：在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因。誘導(dǎo)(induction)：可誘導(dǎo)基因在特定環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過(guò)程，稱為誘導(dǎo)(induction)?？勺瓒艋颍喝绻?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，基因表達(dá)產(chǎn)物減少，這種基因是可阻遏基因。阻遏(repression)：可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)

34、物水平降低的過(guò)程稱為阻遏(repression)基因表達(dá)的調(diào)控方式: 阻遏負(fù)調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達(dá) (相應(yīng)蛋白質(zhì)降低) 促進(jìn)正調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達(dá) (相應(yīng)蛋白質(zhì)增加)順式作用元件：與相關(guān)基因處在同一個(gè)DNA分子上，起調(diào)控作用的DNA序列。反式作用因子：對(duì)一個(gè)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用的另一個(gè)基因的產(chǎn)物。乳糖操縱子色氨酸操縱子（轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控）熱休克應(yīng)答反應(yīng)：4250，大腸桿菌常規(guī)蛋白質(zhì)合成開(kāi)始關(guān)閉或下降，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白，與32有關(guān)。沉默子(silencer)：某些基因的負(fù)性調(diào)節(jié)元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。真核生物的基因

35、表達(dá)調(diào)控：一、 染色體重排的調(diào)控二、 染色質(zhì)水平調(diào)控 （一）活性染色質(zhì) DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化；2. 對(duì)核酸酶（DNase I)敏感（二）組蛋白的修飾 乙酰化修飾 作用：降低核小體的穩(wěn)定性磷酸化修飾 作用：降低與DNA的親和力三、DNA水平調(diào)控 （一）基因的丟失、擴(kuò)增與重排（二）DNA的甲基化和去甲基化四、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 （一）順式作用元件：?jiǎn)?dòng)子；增強(qiáng)子；沉默子（二）反式作用因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分類（按功能特性） 基本轉(zhuǎn)錄因子特異轉(zhuǎn)錄因子五、翻譯水平調(diào)控 （一） 5UTR結(jié)構(gòu)（UTR非翻譯區(qū)） （帽子結(jié)構(gòu)、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、先導(dǎo)序列） （二）蛋白因子磷酸化 （三） 3UTR結(jié)構(gòu)六、小分子RNA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控（P299） 1小干擾RNA與基因沉默 2微小RNA與基因沉默螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋鋅指結(jié)構(gòu)堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)： DNA結(jié)合域螺旋-環(huán)-螺旋（填空） 酸性激活域轉(zhuǎn)錄激活域谷氨酰胺富活域 脯氨酸富含域第七章 基因表達(dá)的調(diào)控基因表達(dá)(gene expression)： 是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程，即：生成具有生物學(xué)功能產(chǎn)物的過(guò)程?？烧T導(dǎo)基因：在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，