1、蛋白質(zhì)相互作用的概述一、為什么要研究蛋白質(zhì)相互作用二、蛋白質(zhì)相互作用親和力：kd=ab/ab 三、蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用 a、利用抗原和抗體的相互作用：western blot，免疫共沉淀，染色質(zhì)沉淀，抗體篩庫(kù) b、 利用已知的相互作用建立tag：gst pull down，biotinavidin結(jié)合， c、直接利用蛋白質(zhì)的相互作用：蛋白質(zhì)親和層析，酵母雙雜交，phage display，bait蛋白質(zhì)篩表達(dá)庫(kù)，蛋白質(zhì)組 四、相互作用的生物學(xué)意義：蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。 五、生物學(xué)功能的研究：獲得功能或失去功能i、 一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù) traditional co-p

2、urification (chromatography co-purification and co-sedimentation) affinity chromatography：gst pull down ，epitope-tag (co-)immunoprecipitation western和 far-western blotsurface plasmon resonancetwo-hybrid system fluorescence resonance energy transfer (fret)（實(shí)驗(yàn)過(guò)程及原理，注意事項(xiàng)，優(yōu)缺點(diǎn)）iii、研究實(shí)例討論一、酵母雙雜交系統(tǒng) 作用：發(fā)現(xiàn)新的

3、相互作用蛋白質(zhì)；鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用；確定蛋白質(zhì)相互作用的功能基團(tuán)具體過(guò)程：見書本優(yōu)點(diǎn)：是酵母細(xì)胞的in vivo相互作用；只需要cdna，簡(jiǎn)單；弱的相互作用也能檢測(cè)到缺點(diǎn)：都是融合蛋白，萬(wàn)一融合出新的相互作用；酵母的翻譯后修飾不盡相同，尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾；自身激活報(bào)告基因；基因庫(kù)德要求比較高，單向1/3是in frame蛋白質(zhì)毒性；第三者z插足介導(dǎo)的相互作用；假陽(yáng)性酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟 動(dòng)子，啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，如果檢測(cè)到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說(shuō)明兩者

4、之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列 化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實(shí)際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。（1）原理：將編碼某一蛋白x的dna序列與dna結(jié)合域bd的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白y的dna序列與dna激活域ad的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有dna結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若x和y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若x和y可相互作用，則使bd和ad靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)x

5、和y的相互作用。 (2)應(yīng)用范圍1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過(guò)對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與bd基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cdna文庫(kù)與ad基因構(gòu)建成“獵物”基因庫(kù)，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cdna序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。1） 二、噬茵體展示技術(shù) 在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的dna序列，當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)時(shí)，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過(guò)柱，柱上若含目的蛋白， 就會(huì)與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合

6、，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，還具有直接得到基因、高選擇 性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過(guò)程中通過(guò)適當(dāng)改變條件可以直接評(píng)價(jià)相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點(diǎn)。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細(xì)胞 系的cdna文庫(kù)，并分離出了人上皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的信號(hào)分子。 三、等離子共振技術(shù) 表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmonresonance，spr)已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用 一種納米級(jí)的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測(cè)蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)便可知這兩種蛋白

7、的結(jié)合情況。spr技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是 不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過(guò)程可實(shí)時(shí)監(jiān)控。測(cè)定快速且安全，還可用于檢測(cè)蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。 四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù) （fluorescence resonance energy transfer，fret）fret：優(yōu)點(diǎn)：體內(nèi)測(cè)定兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用；敏感度高；溶解度好？；大分子的主要構(gòu)象變化能測(cè)定；定量和定性測(cè)定相互作用。缺點(diǎn)：只能測(cè)定熒光基團(tuán)大小為（20-100）的分子；儀器設(shè)備很貴；需要熒光標(biāo)記 fret可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。 基本原理：在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體 donor）的發(fā)射

8、光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體 acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)（一般小于100 ），就可觀察到熒光能量由供體向受體共振轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，可觀察到后一個(gè)基團(tuán)發(fā)射的熒光。其中以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, gfp)及其突變體的應(yīng)用最為廣泛。 特點(diǎn)：a 反映在當(dāng)時(shí)活細(xì)胞生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程;b 兩個(gè)熒光集團(tuán)間的合適距離為20100 （210nm）;c 需用熒光或gfp標(biāo)記測(cè)試蛋白。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用;與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有

9、關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、 dna和rna的時(shí)空信息。隨著綠色熒光蛋白（gfp）的發(fā)展，fret熒光顯微鏡有可能實(shí)時(shí)測(cè)量活體細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測(cè)量 fret效率以及供體與受體間距離的簡(jiǎn)單方法，僅需使用一組濾光片和測(cè)量一個(gè)比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串?dāng)_。該方法簡(jiǎn)單快速，可實(shí)時(shí)定量 測(cè)量fret的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于gfp的供體受體對(duì)。 fret就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時(shí)，將光子能從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體）。當(dāng)它們足夠接近時(shí)，用cfp的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，cfp的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率

10、地共振轉(zhuǎn)移至yfp的發(fā)色基團(tuán)上，所以cfp的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是yfp的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對(duì)空間位置的改變非常靈敏。例如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)fret原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：cfp（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、 yfp(yellow fluorescent protein)。用cfp吸收波長(zhǎng)433nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì)，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時(shí)，cfp與yfp相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測(cè)到的是cfp的發(fā)射波長(zhǎng)為476n

11、m的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使cfp與yfp充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是yfp的發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的熒光(圖1)。將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集 成化，高通量化的抗體芯片就是一個(gè)非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)

12、展， 比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個(gè)領(lǐng)域里。 六、免疫共沉淀技術(shù) 免疫共沉淀主要是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)，其基本原理是，在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特 異結(jié)合的結(jié)合于pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白a(spa)，若細(xì)胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白 興趣蛋白抗興趣蛋白抗體spa|pansobin”，因?yàn)閟pa|pansobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時(shí)就被分離出來(lái)。經(jīng)變性聚丙烯酰胺 凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開。然后經(jīng)westernblotting法，用抗體檢測(cè)目的蛋白是什么，是

13、否為預(yù)測(cè)蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì) 胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的蛋白可信度高。（1）原理當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔缺點(diǎn)：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中 間起橋梁作用；二是必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性,三是可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)

14、蛋白質(zhì)相互作用七、pull-down技術(shù) 蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時(shí)型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見，最好通過(guò)免疫共沉淀（co- ip）、pull-down技術(shù)或far-western法研究。pull-down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、 polyhis-或gst-），從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過(guò)pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間 的相互作用關(guān)系，從體外傳路或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用關(guān)系。 1）原理細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（gst）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將gst融

15、合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀gst融合蛋白的能力來(lái)確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用gst沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。兩種應(yīng)用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用 2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用生物學(xué)意義是一切：1）通過(guò)改變蛋白質(zhì)的相互作用，分析由蛋白質(zhì)相互作用改變而產(chǎn)生的生物學(xué)現(xiàn)象。如通過(guò)酵母雙雜交或蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。人們?nèi)菀追傅腻e(cuò)誤是：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些

16、相互作用有什么生物學(xué)意義。2）通過(guò)改變生物學(xué)現(xiàn)象，分析其中相關(guān)的蛋白質(zhì)以及相互作用。如小分子化合物抑制了某一生物學(xué)活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變化的蛋白質(zhì)，再分析蛋白質(zhì)的功能和作用。人們?nèi)菀追傅腻e(cuò)誤是：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相互作用的親和力是技術(shù)的基礎(chǔ)。kd=ab/ab。kd越小，親和力越好?？贵w的親和力為10-8 -10-10 m是好,10-6m是弱蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用和相互作用蛋白利用抗原和抗體的相互作用的技術(shù)：1） westrern blot：變性抗原，主要用于檢測(cè)蛋白的存在與否2） 免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用abpr1pr2：免疫共沉淀。p

17、r1abpr2：非特異性結(jié)合3） 染色質(zhì)沉淀：用抗體沉淀抗原得到與抗原結(jié)合的dna，用pcr鑒定dna，從而證明蛋白質(zhì)和特定dna間的相互作用。4） 過(guò)時(shí)的抗體篩選：cdna表達(dá)庫(kù)，抗體結(jié)合表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而得到基因。有了質(zhì)譜和pcr后過(guò)時(shí)。利用已知的相互作用建立tag：1） gst pull down ：已知蛋白質(zhì)和gst融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。gst tag2） biotin-avidin結(jié)合：生物素標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過(guò)avidin結(jié)合生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與生物素標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是biotinavidin的

18、結(jié)合是最牢靠的；缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。3） 其它各種tag。例子？ 生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，bas）是以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級(jí)放大效應(yīng)。 自20世紀(jì)70年代，bas開始應(yīng)用于免疫化學(xué)領(lǐng)域以來(lái)，利用bas可被熒光索、酶、放射性核素等材料標(biāo)記的特點(diǎn)而發(fā)展和建立了許多新的檢測(cè)方法和技術(shù)，尤其是與免疫標(biāo)記技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，極大地提高了測(cè)定的靈敏度。直接利用蛋白質(zhì)的相互作用：1） 蛋白質(zhì)親和層析：用蛋白質(zhì)當(dāng)親和層析的親和基團(tuán)。要有大量的蛋白質(zhì)2）

19、酵母雙雜交：優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)是不能得到修飾調(diào)控型的相互作用蛋白質(zhì)。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。3） 噬菌體展示：physically固定蛋白質(zhì)，結(jié)合phage，洗脫，擴(kuò)增phage，再結(jié)合；循環(huán)4） 快成化石的bait蛋白質(zhì)篩表達(dá)庫(kù)：bait蛋白質(zhì)用同位素、gst、等標(biāo)記，再篩庫(kù)。5） 一網(wǎng)打盡的 蛋白質(zhì)組：這是檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的方法。由于檢測(cè)和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多常常超出人們的辨別能力和研究能力。技術(shù)成果的鑒定：蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能是蛋白質(zhì)相互作用的意義1） 相互作用的證實(shí)：不同的發(fā)現(xiàn)互

20、相作用的技術(shù)都可以用來(lái)被驗(yàn)證相互作用的蛋白質(zhì)。如gst pull down 發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，用免疫共沉淀或酵母雙雜交驗(yàn)證。越接近生理狀態(tài)的證實(shí)越好。驗(yàn)證方法和發(fā)現(xiàn)方法的差別越大驗(yàn)證結(jié)果也越可靠。采用的方法多，結(jié)果也越可靠。2） 相互作用的生物學(xué)功能：有重要生物學(xué)功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。有運(yùn)氣的成分。如果從重要功能蛋白質(zhì)出發(fā)，從重要生物學(xué)現(xiàn)象出發(fā)，“運(yùn)氣”會(huì)越好。生物學(xué)功能的研究：技術(shù)成果的大小相互作用的生物學(xué)功能研究基本上可以歸為兩類：獲得功能或失去功能。獲得功能：轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得原本不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細(xì)胞有新的

21、功能。常用的方法有細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠。失去功能：抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細(xì)胞功能的喪失。常用的方法有：rna干擾使蛋白質(zhì)不表達(dá)、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細(xì)胞、基因敲除的老鼠。1、 一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)：蛋白質(zhì)相互作用的親和力是技術(shù)的基礎(chǔ)。kd=ab/ab。kd越小，親和力越好?？贵w的親和力為10-8 -10-10 m是好,10-6m是弱。1、 蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用：生化方法（co-purification提純，親和色譜法，gst pull down ,ip，wb,

22、far-western）surface plasmon resonance表面等離子體諧振、遺傳分析、酵母雙雜交、fluorescence resonance energy transfer：fret熒光共振能量轉(zhuǎn)移、2、 注釋：表面等離子體諧振 (surface plasmon resonance, spr) 生化分析儀，是基于物理光學(xué)現(xiàn)象和生物傳感技術(shù)的新型生化分析系統(tǒng)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fpet）：當(dāng)生色團(tuán)被光照時(shí)，被照射激發(fā)的分子可以通過(guò)散發(fā)能量來(lái)返回到基態(tài)1-3。光能可被生色團(tuán)在10-15秒內(nèi)吸收而在10-9秒內(nèi)在發(fā)射出來(lái)。然而，也有可能被激發(fā)分子并不發(fā)光而將能量傳遞給別的生色團(tuán)或是

23、另外的熒光素，這些熒光素可以在相同的時(shí)間量級(jí)內(nèi)發(fā)熒光，這后一種現(xiàn)象稱為fpet.應(yīng)用：是比較分子間距離與分子直徑的有效工具，廣泛用于研究各種涉及分子間距離變化的生物現(xiàn)象，可以定量測(cè)量?jī)蓚€(gè)發(fā)光基團(tuán)之間的距離，在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象、蛋白與蛋白間相互作用、核酸與蛋白間相互作用得到廣泛應(yīng)用。3、 生化方法的具體實(shí)驗(yàn)：1） gst pull down ,見ppt252） ip和coip：上網(wǎng)查3） far-western: a.不是用抗體直接與膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，而是用另一個(gè)蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用與膜上蛋白質(zhì)作用。b.直接標(biāo)記另一個(gè)蛋白質(zhì)或用抗另一個(gè)蛋白質(zhì)的抗體做western blot。c.因?yàn)槭堑鞍踪|(zhì)相互作用

24、，far-western常常會(huì)包含一步蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程。4） spr：用來(lái)監(jiān)控生物特定表面在金屬層的相互作用，通過(guò)測(cè)量這個(gè)相互作用引起的溶液濃度的變化。具體過(guò)程？blacore spr的優(yōu)點(diǎn)：不用標(biāo)記；實(shí)時(shí)測(cè)量4、 遺傳方法： 例子：有a：小量表達(dá)；有b：無(wú)表達(dá)；有c：無(wú)表達(dá) 有a和b：表達(dá)增加； 有a和c：小量表達(dá)；有b和c：無(wú)表達(dá) 有 a、b、c：高表達(dá)結(jié)論： 在a、b和c的蛋白質(zhì)復(fù)合體中，a是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；b可以和a結(jié)合促進(jìn)a的轉(zhuǎn)錄活性；c本身不能直接促進(jìn)a的活性，所以不大可能和a有直接相互作用，但能通過(guò)b的介導(dǎo)進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。2、 研究實(shí)例討論：1、 g2/m期阻斷

25、的實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法：根據(jù)dna的含量變化2、 親和層吸：對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)有特異性的結(jié)合（py蛋白）3、 質(zhì)譜鑒定蛋白4、 磷酸化蛋白質(zhì)的驗(yàn)證5、 蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的驗(yàn)證：loss of function and gain of function6、 進(jìn)一步尋找相互作用蛋白質(zhì)7、 細(xì)胞內(nèi)的定位和細(xì)胞器，與細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)相互作用8、 根據(jù)已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，提出功能模型9、 模型的驗(yàn)證10、 得到研究結(jié)論12 生化方法（biochemical approaches）1.1 共純化、共沉淀traditional co-purification (chromatography co-purifica

26、tion and co-sedimentation) 在不同基質(zhì)上進(jìn)行色譜層析1.2 蛋白質(zhì)親和層析（affinity chromatography）將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)。gst pull down：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純?cè)挼牡鞍滓匀诤系鞍椎男问奖磉_(dá)，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與gst融合的蛋白再經(jīng)過(guò)gsh的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)gst和gsh的相互作用而被吸附。當(dāng)

27、載有細(xì)胞抽提物經(jīng)過(guò)柱時(shí)，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。epitope-tag：表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原融合到目的蛋白以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以通過(guò)親和層析法來(lái)純化目的蛋白。 缺點(diǎn)：表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。以上兩種方法都要共同的缺點(diǎn)：假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證。1.3 免疫共沉淀（immunoprecipitation）免疫共

28、沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。 缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。1.4 far-western 又叫做親和印記。將page膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后顯影。 缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。3 表面等離子共振（surface plasmon resonance）該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表

29、面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)：需要專門的等離子表面共振檢測(cè)儀器。芯片比較昂貴，如果重復(fù)使用可能導(dǎo)致結(jié)果不好。4 遺傳學(xué)方法（genetic approaches）3.1 基因外抑制子基因外抑制子是通過(guò)一個(gè)基因的突變來(lái)彌補(bǔ)原有基因的突變。比如相互作用的蛋白a和b，如果a發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時(shí)b如果再發(fā)生彌補(bǔ)

30、性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么b就是a的基因外抑制子。 缺點(diǎn)：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費(fèi)時(shí)。3.2 合成致死篩選 指兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個(gè)基因單獨(dú)發(fā)生突變時(shí)則無(wú)致死效應(yīng)。用于分析兩個(gè)具有相同重要蛋白之間的相互作用。5 酵母雙雜交（two-hybrid）原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。優(yōu)點(diǎn)是是酵母細(xì)胞內(nèi)的in vivo相互作用，只需要cdn

31、a，簡(jiǎn)單，弱的相互作用也能檢測(cè)到。缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白或者有其他蛋白插足介導(dǎo)或者自身激活報(bào)告基因會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能；不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。另外還有酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾；對(duì)基因庫(kù)的要求比較高，單向1/3是in frame；蛋白質(zhì)毒性等。6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer）指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近（100埃）時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常

32、靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。 缺點(diǎn)：此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合gfp給蛋白標(biāo)記。 此外還有交聯(lián)技術(shù)（crosslinking），蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（phage display）以及生物信息學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用。2.2 酵母雙雜交2.2.1 構(gòu)建pbd-a與pad-i兩種重組表達(dá)質(zhì)粒，這樣使得待研究蛋白可融合表達(dá)gal4 dna 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和gal4激活結(jié)構(gòu)域；2.2.2 pbd-a與pad-i兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。分別設(shè)置如下對(duì)照組：pbd / pad；pbd-a / pad；pbd /

33、 pad-i；2.2.3 藍(lán)白斑法驗(yàn)證 lacz基因的表達(dá)情況。說(shuō)明: 如果蛋白a和蛋白i能夠相互作用，那么gal4 dna 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和gal4激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)相互作用，從而激活lacz報(bào)道基因的表達(dá)。如果設(shè)置的實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)出藍(lán)色克隆而對(duì)照組沒有的話基本上可證明蛋白a和蛋白i有相互作用。概述3） 研究蛋白質(zhì)相互作用的意義：細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ) 穩(wěn)定相互作用-protein complex 瞬時(shí)相互作用-enzyme-substrate蛋白質(zhì)相互作用如無(wú)相應(yīng)功能是沒有研究意義的！蛋白質(zhì)相互作用生物學(xué)功能4） 蛋白質(zhì)相互作用的親和力-一切蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)ab ab kd=ab/ab（ kd: dis

34、sociation constant ）5） 蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用1、利用抗原和抗體的相互作用western blot：變性抗原，主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。abpr1pr2：免疫共沉淀 pr1abpr2：非特異性結(jié)合染色質(zhì)沉淀：用抗體沉淀抗原得到與抗原結(jié)合的dna，用pcr鑒定dna，從而證明蛋白質(zhì)和特定dna間的相互作用2、利用已知的相互作用建立tag gst pull down：已知蛋白質(zhì)和gst融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)，即gst tag。 biotinavidin結(jié)合

35、：biotin標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過(guò)avidin結(jié)合biotin標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與biotin 標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是biotinavidin的結(jié)合是最牢靠的；缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。3、直接利用蛋白質(zhì)的相互作用 蛋白質(zhì)親和層析：用蛋白質(zhì)當(dāng)親和層析的親和基團(tuán)。要有大量的蛋白質(zhì)。 酵母雙雜交：優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)是不能得到修飾調(diào)控型的相互作用蛋白質(zhì)。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。 phage display：physically固定蛋白質(zhì)，結(jié)合phage，洗脫，擴(kuò)增phage，再結(jié)合；這樣做好幾輪。 bait蛋白質(zhì)篩表達(dá)庫(kù)：bait蛋白質(zhì)用同位素、gst、等標(biāo)記，再篩

36、庫(kù)。 蛋白質(zhì)組：這是檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的方法。不管用什么方法，只要你能得到結(jié)合的蛋白質(zhì)，理論上蛋白質(zhì)組都可以分析。但由于檢測(cè)和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多常常超出人們的辨別能力和研究能力。2） 發(fā)現(xiàn)相互作用的生物學(xué)意義相互作用的證實(shí)：不同的發(fā)現(xiàn)相互作用的技術(shù)都可以被用來(lái)驗(yàn)證相互作用的蛋白質(zhì)。相互作用的生物學(xué)功能：有重要生物學(xué)功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。3） 生物學(xué)功能的研究功能的獲得：轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得原本不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細(xì)胞有了

37、新的功能。常用技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠功能的失去：抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細(xì)胞功能的喪失。常用技術(shù)：rna干擾使蛋白質(zhì)不表達(dá)、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細(xì)胞、基因敲除的老鼠一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)5） 生化方法traditional co-purificationaffinity chromatography(gst pull down)immunoprecipitationwestern and far-western blota. gst pull down已知蛋白質(zhì)和gst融合，與細(xì)胞或組織的“

38、蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。gst tag。谷胱甘肽gst fusion proteingst（谷胱甘肽 s 轉(zhuǎn)移酶）已知蛋白有相互作用的蛋白對(duì)照gst 的結(jié)合較弱！b. 免疫共沉淀免疫沉淀：通過(guò)抗原與抗體的結(jié)合得到所要的蛋白質(zhì)免疫共沉淀：通過(guò)抗原與抗體的結(jié)合，得到與該已知蛋白有相互作用的蛋白質(zhì)優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；(2) 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； (3) 必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。c. 蛋白質(zhì)分析技術(shù)：sdspage：蛋白質(zhì)按分子大小分離。western blot：顯示特異蛋白質(zhì)的技術(shù)?；驹恚翰捎玫氖蔷郾０纺z電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)page分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（pvdf膜全面優(yōu)于nitrocellulose膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的