1、.,實驗二、酶聯(lián)免疫吸附試驗,實驗內(nèi)容： 間接法 測乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）,Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA,.,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應在一種固相載體表面聚苯乙烯微量反應板孔中進行，通過洗滌去除多余的游離反應物；然后加入酶標記的抗體或酶標記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標抗體復合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復合物（間接法）；此時加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體呈現(xiàn)顯色

2、反應。液體顯色的強弱與復合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。 該技術(shù)的特點是敏感性高，特異性強，操作簡易，結(jié)果容易觀察。,實驗原理：,.,免疫酶技術(shù)是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應性，也不影響酶的催化效能。當存在相應酶底物時，酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應的抗原或抗體是否存在及其量的多少。,實驗原理：,.,ELISA的測定方法包括：,雙抗體夾心法：檢測抗原最常用的方法,間接法：檢測抗體最常用的方法,競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體,生物素親

3、和素系統(tǒng)ELISA法：是在ELISA中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。,.,直接法,間接法,.,.,BAS-ELISA,底物,1.已知Ab包被固相,2.加待檢標本,3.加生物素標記的特異性抗體,4.加酶標記的親和素,5.加底物顯色,親和素,酶,生物素,待檢標本,biotin-avidin-system，生物素-親和素系統(tǒng) 此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。,.,材料和試劑：,1. HBsAg、包被液。 2.待檢人血清。 3.酶標記的抗HBsAb抗體。 4.HBsAb陽性對照血清、HBsAb陰性對照血清 5.洗滌液：PH7.4 0.01mol/L P

4、BS-吐溫20。 6.底物溶液：OPD-H2O2或TMD-H2O2。 7.終止液：2mol/L H2SO4。 8. 酶標反應板、移液器、恒溫箱、酶標儀,酶標板,移液器,酶標儀,.,操作步驟：,包被：將HBsAg用包被液作適當稀釋（1：100），在96孔反應板中每孔加100l，置372h后再移置4過夜。 洗滌：將96孔反應板傾去包被液，用洗滌液PBS-吐溫20加滿各孔，置3min,傾去，如此反復3次。（前兩步已完成）,.,1.已知抗原包被酶標板,2.1棄去板內(nèi)包被抗原,2.2拍干,2.3加滿洗滌液（重復三次）,.,3.加樣,（1）陽性對照：第1、2孔加HBsAb陽性對照血清50l； （2）陰性對

5、照：第3、4孔加HBsAb陰性對照血清50l； （3）空白對照：第5孔加生理鹽水100l； （4）余下各孔加待檢血清50l。,.,加酶標記的抗HBsAb抗體：除空白對照外各孔50l，充分混勻。將即時帖覆蓋于反應板上，37孵育30min。 棄去反應孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、再拍干，重復洗滌5 次。(操作同2) 顯色：各孔（包括空白對照）加底物A液50l（1滴），底物B液50l（1滴），置37避光溫育15min。 終止反應：各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）。 比色：將反應板以酶標儀450nm處用空白孔調(diào)零，測各孔OD值。,.,6.顯色,各孔（包括空白對照）加底

6、物A液50l（1滴），底物B液50l（1滴），置37避光溫育15min,7.終止反應,各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）,.,OPD（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色反應,終止前 終止后,TMB四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用后的顯色反應,終止前 終止后,.,結(jié)果判斷：,計算：判斷值陰性對照平均OD值2.1 結(jié)果判斷：待測樣品孔OD值大于或等于判斷值為陽性； 小于判斷值為陰性。 注：陰性對照OD值小于0.05按0.05計算， 大于0.05按實際OD值計算判斷值。,.,注意事項：,試劑及待測標本使用前應平衡至室溫，并將試劑混勻，棄去12滴垂直滴加； 嚴格按照操作程序依次加樣，以保證實驗結(jié)果準確性；

7、 應盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準確。,.,思考題：,1.免疫標記技術(shù)有哪些？各有何特點？。 2.ELISA操作過程中應注意哪些問題？,.,THANKS,.,2009級醫(yī)療專科復習題,一、名詞解釋2.5*8,共20分 免疫、抗原、抗原決定基(表位)、異嗜性抗原、白細胞分化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗體、免疫球蛋白、單（多）克隆抗體、補體、經(jīng)典途徑、旁路途徑、細胞因子、IL、IFN、CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式識別受體（PRR）、抗原提呈細胞（ APC）、適應性免疫應答、免疫耐受、免疫調(diào)節(jié)、超敏反應、人工主動免疫、人工被動免疫、計劃免疫 注：紅色標記

8、為要求掌握英文,.,二、填空題（0.540=20分） 三、單項選擇題（130=30分）,.,免疫的三大功能及其生理和病理表現(xiàn)。 影響抗原免疫原性的因素。 醫(yī)學上有哪些重要的抗原。 簡述Ig的基本結(jié)構(gòu)。 免疫球蛋白有哪些主要的生物學功能？ 簡述補體的組成。 補體活化三條途徑的比較。 補體有哪些主要生物學功能？ 細胞因子有哪些共同的特性？ 細胞因子的主要生物學作用。,簡答52=10,.,簡述MHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。 HLA的主要生物學功能。 T細胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。 B細胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。 巨噬細胞的主要生物學功能。 簡述免疫應答的基本過程。 抗原的提呈途徑（兩條）。 固有免疫的組成及其與適應性免疫的關(guān)系。 兩種人工免